于志鵬，張霜，趙文竹，*，張倩，沈俊彤，王瑜，霍倩倩，勵(lì)建榮，*，劉靜波

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧錦州121013；2.吉林大學(xué)營(yíng)養(yǎng)與功能食品研究室，吉林長(zhǎng)春130062）

基于旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化膠原蛋白ACE抑制肽制備工藝

于志鵬1，張霜1，趙文竹1，*，張倩1，沈俊彤1，王瑜1，霍倩倩1，勵(lì)建榮1，*，劉靜波2

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧錦州121013；2.吉林大學(xué)營(yíng)養(yǎng)與功能食品研究室，吉林長(zhǎng)春130062）

采用ProtamexR蛋白酶水解魚(yú)膠原蛋白源制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制肽，并采用pH-stat法測(cè)定水解度，對(duì)影響水解效果的pH值、溫度、底物濃度和加酶量4個(gè)因素進(jìn)行考察，并進(jìn)行三元二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)活性肽的ACE抑制活性和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果表明在底物濃度11.8%，pH 8.7，加酶量5.4%和酶解溫度53.6℃條件下，酶解1h所得的魚(yú)皮膠原蛋白水解度為16.6%，經(jīng)高效液相測(cè)定魚(yú)皮ACE抑制活性為45%，經(jīng)圓二色譜分析魚(yú)膠原蛋白ACE抑制肽主要以無(wú)規(guī)卷曲形式存在。

魚(yú)膠原蛋白；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶；活性肽；二級(jí)結(jié)構(gòu)

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin-converting Enzyme，ACE）對(duì)血壓具有重要的調(diào)節(jié)作用[1]，一方面它催化無(wú)活性的血管緊張素Ⅰ（AngⅠ）轉(zhuǎn)化成具有升高血壓作用的血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）；另一方面能夠使具有降壓作用的舒緩激肽失活[2-3]。來(lái)源于食物蛋白的ACE抑制肽通過(guò)調(diào)節(jié)ACE活性從而起到降血壓作用，同時(shí)可最大限度避免降血壓藥物產(chǎn)生毒副作用，因此也越來(lái)越受到廣泛關(guān)注。近年來(lái)，大量降壓肽/ ACE抑制肽陸續(xù)在海洋生物中發(fā)現(xiàn)[4-5]，如金槍魚(yú)、鰹魚(yú)、蝦類、藻類等。魚(yú)皮作為加工中的下腳料，其中的膠原蛋白資源被大大浪費(fèi)。本研究以魚(yú)皮膠原蛋白為原料制備ACE抑制肽，通過(guò)單因素試驗(yàn)結(jié)合三元二次正交組合設(shè)計(jì)對(duì)魚(yú)皮膠原蛋白制備ACE抑制肽的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在拓寬ACE活性肽的原料來(lái)源并提高水產(chǎn)加工的附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚(yú)膠原蛋白：河北百味生物科技有限公司；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）、卡托普利、馬尿酰組氨酰亮氨酸（HHL）、馬尿酸：美國(guó)Sigma公司；ProtamexR蛋白酶（活力1.5 AU-N/g）：諾維信公司；乙腈、甲醇、三氟乙酸（色譜純）：美國(guó)Thermo Fisher科技公司。

高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫科技公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇大地自動(dòng)化儀器廠；ZD-2雷磁電位滴定儀：上海雷磁儀器廠；JJ-1精密增力電動(dòng)攪拌器：江蘇省金壇市自動(dòng)化儀器廠；AG204型電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；RE 52-86A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；KQ-100DB臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗器：成都一科儀器設(shè)備有限公司；IR Prestige-21傅里葉紅外光譜：島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司；Jasco J-810圓二色譜儀：日本分光（JASCO）株式會(huì)社。

1.2 方法

1.2.1 魚(yú)膠原蛋白源的酶解工藝

取一定量魚(yú)膠原蛋白加蒸餾水并加熱使其溶解制成相應(yīng)質(zhì)量濃度的膠原蛋白溶液。利用ProtamexR蛋白酶對(duì)魚(yú)膠原蛋白進(jìn)行水解，水解時(shí)置于水浴鍋中并用電動(dòng)攪拌器不斷攪拌，到達(dá)設(shè)定反應(yīng)時(shí)間后，提高溫度至90℃終止水解反應(yīng)。酶解液經(jīng)冷凍離心取上清液進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

以水解度為指標(biāo)，經(jīng)單因素試驗(yàn)初步考察酶解溫度、加酶量、底物濃度和pH值4個(gè)因素對(duì)ProtamexR蛋白酶水解魚(yú)膠原蛋白制備ACE抑制活性肽的水解度的影響。

將魚(yú)皮膠原蛋白水溶液調(diào)整pH值分別在7、8、9、10和11條件下，并在底物濃度5%、加酶量5%和50℃情況下酶解解1 h，研究pH值對(duì)魚(yú)膠原蛋白水解效果的影響。

設(shè)定魚(yú)膠原蛋白水解溫度分別為40、50、60、70、80℃并在底物濃度5%、加酶量5%和pH10情況下酶解解1 h，研究溫度對(duì)魚(yú)膠原蛋白水解效果的影響。

將加酶量分別設(shè)定為1%、3%、5%、7%、9%，并在pH10、底物濃度5%和50℃情況下酶解1 h，研究pH值對(duì)魚(yú)膠原蛋白水解效果的影響。

將魚(yú)膠原蛋白底物濃度分別配置為1%、5%、10%、15%、20%，并在pH 10、加酶量5%和50℃情況下酶解解1 h，研究pH值對(duì)魚(yú)膠原蛋白水解效果的影響。

1.2.3 酶解魚(yú)膠原蛋白制備活性肽正交組合設(shè)計(jì)模型

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行三元二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化，分別考察溫度、加酶量和pH值及其兩兩因素交互作用和因素二次項(xiàng)對(duì)水解效果的影響，因素水平見(jiàn)表1。

表1 因素編碼表Table1 Experiment factorscoding table

1.2.4 蛋白質(zhì)水解度（DH）的測(cè)定

水解度測(cè)定采用pH-stat法[6]。

1.2.5 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性的測(cè)定

采用高效液相色譜法，在Wu等[7]方法基礎(chǔ)上進(jìn)行修改，取30μLHHL底物液，加入10μL抑制劑混合均勻，在（37±0.5）℃恒溫水浴中預(yù)熱3min～5min，然后加入20μLACE（2.0 U/mg蛋白）液充分混合，37℃保溫30min后，再加入60μL的1mol/LHCl終止反應(yīng)，得到反應(yīng)液，同時(shí)用10μL pH為8.3的硼酸緩沖液替代抑制劑溶液作為空白對(duì)照組[8]。該反應(yīng)液用0.45μm濾膜過(guò)濾后直接用HPLC系統(tǒng)進(jìn)行分析。色譜條件：InertsilWP300 C18色譜柱（5μm，125mm× 4.0mm），柱溫25℃，流速0.5mL/min，流動(dòng)相乙腈/水（0.05%TFA）比例為25/75等梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)228 nm。

ACE抑制活性計(jì)算公式如下：

式中：M為空白對(duì)照組中馬尿酸的峰面積；N為添加抑制劑組中馬尿酸的峰面積。

配制不同濃度的魚(yú)膠原蛋白源ACE抑制肽的水溶液，按照血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性測(cè)定方法測(cè)定進(jìn)而獲得不同濃度樣品對(duì)ACE活性的抑制率，以抑制率對(duì)魚(yú)膠原蛋白ACE抑制肽濃度（mg/mL）作圖，根據(jù)趨勢(shì)線獲得抑制率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的魚(yú)膠原蛋白源ACE抑制肽的濃度，即為半抑制濃度（IC50）。

1.2.6 圓二色譜分析

魚(yú)膠原蛋白ACE抑制肽的圓二色譜分析，具體步驟如下：100mmo1/L的硼酸鹽緩沖液（pH 8.3）配制魚(yú)膠原蛋白ACE抑制肽溶液，使用厚度為0.2mm的石英樣品池，波長(zhǎng)范圍設(shè)置為190nm～250nm，活性肽濃度為20mg/mL，檢測(cè)溫度為25℃，掃描速度100 nm/min，每個(gè)樣品重復(fù)掃描3次，并以硼酸鹽緩沖液為空白樣品進(jìn)行對(duì)照。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Origin對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，樣品測(cè)定結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 pH值對(duì)水解效果的影響

pH值對(duì)明膠水解度的影響如圖1所示。

圖1 pH值對(duì)水解效果的影響Fig.1 Influenceof pH on the degreeofhydrolysis

從圖1中可以看出，當(dāng)pH值小于10時(shí)，隨著pH值的增大，明膠水解度逐漸增大；當(dāng)pH值等于10時(shí)，酶活力較高，水解度最好；當(dāng)pH值大于10時(shí)，隨著pH值的增大，明膠水解度開(kāi)始下降，因此試驗(yàn)應(yīng)在pH值等于10時(shí)研究后續(xù)的單因素試驗(yàn)。

2.1.2 溫度對(duì)水解效果的影響

溫度對(duì)明膠水解度的影響如圖2所示。

圖2 溫度對(duì)水解效果的影響Fig.2 Influenceof tem peratureon the degreeof hydrolysis

從圖2中可以看出，溫度在40℃～50℃時(shí)，明膠水解液的水解度隨溫度升高而升高；50℃時(shí)水解度最好，隨著溫度的升高水解度逐漸下降，這是由于一方面當(dāng)溫度升高，酶活性增強(qiáng)、反應(yīng)速度加快；另一方面當(dāng)溫度持續(xù)升高時(shí)，酶活性減弱、酶的穩(wěn)定性降低。因此本試驗(yàn)應(yīng)該在溫度為50℃時(shí)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.3 底物濃度對(duì)水解效果的影響

底物濃度對(duì)明膠水解度的影響如圖3所示。

圖3 底物濃度對(duì)水解效果的影響Fig.3 Influenceof substrate concentration on thedegreeof hydrolysis

從圖中可以看出，當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?%時(shí)，隨著底物濃度的增加，明膠水解度逐漸降低；當(dāng)?shù)孜餄舛扔?%增加至15%時(shí)，由于底物濃度的增加，膠原蛋白的水解效果有所降低；當(dāng)?shù)孜餄舛壤^續(xù)增加至20%時(shí)，酶促反應(yīng)開(kāi)始明顯減慢。綜合考慮選擇底物濃度在15%進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

2.1.4 加酶量對(duì)水解效果的影響

加酶量對(duì)明膠水解度的影響如圖4所示。

圖4 加酶量對(duì)水解效果的影響Fig.4 Influenceof enzym eaddition on thedegreeof hydrolysis

從圖4中可以看出，當(dāng)加酶量在小于5%時(shí)，隨著加酶量的增加，明膠水解度逐漸增大；當(dāng)加酶量大于5%時(shí)，明膠水解度緩慢增加，由于考慮到復(fù)合蛋白酶的利用率，減少酶的用量，降低生產(chǎn)成本。綜合考慮加酶量應(yīng)在5%。

2.2 三元二次正交組合設(shè)計(jì)模型的建立

在單因素基礎(chǔ)上進(jìn)行了正交組合設(shè)計(jì)，其結(jié)果見(jiàn)表2，并進(jìn)行了回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)、回歸方程檢驗(yàn)和失擬檢驗(yàn)。

表2 三元二次回歸正交試驗(yàn)結(jié)果Table2 Resu ltsof quad ratic regression orthogonalcombination designed

F回=（S回/f回）/（SR/fR）=6.83＞F0.01（5，11）=5.32，表明方程在0.01水平下顯著，且滿足

Flf＜F0.25（9，2）=3.37，方程不失擬，可見(jiàn)回歸方程擬合的很好。

根據(jù)西爾維斯特不等式判別方程的極值[9]，利用求駐點(diǎn)方法求得當(dāng)水解度取得極值時(shí)，x1=1.82；x2= 0.72；x3=0.72，將因素編碼表代入方程中，即在底物濃度為11.8%，酶解pH值為8.7，加酶量5.4%和酶解溫度53.6℃條件下，酶解1 h所得的魚(yú)皮膠原蛋白水解度為17%，并經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，此條件下對(duì)應(yīng)的膠原蛋白水解度為16.6%與回歸方程優(yōu)化結(jié)果相近。

2.3 魚(yú)膠原蛋白肽ACE抑制活性及圓二色譜分析

利用高效液相色譜法對(duì)魚(yú)膠原蛋白ACE抑制肽的體外活性測(cè)定，結(jié)果表明其抑制率為45%，具有作為ACE抑制肽開(kāi)發(fā)的潛力。通過(guò)圓二色譜分析魚(yú)膠原蛋白ACE抑制肽的空間結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明主要存在無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，而未形成穩(wěn)定的α螺旋、β轉(zhuǎn)角和β折疊結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論

本文以魚(yú)膠原蛋白為原料，選用ProtamexR蛋白酶進(jìn)行酶解并獲得最優(yōu)酶解參數(shù)，即在底物濃度為11.8%，酶解pH值為8.7，加酶量5.4%和酶解溫度53.6℃條件下，酶解1 h，利用高效液相色譜法對(duì)魚(yú)膠原蛋白肽的ACE抑制活性進(jìn)行測(cè)定結(jié)果表明其抑制率達(dá)到45%，且圓二色譜結(jié)果表明活性肽溶液以無(wú)規(guī)卷曲空間構(gòu)型為主。

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Enzyme Hydrolysis Preparation M odel of Collagen-derived ACE Inhibitory Peptides Based on Quadratic General Rotation Design

YU Zhi-peng1，ZHANGShuang1，ZHAOWen-zhu1，*，ZHANGQian1，SHEN Jun-tong1，WANGYu1，HUOQian-qian1，LIJian-rong1，*，LIU Jing-bo2
（1.Collegeof Food Scienceand Engineering，BohaiUniversity，National&Local JointEngineering Research Centerof Storage Processingand Safety Control Technology for Fresh Agriculturaland Aquatic Products，Jinzhou 121013，Liaoning，China；2.Lab ofNutrition and Functional Food，Jilin University，Changchun 130062，Jilin，China）

Fish-derived collagenwashydrolyzed by protamexRprotease andmeasured by the degree ofhydrolysis.Thehydrolysismodelofpeptides from fish-derived collagen wasestablished through quadratic general rotation design followed single factorexperiment，subsequently ACE inhibitory activity and secondary structure of fish collagen-derived peptideswasmeasured.The resultsshowed that the equation for theoptimal regression equation had amaximal value according to regression coefficient test，regression equation，and the lack of fit test.The optimal details ofenzymatic hydrolysiswas followed：substrate concentration 11.8%，enzymatic hydrolysis pH value 8.7，the amountofenzyme 5.4%and hydrolysis temperature 53.6℃，and hydrolysis degree of fish-derived collagen was 16.6%in one hour.In vitro ACE inhibitory activity of bioactive peptides from fish-derived collagen was performed by high performance liquid chromatography，and the value ofactivity against ACE was 45%.In addition，secondary structure of fish collagen-derived ACE inhibitory peptide was random coil.

fish-derived collagen；angiotensin convertingenzyme（ACE）；bioactivepeptide；secondary structure

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.07.013

2016-08-03

2016-09-07

國(guó)家科技支撐課題（2012BAD00B03）；遼寧省科學(xué)事業(yè)公益研究基金項(xiàng)目（2016004004）；渤海大學(xué)博士啟動(dòng)項(xiàng)目（0515bs079）；遼寧省科技攻關(guān)項(xiàng)目（2015103020）

于志鵬（1984—），男（漢），講師，博士，研究方向：蛋白質(zhì)及活性肽的功能研究與產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。

*通信作者：趙文竹（1986—），女，講師，博士，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與功能食品；勵(lì)建榮（1964—），男，教授，博士，研究方向：水產(chǎn)品加工。