李成偉，盧丹，那妍，李巖，王本鑫，婁憲芝

（沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院1.感染科；2.呼吸科；3.檢驗(yàn)科，沈陽110024）

恩替卡韋治療后e抗原陽性慢性乙型肝炎患者Treg/Th17比率的變化及其與療效的關(guān)系

李成偉1，盧丹2，那妍1，李巖1，王本鑫3，婁憲芝1

（沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院1.感染科；2.呼吸科；3.檢驗(yàn)科，沈陽110024）

目的研究恩替卡韋治療乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）陽性慢性乙型肝炎（CHB）患者過程中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）與Th17細(xì)胞比率的變化及其與病毒學(xué)應(yīng)答和血清學(xué)應(yīng)答的關(guān)系。方法應(yīng)用恩替卡韋治療27例HBeAg陽性CHB患者，在治療前及治療4、12、24、36、48周時(shí)分別檢測乙肝標(biāo)志物、HBV DNA、肝功、Treg細(xì)胞頻數(shù)、Th17細(xì)胞頻數(shù)。選擇20名健康人作為對(duì)照組。結(jié)果Treg/Th17比率在第4周開始下降，至第12周達(dá)到最低值。發(fā)生早期病毒學(xué)應(yīng)答及HBeAg消失患者的Treg/Th17比率（12周）低于未發(fā)生早期病毒學(xué)應(yīng)答及HBeAg消失的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論恩替卡韋治療慢性乙型肝炎患者過程中，Treg/Th17比率呈動(dòng)態(tài)變化，12周時(shí)Treg/Th17比率與HBeAg消失、早期病毒學(xué)應(yīng)答密切相關(guān)，可能成為療效預(yù)測的指標(biāo)。

慢性乙型肝炎；恩替卡韋；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；Th17細(xì)胞

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）仍是世界范圍內(nèi)亟待解決的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題［1］，恩替卡韋為鳥嘌呤核苷類似物，是治療CHB首選的藥物之一，抗病毒治療效果好，耐藥率低。影響抗病毒療效的因素主要包括宿主和病毒兩方面因素，研究表明宿主的免疫狀態(tài)是預(yù)測療效的關(guān)鍵因素［2］，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（T regulatory cell，Treg）與Th17細(xì)胞的比率可以反映CHB患者體內(nèi)免疫狀態(tài)的變化［3］。本研究探討了恩替卡韋治療CHB過程中Treg/Th17比率的變化與療效的關(guān)系，并評(píng)價(jià)其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2013年1月至2014年12月沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院感染科診治的27例乙型肝炎病毒e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）陽性CHB患者，平均年齡（38.7±12.2）歲，其中男17例，女10例，均符合《慢性乙型肝炎防治指南》（2010）［4］的診斷標(biāo)準(zhǔn)，患者HBV DNA≥5 lg（copies/mL），HBeAg陽性，丙氨酸轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）≥2 ULN，至少半年內(nèi)未進(jìn)行抗病毒或免疫調(diào)節(jié)治療。給予恩替卡韋（博路定）0.5 mg每日1次口服；肝功異常者給予保肝藥物治療。選擇20名健康人（男10名，女10名）作為對(duì)照組，所有健康對(duì)照者排除自身免疫性肝病等肝臟疾病，排除人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎病毒等病毒感染。

1.2 檢測指標(biāo)

CHB患者在應(yīng)用恩替卡韋治療前及治療4、12、24、36、48周時(shí)采集外周靜脈血，測定Treg細(xì)胞（Foxp3+T細(xì)胞）比例、Th17細(xì)胞（IL?17+T細(xì)胞）比例、HBV DNA水平（HBV DNA陰轉(zhuǎn)標(biāo)準(zhǔn)為HBV DNA＜103copies/mL）、HBV血清標(biāo)志物、ALT水平。健康對(duì)照組僅采血1次，測定Treg細(xì)胞（Foxp3+T細(xì)胞）和Th17細(xì)胞（IL?17+T細(xì)胞）比例。

1.3 方法

1.3.1 Th17細(xì)胞檢測：實(shí)驗(yàn)前應(yīng)用肝素抗凝管分別取實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組每人全血5 mL。取新試管孵育細(xì)胞，肝素抗凝全血500 μL，加刺激劑500 μL后放入37℃的CO2恒溫箱中孵育5 h。再取一新試管，加入CD3、CD4抗體各10 μL，刺激后血樣用移液器取上清500 μL棄去，混勻，取100 μL放入加好抗體的試管，放置15 min（室溫避光）。加入1 mL溶血素（溶血素∶蒸餾水=1∶9）放置10 min（室溫避光）。低速離心5 min（1 500 r/min）棄去上清。加入1 mL破膜液放置30 min（室溫避光）。加入1 mL破膜buffer放置20 min（室溫避光）。低速離心5 min（1 500 r/min）棄去上清。加17 μL IL?17抗體，混勻后放置30 min（室溫避光）。加入1 mL PBS混勻后低速離心棄去上清。加300 μL PBS后混勻進(jìn)行流式檢測（美國BD Biosciences流式細(xì)胞儀）。

1.3.2 Treg細(xì)胞檢測：另取新試管，加CD4抗體、CD25抗體各10 μL，加未孵育全血100 μL，混勻，放置15 min（室溫避光）。加入1 mL破膜液，放置30 min（室溫避光）。加入1 mL破膜buffer放置20 min（室溫避光）。低速離心5 min（1 500 r/min）棄上清。加2.5 μL Foxp3抗體，放置2 h（室溫避光）。加入PBS 1 mL，混勻，低速離心5 min（1 500 r/min）棄上清。加300 μL PBS，應(yīng)用流式細(xì)胞儀（美國BD Bio?sciences流式細(xì)胞儀）進(jìn)行檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間均值比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 恩替卡韋治療前后Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞頻數(shù)的變化

如表1所示，應(yīng)用恩替卡韋治療后，CHB組患者Treg細(xì)胞在第4周開始下降，至12周達(dá)到最低點(diǎn)，之后逐漸升高，至48周接近治療前水平。CHB組患者Th17細(xì)胞頻數(shù)的均數(shù)在各時(shí)間點(diǎn)均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），CHB組患者Th17細(xì)胞頻數(shù)先升高后下降，第12周改變最顯著。CHB組患者Treg/Th17比率在治療過程中呈動(dòng)態(tài)變化，治療4周時(shí)開始下降，至12周達(dá)到最低值，后逐漸升高，在48周時(shí)與治療前水平相近。CHB組患者Treg/Th17比率在治療前及治療中各時(shí)間點(diǎn)均明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）。

表1 恩替卡韋治療CHB患者Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞頻數(shù)的變化Tab.1Changes of Treg/Th17 ratio in HBeAg positive CHB patients receiving entecavir

2.2 Treg/Th17比率變化與HBV DNA變化的相關(guān)性

27例HBeAg陽性的CHB患者應(yīng)用恩替卡韋治療后，HBV DNA于第4周時(shí)開始下降，12周時(shí)患者HBV DNA陰轉(zhuǎn)率為62.96%（17/27），24周時(shí)患者HBV DNA陰轉(zhuǎn)率為96.29%（26/27），48周時(shí)患者HBV DNA陰轉(zhuǎn)率為100%（27/27）。

Treg/Th17比率在12周時(shí)改變最明顯，分析12周時(shí)Treg/Th17比率與早期病毒學(xué)應(yīng)答（12周）的關(guān)系，發(fā)生早期病毒學(xué)應(yīng)答的17例患者Treg/Th17比率均數(shù)（1.79±0.62）較未發(fā)生病毒學(xué)早期應(yīng)答的10例患者Treg/Th17比率均數(shù)（2.43±0.36）明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 Treg/Th17比率變化與HBeAg消失的關(guān)系

入組時(shí)所有患者均為HBeAg陽性，24周時(shí)HBeAg陰轉(zhuǎn)率為11.11%（3/27），48周時(shí)累計(jì)HBeAg陰轉(zhuǎn)率為37.04%（10/27）。發(fā)生HBeAg消失（12周）的10例患者Treg/th17比率（1.45±0.51）與未發(fā)生HBeAg消失的17例患者的Treg/th17比率（2.37± 0.37）的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

HBV持續(xù)復(fù)制及機(jī)體的免疫反應(yīng)是CHB進(jìn)展的重要原因［5］，持續(xù)抑制病毒是治療CHB的重要措施，恩替卡韋具有強(qiáng)效抗HBV作用，經(jīng)治療患者HBV DNA載量迅速下降，并且在治療過程中表現(xiàn)出較高的HBeAg清除率，而Treg/Th17比率可以提示患者體內(nèi)免疫功能的變化，研究Treg/Th17比率與HBeAg清除的關(guān)系對(duì)指導(dǎo)臨床治療有重要意義。

Treg細(xì)胞是以免疫抑制活性為特征的T細(xì)胞，可抑制HBV特異性免疫反應(yīng)，是導(dǎo)致免疫耐受的主要細(xì)胞［6］。而且HBV能夠誘導(dǎo)Treg的產(chǎn)生，維持免疫耐受［7］。核苷（酸）類似物治療可能使刺激Treg細(xì)胞增多的因素減少，Treg細(xì)胞比例明顯降低，抑制HBV特異性免疫反應(yīng)的作用減弱，體內(nèi)免疫反應(yīng)增強(qiáng)，免疫功能得到改善。Th17細(xì)胞產(chǎn)生的白細(xì)胞介素17A等效應(yīng)因子可增強(qiáng)組織炎癥反應(yīng)，有研究［8］表明免疫介導(dǎo)的肝臟損傷與Th17細(xì)胞相關(guān)，考慮為Th17細(xì)胞表達(dá)增加，增強(qiáng)和參與了因HBV特異性免疫應(yīng)答而引起的肝臟炎癥反應(yīng)。Treg細(xì)胞抑制炎癥反應(yīng)，而Th17細(xì)胞促進(jìn)炎癥反應(yīng)，Treg/Th17的動(dòng)態(tài)平衡是慢性炎癥持續(xù)及進(jìn)展等變化的重要因素［9］。CHB患者多處于Th17細(xì)胞增加的免疫失衡狀態(tài)，Treg/Th17比率可以提示患者體內(nèi)免疫功能的變化［10］。

本研究中，經(jīng)恩替卡韋治療后，Treg/Th17比率呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，表現(xiàn)為先下降后升高，且CHB患者的Th17細(xì)胞在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯高于健康對(duì)照者，導(dǎo)致Treg/Th17比率降低，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均低于健康對(duì)照者。恩替卡韋治療使HBV DNA載量迅速降低，改善了機(jī)體免疫狀態(tài)，使Th17細(xì)胞增多，Treg/Th17比率降低。而后Treg/Th17比率逐漸升高的機(jī)制可能為體內(nèi)免疫系統(tǒng)為減輕炎癥反應(yīng)，使CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化［11］，從而Th17細(xì)胞減少。也有研究［12］表明，當(dāng)HBV DNA明顯下降、HBeAg轉(zhuǎn)陰或發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn)換及ALT恢復(fù)正常時(shí)，Th17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子的分泌均呈明顯下降趨勢，Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞進(jìn)入新的平衡狀態(tài)，Treg/Th17比率升高。本研究觀察到，第12周時(shí)Treg/Th17比率的變化在早期病毒學(xué)應(yīng)答及HBeAg消失的患者中表現(xiàn)更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Treg/Th17比率的變化與早期病毒學(xué)應(yīng)答及HBeAg消失相關(guān)。

Treg/Th17比率在接受恩替卡韋治療的HBeAg陽性CHB患者中呈波動(dòng)性改變，與療效具有相關(guān)性，但其波動(dòng)機(jī)制及預(yù)測療效的作用及程度還需要進(jìn)一步觀察。

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（編輯陳姜）

Relationship between Changes of Treg/Th17 Ratio and Curative Effect in Patients with HBeAg?positive Chronic Hepatitis B after Receiving Entecavir

LI Chengwei1，LU Dan2，NA Yan1，LI Yan1，WANG Benxin3，LOU Xianzhi1
（1.Department of Infectious Disease，The Affiliated Central Hospital of Shenyang Medical College，Shenyang 110024，China；2.Department of Respiration，The Affili?ated Central Hospital of Shenyang Medical College，Shenyang 110024，China；3.Clinical Laboratory，The Affiliated Central Hospital of Shenyang Medical College，Shenyang 110024，China）

ObjectiveTo investigate whether there are correlation among changes of Treg/Th17 ratio with virological response and serological re?sponse in patients with hepatitis B e antigen（HBeAg）?positive chronic hepatitis B（CHB）after receiving entecavir.Methods27 patients with HBeAg?positive CHB were enrolled for the study.Peripheral blood Treg cell frequency and Th17 cell frequency，HBV DNA，alanine aminotransfer?ase levels，hepatitis B virus marker were detected before and after entecavir treatment at 4，12，24，36，and 48 weeks.Peripheral blood Treg cell frequency and Th17 cell frequency of 20 healthy volunteers were detected as well.ResultsTreg/Th17 ratio of patients decreased from 4 week and reached the lowest point at 12 weeks.Treg/Th17 ratio（12 weeks）of the patients who got the early virological response and HBeAg disappeared was lower than others，and the difference was statistical significant.ConclusionTreg/Th17 ratio changes in HBeAg?positive CHB patients receiv?ing entecavir antiviral treatment.Treg/Th17 ratio（12 weeks）showed significant correlation with early virological response and HBeAg disappear?ance.The changes of Treg/Th17 ratio may provide a reference of curative effect.

chronic hepatitis B；entecavir；T regulatory cell；Th17 cell

R512.6

A

0258-4646（2017）01-0033-04

10.12007/j.issn.0258?4646.2017.01.007

遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃（2013225086）；沈陽市衛(wèi)生局科研課題（2012）

李成偉（1975-），男，副主任醫(yī)師，碩士.

婁憲芝，E-mail：grk8@163.com

2016-05-19

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：