賈小娥 朱 偉 樊 燕 謝 偉 姜樹原 石 蕊 劉曉蕾 許文強 張顏波 邵 國，3*

(1.包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014060； 2.泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 泰安 271000；3.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院，北京 100053)

斑馬魚組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶在巨噬細胞炎癥遷移中的作用研究*

賈小娥1#朱 偉1#樊 燕1謝 偉1姜樹原1石 蕊1劉曉蕾1許文強1張顏波2，3*邵 國1，3*

(1.包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014060； 2.泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 泰安 271000；3.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院，北京 100053)

目的 研究組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶是否參與了巨噬細胞炎癥遷移的過程。方法 利用斑馬魚尾巴創(chuàng)傷后巨噬細胞向炎癥部位遷移的模型，采用全胚胎原位雜交的方法檢測巨噬細胞遷移前后58個斑馬魚組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的表達變化情況。結(jié)果 斑馬魚尾巴創(chuàng)傷后，巨噬細胞開始向炎癥部位遷移，并在尾巴切除后6 h聚集在尾部的巨噬細胞達到最多。原位雜交結(jié)果顯示在尾巴創(chuàng)傷后巨噬細胞遷移6 h后，有3個斑馬魚組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的表達水平有變化。結(jié)論 斑馬魚組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶可能參與了巨噬細胞炎癥遷移的過程。

組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶；斑馬魚；巨噬細胞；炎癥遷移

組蛋白甲基化修飾是表觀遺傳修飾中重要的研究方向，參與了染色質(zhì)的形成、基因組印記、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種重要生理活動。組蛋白甲基化修飾主要由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(Histone methyltransferase, HMTs)負責(zé)，一般發(fā)生在組蛋白賴氨酸和精氨酸殘基上。眾多文獻和數(shù)據(jù)表明，組蛋白甲基化修飾和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的異常表達與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，如PRMT6在結(jié)腸癌中扮演著原癌基因的作用[1]；SETD2和EZH2與慢性淋巴細胞白血病的發(fā)病有密切聯(lián)系并在慢性淋巴細胞白血病患者中有高表達[2-3]；G9a在多種癌癥中有高表達并與低預(yù)后相關(guān)[4]。而靶向組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、改變異常的組蛋白甲基化狀態(tài)成為腫瘤治療的新靶點和策略[5-6]。巨噬細胞是多功能的免疫細胞，其中巨噬細胞向炎癥部位的遷移是機體執(zhí)行免疫功能的重要環(huán)節(jié)，該遷移機制的失調(diào)是許多炎性疾病、自身免疫性疾病以及腫瘤轉(zhuǎn)移等疾病的共同原因之一。已有研究揭示了巨噬細胞和炎癥的調(diào)控機制，通過影響炎性因子的生成和釋放激活炎癥復(fù)合體和巨噬細胞。而組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶是否參與了巨噬細胞炎癥遷移的過程，目前尚無研究報道。為此本研究使用斑馬魚作為模式生物，通過斑馬魚尾部創(chuàng)傷造成炎癥傷口，建立巨噬細胞向炎癥部位遷移的模型，研究斑馬魚組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶在巨噬細胞遷移前后是否有表達變化，探究組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶是否參與了巨噬細胞遷移調(diào)控。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 Tubigen系野生型斑馬魚和轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(zlyz:EGFP)由包頭醫(yī)學(xué)院斑馬魚模式動物平臺保種并飼養(yǎng)，14 h光照/10 h黑暗交替循環(huán)，恒溫28. 5±0. 5 ℃，pH7.2 ～7.5。

1.1.2 質(zhì)粒 斑馬魚58個組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的探針質(zhì)粒由Dr. Xu Pengfei惠贈。

1.1.3 主要試劑 Takara 限制性內(nèi)切酶：EcoRI, SalI。試劑盒:質(zhì)粒小提試劑盒，普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒，T3 mMESSAGE mMACHINE Kit，T7 mMESSAGE mMACHINE Kit, NucAway Spin Columns(Ambion)純化試劑盒，RNA地高辛標(biāo)記試劑盒(DIG RNA Labeling Kit，Roche)，顯色試劑盒BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Substrate(Vector laboratories)。

1.2 方法

1.2.1 對斑馬魚胚胎尾巴進行切割造成損傷 斑馬魚胚胎和Tg(zlyz:EGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎受精后60 h(60 hour post fertilization, 60 hpf)置于含0.1 mg/ml tricaine麻醉劑的培養(yǎng)液中，采用無菌手術(shù)刀片切割掉斑馬魚胚胎的尾巴，造成人為的急性創(chuàng)傷(不損及循環(huán))，收集切割0 h(0 hours-post-tail-transection, 6hptt)和6 h后(6 hours-post-tail-transection, 6hptt)的胚胎甲醛固定或熒光顯微鏡下觀測巨噬細胞的遷移。

1.2.2 地高辛標(biāo)記的反義mRNA探針的制備 合成探針時，以限制性內(nèi)切酶線性化的組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶的質(zhì)粒為模板，用SP6 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄得到反義探針。探針體外轉(zhuǎn)錄采用RNA地高辛標(biāo)記試劑盒(DIG/ Fluorescein RNA Labeling Kit，Roche)，步驟參照試劑盒說明書。合成的探針用 NucAway Spin Columns(Ambion)進行純化，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，-80 ℃保存。

1.2.3 斑馬魚整體胚胎原位雜交 收集切割0 hptt和6 hptt的胚胎，4%甲醛4 ℃固定過夜，甲醇梯度脫水，置于-20 ℃100%甲醇溶液備用。甲醇梯度復(fù)水，蛋白酶K消化胚胎，用PBST洗去消化液后。68 ℃雜交爐中預(yù)雜交1 h，然后加入相應(yīng)的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的反義RNA探針雜交過夜。雜交后第2 d回收探針并加入SSCT梯度清洗胚胎，加入anti-Dig-AP抗體與反義探針4 ℃結(jié)合過夜。雜交后第3 d用PBST洗去多余抗體，加入顯色試劑 BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Substrate(Vector laboratories)溶液，避光室溫輕搖染色，觀測顯色情況。染色結(jié)束后，PBST洗凈染液，在體視顯微鏡下(Nikon SMZ18)觀察記錄結(jié)果后并拍照。

1.2.4 熒光顯微鏡拍攝巨噬細胞的遷移 將切尾巴0 hptt和6 hptt的斑馬魚胚胎放置于含0.1 mg/ml tricaine麻醉劑的胚胎培養(yǎng)液中，使用Nikon SMZ18熒光顯微鏡對胚胎巨噬細胞的遷移進行觀察和拍照。

2 實驗結(jié)果

2.1 切尾巴引起組織炎癥時巨噬細胞的遷移行為

當(dāng)用刀片造成尾巴創(chuàng)傷后，引起組織炎癥反應(yīng)，而巨噬細胞作為先天免疫細胞迅速地向傷口遷移。使用金屬蛋白酶mmp13特異性的標(biāo)記單核巨噬細胞，如圖Fig 1A-D所示，在切尾巴0 hptt時，巨噬細胞主要集中在循環(huán)中，尾巴切口處很少有單核巨噬細胞；而在切尾巴6 hptt后，可見尾巴切口處聚集大量單核巨噬細胞。為了進一步說明巨噬細胞在炎癥發(fā)生時向傷口遷移，我們使用了轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(zlyz:EGFP)，該轉(zhuǎn)基因系中巨噬細胞特異表達基因lyz的啟動子驅(qū)動綠色熒光蛋白的表達，因此綠色熒光蛋白能夠?qū)崟r特異的標(biāo)記巨噬細胞。如圖1所示，在切尾巴0 hptt時，綠色的巨噬細胞主要集中在循環(huán)中，尾巴切口處很少有單核巨噬細胞；而在切尾巴6 hptt后，可見尾巴切口處聚集大量綠色單核巨噬細胞。由上述實驗說明，巨噬細胞在尾巴創(chuàng)傷后后6 hptt向炎癥傷口處遷移。

圖1 尾巴創(chuàng)傷后炎癥時巨噬細胞的遷移行為

A. 尾巴創(chuàng)傷后0 hptt時金屬蛋白酶mmp13的原位雜交結(jié)果；B. 尾巴創(chuàng)傷后6 hptt時金屬蛋白酶mmp13的原位雜交結(jié)果；C. A圖的局部放大圖；D. B圖的局部放大圖；E. 尾巴創(chuàng)傷后0 hptt時轉(zhuǎn)基因系Tg(zlyz:EGFP)巨噬細胞的熒光圖片；F. 尾巴創(chuàng)傷后6 hptt時轉(zhuǎn)基因系Tg(zlyz:EGFP)巨噬細胞的熒光圖片

2.2 斑馬魚組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶在巨噬細胞遷移中的作用

我們使用原位雜交技術(shù)分別檢測了58個組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶在尾巴創(chuàng)傷后巨噬細胞遷移前(0 hptt)和巨噬細胞遷移后(6 hptt)的表達變化情況。如圖2～7所示，大部分組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶在巨噬細胞遷移前后(0 hptt和6 hptt)的表達水平?jīng)]有明顯變化。其中ehmt1a在中后腦邊界處有微弱的表達水平減弱；prdm8a在后腦處有表達上升；而prdm13在后腦處表達水平有減弱。

圖2 尾巴創(chuàng)傷后巨噬細胞0 hptt和6 hptt組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶家族I的表達變化

圖3 尾巴創(chuàng)傷后巨噬細胞0 hptt和6 hptt組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶家族II、III、IV的表達變化

圖4 尾巴創(chuàng)傷后巨噬細胞遷移前和遷移后組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶家族V的表達變化

圖5 尾巴創(chuàng)傷后巨噬細胞0 hptt和6 hptt組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶家族VI、VII、VIII的表達變化

圖6 尾巴創(chuàng)傷后巨噬細胞0 hptt和6 hptt組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶家族IX的表達變化

圖7 尾巴創(chuàng)傷后巨噬細胞0 hptt和6 hptt組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶家族X的表達變化

SubfamilyGenenameDescriptionGenBankAccessionNumberClosestHumanHomologIehmt2euchromatichistonelysineN-methyltransferase2DQ840136EHMT2Iehmt1beuchromatichistonemethyltransferase1bDQ355788,DQ840137EHMT1Iehmt1aeuchromatichistonemethyltransferase1aDQ840138EHMT1Isuv39h1bsuppressorofvariegation3-9homolog1b(Drosophila)DQ840139SUV39H1Isuv39h1asuppressorofvariegation3-9homolog1a(Drosophila)DQ840140SUV39H1Isetdb2SETdomain,bifurcated2DQ358104SETDB2Isetdb1bSETdomain,bifurcated1bDQ358103,DQ840141SETDB1Isetdb1aSETdomain,bifurcated1aDQ840142SETDB1IIsetmarSETdomainandmarinertransposasefusiongeneDQ840143SETMARIIIash1lash1(absent,small,orhomeotic)-like(Drosophila)DQ840144ASH1LIIIsetd2SETdomaincontaining2DQ343298,DQ840145SETD2IIInsd1bnuclearreceptorbindingSETdomainprotein1bDQ840146NSD1IIInsd1anuclearreceptorbindingSETdomainprotein1aDQ840147NSD1IIIwhsc1Wolf-Hirschhornsyndromecandidate1DQ358102,DQ840148WHSC1IIIwhsc1l1Wolf-Hirschhornsyndromecandidate1-like1DQ840149WHSC1L1IVezh2enhancerofzestehomolog2(Drosophila)DQ840150EZH2IVezh1enhancerofzestehomolog1(Drosophila)DQ840151EZH1Vmll2myeloid/lymphoidormixed-lineageleukemia2DQ840152MLL2Vmll3amyeloid/lymphoidormixed-lineageleukemia3aDQ840153MLL3Vmll3bmyeloid/lymphoidormixed-lineageleukemia3bDQ840154MLL3Vmll4bmyeloid/lymphoidormixed-lineageleukemia4bDQ840155MLL4Vmll4amyeloid/lymphoidormixed-lineageleukemia4aDQ840156MLL4Vmllmyeloid/lymphoidormixed-lineageleukemia(trithoraxhomolog,Drosophila)DQ355790,DQ355791,DQ840157MLLVsetd1aSETdomaincontaining1ADQ355789,DQ851808SETD1AVsetd1baSETdomaincontaining1BaDQ851809SETD1BVsetd1bbSETdomaincontaining1BbDQ851810SETD1BVIsetd8bSETdomaincontaining8bDQ851825SETD8VIsetd8aSETdomaincontaining8aDQ343297,DQ851826SETD8VIIsetd7SETdomaincontaining7DQ851811SETD7VIIIsetd5SETdomaincontaining5DQ851812SETD5VIIImll5myeloid/lymphoidormixed-lineageleukemia5(trithoraxhomolog,Drosophila)DQ851813MLL5IXsuv420h1suppressorofvariegation4-20homolog1(Drosophila)DQ851814SUV420H1IXsuv420h2suppressorofvariegation4-20homolog2(Drosophila)DQ851815SUV420H2IXsetd6SETdomaincontaining6DQ851816SETD6IXsmyd5SETandMYNDdomaincontaining5DQ851817SMYD5IXsmyd4SETandMYNDdomaincontaining4DQ851818SMYD4IXsmyd1bSETandMYNDdomaincontaining1bDQ851819SMYD1IXsmyd1aSETandMYNDdomaincontaining1aDQ851820SMYD1IXsmyd3SETandMYNDdomaincontaining3DQ851821SMYD3IXsmyd2bSETandMYNDdomaincontaining2bDQ851822SMYD2IXsmyd2aSETandMYNDdomaincontaining2aDQ851823SMYD2Xprdm16PRdomaincontaining16DQ851827PRDM16Xprdm3PRdomaincontaining3DQ851828PRDM3Xprdm5PRdomaincontaining5DQ851829,EU258933PRDM5Xprdm2PRdomaincontaining2DQ851830PRDM2Xprdm8bPRdomaincontaining8bDQ851833PRDM8Xprdm8aPRdomaincontaining8aDQ851834PRDM8Xprdm13PRdomaincontaining13DQ851835PRDM13Xprdm9PRdomaincontaining9DQ851831PRDM7,PRDM9Xprdm11PRdomaincontaining11DQ851832PRDM11Xprdm12PRdomaincontaining12DQ851836PRDM12Xprdm6PRdomaincontaining6DQ851837,EU258934PRDM6Xprdm14PRdomaincontaining14DQ851838PRDM14Xprdm1aPRdomaincontaining1aDQ851839PRDM1Xprdm1bPRdomaincontaining1bDQ851840PRDM1Xprdm1cPRdomaincontaining1cDQ851841,EU258932PRDM1Xprdm15PRdomaincontaining15DQ851842PRDM15Xprdm4PRdomaincontaining4DQ851843PRDM4

2.3 斑馬魚組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶

斑馬魚共有58個組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(見表1)。斑馬魚組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶可分為10個亞家族，由于在脊椎動物中存在基因組的復(fù)制拷貝過程，在斑馬魚中有些組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶有兩個拷貝，如人類組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EHMT1在斑馬魚中有兩個相應(yīng)的同源基因ehmt1a和ehmt1b;人類組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SUV39H1在斑馬魚中有兩個相應(yīng)的同源基因suv39h1a和suv39h1b。

3 討 論

斑馬魚尾巴創(chuàng)傷后形成炎癥反應(yīng)，巨噬細胞作為先天性免疫重要的免疫細胞，向炎癥部位大量遷移。如圖1所示，使用金屬蛋白酶mmp13標(biāo)記巨噬細胞，在尾巴創(chuàng)傷后6 hptt時明顯可見巨噬細胞向炎癥傷口處遷移聚集；轉(zhuǎn)基因系Tg(zlyz:EGFP)標(biāo)記巨噬細胞，在尾巴創(chuàng)傷后6 hptt時明顯可見綠色的巨噬細胞向炎癥傷口處遷移聚集，說明本研究中斑馬魚尾巴創(chuàng)傷后巨噬細胞遷移模型是可行的、可操作的。隨后我們利用斑馬魚尾巴創(chuàng)傷引起巨噬細胞遷移的模型，檢測了58個斑馬魚組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶基因在巨噬細胞遷移前后的表達變化。結(jié)果顯示有3個組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶基因(ehmt1a、prdm8a、prdm13)在巨噬細胞遷移前后有變化(見圖2～7所示)。這一結(jié)果也印證了近年來組蛋白甲基化修飾可能和炎癥免疫反應(yīng)有關(guān)[7-10]，如組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SMYD2通過抑制免疫因子的生成和釋放負向調(diào)節(jié)巨噬細胞的功能和活化[9]；EZH2通過組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶調(diào)節(jié)NK細胞的分化和功能[10]。然而我們僅找到3個表達水平有變化的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶。目前研究顯示調(diào)節(jié)巨噬細胞遷移的機制多是快速的免疫因子釋放和JNK、AKT和ERK等磷酸化變化[11-12]。因此僅有3個表達水平變化的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，這一結(jié)果可能是由于巨噬細胞的遷移過程迅速，而組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶所調(diào)控的表觀遺傳學(xué)變化相對速度較慢、需要更長的時間，因而在我們的研究中沒有明顯的變化。而有微弱變化的三個組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶ehmt1a、prdm8a、prdm13，其如何變化以及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還需要后續(xù)實驗的進一步驗證和探討。

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The study of zebrafish histone methyltransferase functions in macrophages inflammatory migration

JIA Xiao-e1#ZHU Wei1#FAN-Yan1XIE Wei1JIANG Shu-yuan1SHI Rui1LIU Xiao-lei1XU Wen-qiang1ZHANG Yan-bo2，3*SHAO Guo1，3*

(1. Baotou Medical College, Baotou, Inner Mongolia Autonomous Region, 014060, China; 2. Department of Neurology，Affiliated Hospital of Taishan Medical College. Taian 271000,China; 3. Xuanwu Hospital, Capital Medical University, Beijing, 100053，China)

Objective:The aim of this study was to explore whether histone methyltransferases (HMTs) involve in the inflammatory process of macrophages migration.Methods: We detected the expression levels of the zebrafish 58 histone methyltransferases before or post macrophages migration by whole-mount in situ hybridization (WISH), using the model of macrophages migration in response to the tail wound.Results: We show that macrophages migrate rapidly to the site of acute injury induced by tail transection, and at 6 hours-post-tail-transection (6 hptt) the number of macrophages that aggregate in the wound reaches a maximum.The expression level of three histone methyltransferases had changed slightly at 6 hours-post-tail-transection.Conclusion: Some histone methyltransferases may play an essential role in macrophages migration in response to inflammation injury in zebrafish.

histone methyltransferases (HMTs); zebrafish; macrophages; migration

國家自然科學(xué)基金項目(81060212,81160244,81360316,81460283,81550038，81660307，81660204)；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金(2014MS0810，2015BS0801，2015BS0807，2016MS (LH)0307)；包頭醫(yī)學(xué)院博士科研啟動基金(BSJJ201632，BSJJ201623，BSJJ201617)；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究項目(NJZY16207)；泰山醫(yī)學(xué)院高層次培育課題(2016GCC02)

賈小娥(1984—)，女，內(nèi)蒙古包頭市人，講師，博士，主要研究方向發(fā)育生物學(xué)。

朱偉(1984—)，男，山東萊蕪人，碩士，包頭醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，主要研究方向神經(jīng)生物學(xué)。

R392

A

1004-7115(2017)02-126-05

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.02.002

2016-11-12)

# 并列第一作者；*通訊作者