陳金斌，芮鴻飛，方佳寧，吳夢(mèng)妮，劉興泉，程秀秀

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州311300；2.溫嶺市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，浙江臺(tái)州317500）

糯米蛋白質(zhì)與黃酒氨基酸的相關(guān)性分析

陳金斌1，2，芮鴻飛1，方佳寧1，吳夢(mèng)妮1，劉興泉1，程秀秀1

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州311300；2.溫嶺市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，浙江臺(tái)州317500）

以36個(gè)糯米品種為原料釀造黃酒，通過(guò)紅外谷物分析儀測(cè)定原料糯米中總蛋白質(zhì)含量，用考馬斯亮藍(lán)G250在595 nm波長(zhǎng)下的最大光吸收測(cè)定原料糯米中可溶性蛋白質(zhì)含量，并采用異硫氰酸苯酯(PITC)-柱前衍生高效液相色譜法對(duì)黃酒的氨基酸進(jìn)行定量定性分析，建立糯米蛋白質(zhì)和黃酒氨基酸的相關(guān)性與回歸性分析。結(jié)果表明，糯米總蛋白和黃酒游離氨基酸總量的相關(guān)系數(shù)為0.826，達(dá)到極顯著水平；糯米總蛋白質(zhì)和黃酒單一氨基酸相關(guān)系數(shù)較好，R=0.931；糯米可溶性蛋白質(zhì)與黃酒游離氨基酸總量的相關(guān)系數(shù)為0.303，糯米可溶性蛋白質(zhì)與單一氨基酸的相關(guān)系數(shù)為0.704，糯米可溶性蛋白質(zhì)的相關(guān)系數(shù)均不如糯米總蛋白質(zhì)顯著。

糯米；蛋白質(zhì)；黃酒；氨基酸；相關(guān)性

黃酒是我國(guó)最具民族特色的酒精飲料，具有悠久的釀造歷史[1]。釀造黃酒以米類為原料，因?yàn)榇竺椎矸酆扛?，蛋白質(zhì)、脂肪含量低，能使酒中殘留的界限糊精和低聚糖多，口味也更醇厚。我國(guó)多數(shù)名優(yōu)黃酒用糯米釀造，由于糯米中淀粉含量稍高于其他米類，而蛋白質(zhì)等成分卻相對(duì)較低，因此釀成的酒雜味更少，殘留的糊精和低聚糖含量多，口味更加醇厚，深受人們的喜愛(ài)[2]。

黃酒中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)，研究發(fā)現(xiàn)其含有21種氨基酸，人體自身不能合成必須依靠食物攝取的8種必需氨基酸在黃酒中都具備[3]，因此其也有“液體蛋糕”的美稱。在酒的釀造中，酵母作為菌種在氨基酸的產(chǎn)生過(guò)程中起到了重要的作用，而氮源與酵母的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)關(guān)系密切[4]。葡萄酒[5-6]、啤酒[7-9]及其他發(fā)酵酒[10]關(guān)于原料蛋白質(zhì)與酒中氨基酸和香氣等研究較多，而原料糯米營(yíng)養(yǎng)組成對(duì)酒品質(zhì)影響方面目前研究得還較少。本實(shí)驗(yàn)收集分析了36個(gè)糯米樣品中總蛋白質(zhì)含量和可溶性蛋白質(zhì)的含量，并且通過(guò)分析糯米所釀黃酒中游離氨基酸含量，建立了糯米總蛋白質(zhì)及可溶性蛋白質(zhì)與黃酒氨基酸的相關(guān)性，為探究原料糯米蛋白質(zhì)對(duì)黃酒氨基酸含量的影響提供了可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品及耗材：36個(gè)不同品種的糯稻；17種氨基酸對(duì)照品（純度≥98%，sigma公司）；異硫氰酸苯酯（PITC,phenyl-isothiocyanate，純度≥98%，sigma公司）。

儀器設(shè)備：丹麥FOSST ECATOR公司生產(chǎn)的XDSContentAnalyzer AD-1100光柵型近紅外光譜分析儀；島津公司高效液相色譜儀（包括LC-20AT二元泵，SPD-M 20A二極管陣列檢測(cè)器，CTO-10ASVP自動(dòng)控溫箱及LC Solution工作站等），日本島津UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 糯米總蛋白的測(cè)定

糯米樣品直接放入近紅外谷物分析儀中掃描獲得光譜，利用MPLS模型和WinISI軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)計(jì)算。用近紅外模型分析平均值（ANL%）表示糯米中蛋白質(zhì)含量[11-13]。

1.2.2 糯米可溶性蛋白質(zhì)的測(cè)定

可溶性蛋白質(zhì)的測(cè)定使用考馬斯亮藍(lán)G250（Coomassie brilliant blue G-250）。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合在595 nm波長(zhǎng)下有最大光吸收且與蛋白質(zhì)含量成正比?？捡R斯亮藍(lán)G-250法操作簡(jiǎn)單快捷，反應(yīng)迅速靈敏，常作為可溶性蛋白質(zhì)的測(cè)定方法。

1.2.3 釀酒實(shí)驗(yàn)

糯稻脫殼精米后稱取精糯米300 g，加水淘洗干凈無(wú)米糠。然后將糯米加水超過(guò)米層6～10 cm的高度，用單層紗布遮蓋，室溫下（18℃左右）浸泡2 d。

將浸好的糯米上電熱蒸鍋蒸煮15min，蒸好的糯米飯顆粒完整、外硬內(nèi)軟、疏松不爛。將蒸好的米飯用自來(lái)水冷卻，使淋飯后的糯米飯溫度保持在40℃。取質(zhì)量為糯米質(zhì)量0.1%的活性酵母粉加入質(zhì)量為酵母粉10～30倍的38～40℃水中復(fù)水活化30～60m in，依次向酒壇中投入糯米、水、麥曲、液體酵母，攪拌均勻，控制落壇溫度在28～30℃，放置于30℃的恒溫箱中培養(yǎng)發(fā)酵。黃酒落壇后按時(shí)開(kāi)耙，發(fā)酵4～5 d時(shí)封緊壇口，密切關(guān)注酒的發(fā)酵情況，若溫度過(guò)高時(shí)，需及時(shí)開(kāi)耙降溫和通風(fēng)降溫。

1.2.4 黃酒氨基酸的測(cè)定

采用異硫氰酸苯酯（PITC）柱前衍生-高效液相色譜法[14-16]對(duì)黃酒中的氨基酸進(jìn)行測(cè)定，氨基酸衍生產(chǎn)物在紫外波段254 nm有吸收。用C18色譜柱分離后，紫外檢測(cè)器檢測(cè)，根據(jù)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間與待測(cè)樣品中的組分的保留時(shí)間進(jìn)行定性，外標(biāo)法定量分析。

色譜分析條件：色譜柱：Inertsil ODS-4 column (3μm，4.6×250mm)；保護(hù)柱：InertsilODS-SP(5μm, 4.0×10mm)；進(jìn)樣體積：10μL；流速：1.0m L/min；柱溫：38℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流動(dòng)相A液：10mM的磷酸緩沖鹽pH6.2，流動(dòng)相B液：乙腈；線性梯度洗脫程序?yàn)椋˙液/%）：0～8m in：5%；8～30min：5%～33%；30～35 m in：33%；35.01～40 m in：90%；40.01～55m in：5%；55.01m in：stop。

標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生化：準(zhǔn)確量取1m L的氨基酸混合對(duì)照品溶液，置于刻度試管中，用0.1 mol/L的HCl定容至4m L。取1 m L稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)溶液精確加入0.5m L的14%三乙胺的乙腈溶液和0.5m L的1.2%異硫氰酸苯酯的腈溶液搖勻，室溫靜置60m in。反應(yīng)完全后3000 r/m in離心5min，取上清液加入2m L正己烷萃取，經(jīng)0.45μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。

樣品衍生化：取0.25m L離心后的黃酒上清液，加入0.75m L的高純水，精確加入0.5m L的14%三乙胺的乙腈溶液和0.5m L的1.2%異硫氰酸苯酯的乙腈溶液搖勻，室溫下靜置60m in。反應(yīng)完全后以3000 r/min離心5m in，取上清液加入2m L正己烷萃取，經(jīng)0.45μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析方法

本文的數(shù)據(jù)是使用spss17.0數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析后得到的。

2 結(jié)果與分析

2.1 糯米總蛋白質(zhì)和可溶性蛋白質(zhì)含量（表1）

表1 糯米蛋白質(zhì)檢測(cè)結(jié)果

采用近紅外光譜分析測(cè)定糯米總蛋白含量在8.10%～10.30%之間。其中9號(hào)總蛋白含量最高為10.30%，1號(hào)、2號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、10號(hào)、11號(hào)、13號(hào)、14號(hào)、16號(hào)、23號(hào)、25號(hào)、27號(hào)、29號(hào)、30號(hào)、32號(hào)、33號(hào)、36號(hào)18個(gè)糯米樣品總蛋白含量在9%～10%之間，其余的17個(gè)糯米樣品總蛋白含量在8%～9%之間?？扇苄缘鞍踪|(zhì)含量位于前3位的糯米樣品依次為6號(hào)、13號(hào)和30號(hào)。

2.2 黃酒氨基酸的含量

氨基酸是黃酒的主要成分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，黃酒中氨基酸的種類和含量非常豐富，主要來(lái)自原料糯米。原料糯米經(jīng)過(guò)浸泡、蒸煮和發(fā)酵之后，大部分蛋白質(zhì)被微生物發(fā)酵利用產(chǎn)生氨基酸，一部分水解成分子量小的肽類物質(zhì)，剩下的則留在發(fā)酵液中[17]。FAO/WHO在1973年提出的理想蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)是：人體必需氨基酸和總氨基酸含量的比值是40%左右，人體必需氨基酸和非必需氨基酸含量的比值是60%以上[18]。黃酒氨基酸檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2，從表2可以看出，黃酒必需氨基酸（essential am ino acid，EAA）和總氨基酸（totalam ino acid，TAA）含量的比值（N/T）為28.7%～36.2%，必需氨基酸和非必需氨基酸（non-essential acid，NEAA）含量比值（N/E）為40.2%～56.7%，黃酒中必需氨基酸和總氨基酸含量的比值以及必需氨基酸和非必需氨基酸含量的比值接近于人體理想蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，因此黃酒對(duì)人體是比較理想的蛋白質(zhì)模型，適合人體的生長(zhǎng)需要。

黃酒游離氨基酸總量差異明顯，其呈味氨基酸含量由高到低依次為：苦味氨基酸、甜味氨基酸、鮮味氨基酸。根據(jù)表2黃酒氨基酸檢測(cè)結(jié)果可知，36個(gè)黃酒樣品中苦味氨基酸的含量為2437 mg/L± 79.4mg/L，甜味氨基酸含量為1191mg/L±41.4mg/L，鮮味氨基酸的含量為203mg/L±8.0mg/L。其中13號(hào)、11號(hào)、7號(hào)氨基酸含量最高，分別為5283.1mg/L、5046.6mg/L、4867.2mg/L。

PITC柱前衍生-高效液相色譜法的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)圖譜和黃酒氨基酸圖譜分別見(jiàn)圖1和圖2，黃酒中17種氨基酸的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 糯米總蛋白質(zhì)與黃酒氨基酸的相關(guān)性分析

糯米總蛋白質(zhì)與黃酒游離氨基酸的相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可以看出，糯米總蛋白質(zhì)和黃酒游離氨基酸的整體相關(guān)系數(shù)（Multiple R）非常高，R=0.931。表明以糯米總蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)黃酒氨基酸的解釋能力為93.1%，調(diào)整后的R2也達(dá)到了74.1%。這表示17個(gè)獨(dú)立變量可以解釋糯米總蛋白質(zhì)為93.1%的變化量，F(xiàn)回歸=6.894＞F0.01(17，18)= 3.21，P＜0.01，模型檢驗(yàn)的結(jié)果指出回歸系數(shù)達(dá)到顯著水平，該解釋力具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。單一氨基酸的Pearson相關(guān)性分析中，從呈味氨基酸的分類看，甜味氨基酸Gly與糯米總蛋白的相關(guān)性為正相關(guān)，達(dá)到了顯著水平(p＜0.05),而另外的16種氨基酸與糯米總蛋白的相關(guān)性也為正相關(guān)，而且達(dá)到了極顯著水平(p＜0.01)，說(shuō)明黃酒單一氨基酸與糯米總蛋白質(zhì)含量高度相關(guān)。系數(shù)估計(jì)的結(jié)果顯示，Lys具有最大的解釋力，Beta達(dá)2.294，表示糯米總蛋白質(zhì)含量越高，黃酒中Lys越多。

圖1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)圖譜

圖2 黃酒氨基酸圖譜

表2 黃酒氨基酸檢測(cè)結(jié)果(mg/L)

表3 糯米總蛋白質(zhì)與黃酒游離氨基酸的相關(guān)性分析結(jié)果

表4 糯米總蛋白質(zhì)與黃酒游離氨基酸總量的相關(guān)性分析結(jié)果

由表4糯米總蛋白與黃酒游離氨基酸總量的相關(guān)性分析結(jié)果可以看出，糯米總蛋白質(zhì)和黃酒游離氨基酸總量的相關(guān)系數(shù)（Multiple R）與標(biāo)準(zhǔn)系數(shù)（Beta）皆為0.826，這兩個(gè)系數(shù)的檢驗(yàn)值相同，F(xiàn)回歸= 72.812＞F0.01(1，34)=7.44，P＜0.01，回歸系數(shù)達(dá)到極顯著水平，該解釋力具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。系數(shù)估計(jì)的結(jié)果表明，糯米總蛋白質(zhì)含量能夠有效預(yù)測(cè)黃酒氨基酸含量，Beta系數(shù)為0.826，表示糯米總蛋白質(zhì)含量越高，黃酒氨基酸含量越高。9號(hào)樣品糯米總蛋白質(zhì)含量最高，在所釀造的黃酒中氨基酸總量和各種游離氨基酸的含量也較高。

2.4 糯米可溶性蛋白質(zhì)與黃酒氨基酸的相關(guān)性分析

糯米可溶性蛋白質(zhì)與黃酒游離氨基酸的相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)表5，糯米可溶性蛋白質(zhì)與黃酒游離氨基酸的整體相關(guān)系數(shù)為0.704，低于糯米總蛋白質(zhì)與黃酒氨基酸的相關(guān)系數(shù)，調(diào)整后的相關(guān)系數(shù)只有0.496，F(xiàn)回歸=1.042＜F0.05(17,18)=3.21，P=0.464，模型檢驗(yàn)的結(jié)果指出回歸系數(shù)未達(dá)到顯著水平，該相關(guān)系數(shù)的解釋力沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。單一氨基酸和可溶性蛋白質(zhì)的相關(guān)性分析中，各種氨基酸和可溶性蛋白質(zhì)的相關(guān)系數(shù)均不高于0.332，只有Pro的相關(guān)系數(shù)為0.332，在0.05水平上達(dá)到顯著，其他16種氨基酸的相關(guān)系數(shù)均未達(dá)到顯著水平，綜合整體的情況，糯米可溶性蛋白質(zhì)和黃酒氨基酸的相關(guān)性并不明顯。

由表6糯米可溶性蛋白質(zhì)與黃酒游離氨基酸總量的相關(guān)性分析結(jié)果可看出，糯米可溶性蛋白質(zhì)和黃酒游離氨基酸總量的相關(guān)系數(shù)為0.303，回歸系數(shù)的檢驗(yàn)值也相同，F(xiàn)回歸=3.428＜F0.05(1，34)= 4.13，P=0.073，回歸系數(shù)不顯著，該解釋力沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。系數(shù)估計(jì)的結(jié)果不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Beta系數(shù)為0.303。說(shuō)明糯米可溶解性蛋白質(zhì)和黃酒氨基酸總量的相關(guān)性不明顯。

表5 糯米可溶性蛋白質(zhì)與黃酒游離氨基酸的相關(guān)性分析結(jié)果

表6 糯米可溶性蛋白質(zhì)與黃酒游離氨基酸總量的相關(guān)性分析結(jié)果

3 結(jié)論

糯米總蛋白質(zhì)與黃酒游離氨基酸的總體相關(guān)系數(shù)較大，R=0.931，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；糯米總蛋白質(zhì)和黃酒游離氨基酸總量的總體回歸系數(shù)為0.826，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且相關(guān)性達(dá)到極顯著水平。糯米總蛋白質(zhì)與黃酒單一氨基酸的相關(guān)性均為正相關(guān)，且兩者的相關(guān)性都達(dá)到了顯著或者極顯著水平。而糯米可溶性蛋白質(zhì)和黃酒氨基酸之間的相關(guān)性不明顯。這說(shuō)明糯米中蛋白質(zhì)在很大程度上影響黃酒中游離氨基酸的含量，糯米中總蛋白質(zhì)含量越高，黃酒游離氨基酸的含量也相對(duì)越高。在36個(gè)糯米品種中，從糯米總蛋白質(zhì)含量、黃酒氨基酸含量綜合考慮，9號(hào)、11號(hào)和13號(hào)糯米總蛋白質(zhì)含量高，釀造的黃酒氨基酸總量也較高，是釀造黃酒的優(yōu)質(zhì)糯米原料。

本研究從統(tǒng)計(jì)分析的角度研究糯米原料蛋白質(zhì)對(duì)黃酒氨基酸含量的影響，以后將進(jìn)一步研究糯米營(yíng)養(yǎng)成分如何轉(zhuǎn)變?yōu)辄S酒組成成分的合成機(jī)理和轉(zhuǎn)變路徑。

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Analysisof the Correlationsbetween Am ino Acid Content in Yellow Rice W ine and Protein Content in G lutinousRice

CHENG Jinbin1,2,RUIHongfei1,FANG Jianing1,WUMengni1,LIU Xingquan1and CHENG Xiuxiu1
(1.College of Agriculture and Food Science,Zhejiang Agriculture and Forestry University,Hangzhou,Zhejiang 311300; 2.Wenling Food&Drug Inspection and Testing Center,Taizhou,Zhejiang 317500,China)

Yellow ricew inewas produced by using 36 kinds of glutinous rice respectively under the same conditions.The total protein in glutinous ricewasmeasured by the infrared grain analyzer,the soluble protein content in glutinous ricewasmeasured by Coomassie brilliantblue G250 at595 nm wavelength ofmaximum lightabsorption spectrometry,and qualitative and quantitative analysis of am ino acid content in the produced yellow ricew ine sampleswas performed by using phenylisothiocyanate(PITC)pre-column derivatization HPLC.Finally,amodel for correlation and regression analysis of protein content in glutinous rice and amino acid content in yellow ricew inewas setup.The results showed that,the correlation coefficientbetween total protein in glutinous rice and total free amino acid in yellow ricew inewas 0.826,whichwas of extreme significance;the correlation coefficientbetween totalprotein in glutinous rice and amino acid in yellow ricew inewas 0.931;the correlation coefficientbetween soluble protein content in glutinous rice and total free amino acid in yellow ricew inewas 0.303;and the correlation coefficientbetween soluble protein in glutinous rice and amino acid in yellow ricew inewas0.704.The correlation coefficientof soluble protein in glutinous ricewas inferior to thatof totalprotein in glutinous rice.

glutinous rice;protein;yellow ricew ine;amino acid;correlation

TS262.3；TS261.4；TS261.7

A

1001-9286（2017）04-0051-06

10.13746/j.njkj.2017008

2017-01-10

陳金斌（1983-），男，浙江臺(tái)州，本科，工程師，研究方向：食品分析與檢測(cè)，E-mail：ruihongfei1991@163.com。

劉興泉（1973-），男，浙江杭州，博士，教授，研究方向：黃酒質(zhì)量控制與食品安全研究，E-mail：liuxq@zafu.edu.cn。