靳曉軍，謝雙，程洪亮，李京京，陸兵

1.軍事醫(yī)學科學院 生物工程研究所，北京 100071；

2.軍事醫(yī)學科學院 科技部，北京 100071

科研管理

埃博拉病毒實驗室事故的教訓與啟示

靳曉軍1，2，謝雙1，程洪亮1，李京京1，陸兵1，2

1.軍事醫(yī)學科學院 生物工程研究所，北京 100071；

2.軍事醫(yī)學科學院 科技部，北京 100071

隨著我國四級實驗室的建成和即將投入使用，將有條件開展埃博拉病毒等一類病原微生物的培養(yǎng)和動物感染實驗等實驗活動。本文通過匯總并分析歷史上埃博拉病毒實驗室事故，總結教訓，并結合實驗室生物安全管理的通用要求，探討了生物安全四級實驗室防范實驗室人員感染事件的策略。

埃博拉病毒；實驗室事故；實驗室生物安全

而在人類從事埃博拉病毒相關研究的幾十年中，曾出現(xiàn)了為數(shù)不多的幾起典型實驗室事故。通過分析、研究歷史上發(fā)生過的以埃博拉病毒為代表的一類病原微生物的實驗室生物安全事故，可以總結實驗室生物安全的規(guī)律和經(jīng)驗，有助于降低高級別生物安全實驗室發(fā)生安全事故的風險，在從事高致病性病原微生物研究過程中更好地保護人員和環(huán)境。

1 埃博拉病毒實驗室意外事件

微生物實驗室根據(jù)所涉及病原體不同實驗活動所需要的生物安全防護要求，分為一級（BSL-1）～四級（BSL-4）四種生物安全防護水平，其中BSL-3實驗室和BSL-4實驗室又統(tǒng)稱為高級別生物安全實驗室，主要開展高致病性病原微生物相關實驗活動。根據(jù)我國原衛(wèi)生部發(fā)布的《人間傳染的病原微生物名錄》，埃博拉病毒屬于第一類病原微生物，其病毒培養(yǎng)、動物感染實驗須在BSL-4條件下進行，包括病毒的分離、培養(yǎng)、滴定、中和試驗、活病毒及其蛋白純化、病毒凍干以及產(chǎn)生活病毒的重組試驗等操作，或活病毒感染動物的實驗。未經(jīng)培養(yǎng)的埃博拉病毒感染材料操作須在BSL-3條件下進行，包括未經(jīng)培養(yǎng)的病毒感染性材料在滅活前進行的抗原檢測、血清學檢測、核酸檢測、生化分析等操作。利用活病毒或其感染細胞（或細胞提取物），不經(jīng)滅活進行的生化分析、血清學檢測、免疫學檢測等操作，以及使用病毒培養(yǎng)物提取核酸，均視同病毒培養(yǎng)，必須在BSL-4條件下進行。而加入裂解劑或滅活劑后的病毒培養(yǎng)物操作，可在BSL-3條件下進行。國際上埃博拉活病毒的研究也多要求在BSL-4條件下進行，但仍不可避免出現(xiàn)各種意外，并導致事故的發(fā)生，甚至出現(xiàn)人員死亡。

1.1 1976年英國針刺感染事件

1976年11月5日，一名研究人員在位于英國威爾特郡波登當（Porton Down）的微生物研究設施中轉移感染埃博拉病毒的豚鼠肝臟勻漿時，意外刺破手套傷及拇指。他立即按照標準的安全操作規(guī)程脫掉手套，并將拇指侵入次氯酸鹽溶液，然后用力擠壓傷口。當時沒有出血，使用放大鏡仔細檢查也沒有發(fā)現(xiàn)創(chuàng)口。事發(fā)后將其轉移至負壓隔離器中進行持續(xù)監(jiān)控，6 d后（11月11日）發(fā)病并最終確診為埃博拉感染。所幸該患者在采用人干擾素及經(jīng)處理的恢復期血清（60℃加熱1 h并檢測乙肝陰性）治療后，在事故第17 d（11月22日）患者所有癥狀消失，體溫恢復正常，體液及拭子病毒檢測呈陰性[4]。

1.2 1994年科特迪瓦感染事件

1994年11月16日，非洲暴發(fā)埃博拉疫情期間，3位科學家在科特迪瓦解剖一只12 h內(nèi)死亡的黑猩猩。該動物有出血熱征狀，并且后期的免疫化學檢查發(fā)現(xiàn)為埃博拉病毒感染，而解剖時，2位科學家佩戴了乳膠檢查手套，另一位則佩戴了家用手套，且3人均未佩戴口罩、未穿防護服。11月24日，那位佩戴家用手套的34歲瑞士女生態(tài)學家出現(xiàn)發(fā)熱、寒戰(zhàn)，口服抗瘧藥癥狀無改善，3 d后就醫(yī)按瘧疾治療，癥狀無改善且出現(xiàn)腹痛、腹瀉、嘔吐和斑癥，第7 d被運送回瑞士。病人轉運期間以及入院治療期間，相關人員均佩戴防護口罩，穿戴防護服、手套，并按有關操作指南進行處理。病人在治療15 d后康復出院，6周后完全恢復。在病人第4d和第8 d的血樣中分離到一種新的埃博拉亞型（科特迪瓦型），同時排除了炭疽、登革、漢坦等其他常見感染[5]。

沒有尊重就沒有教育，教育是建立在尊重基礎上的教育，也是教育的出發(fā)點和歸宿。尊重源于對學生人格的認可，在教育教學面前教師與學生、學生與學生其實都是平等的個體，學生可能在智力、能力、情感等方面存在千差萬別的情況，但作為學生的基本屬性是不變的，都是我們教育的對象，是我們傳授知識的主體，是學習的主人，也是教學成敗的關鍵評價指標，不是好學生才評價，差學生也是評價的主體。只有尊重學生才愿意學；只有尊重學生才更喜歡學；只有尊重學習才更有尊嚴。尊重學生是我們從事教育教學的前題。

1.3 2004年美國針刺事件

2004年，在美國陸軍醫(yī)學傳染病研究所（USAMRIID）的BSL-4實驗室，一位病毒學家按標準操作對小鼠（2 d前注射了小鼠適應的埃博拉病毒株）腹腔注射免疫球蛋白，采用連續(xù)使用的注射器對第5只小鼠進行注射時，小鼠踢到注射器，針頭刺穿了他的左手手套，并導致一個小創(chuàng)口。傷者立即擠壓傷口使出血，在化學淋消后對傷口使用1 L蒸餾水進行沖洗并擦洗聚維酮碘10min。因存在感染的可能性，將傷者置于醫(yī)學隔離單元（medicalcontainment suite）隔離觀察。后期檢測表明，事故時的5只小鼠都沒有病毒血癥，觀察傷者21 d未發(fā)病也未產(chǎn)生抗體，因此解除隔離[6]。

1.4 2004年俄羅斯針刺感染致死事件

2004年5月5日，俄羅斯新西伯利亞病毒學與生物技術國家科學中心的46歲女科學家在BSL-4實驗室中對感染埃博拉病毒的豚鼠進行抽血操作時，被帶有豚鼠血液的注射器意外扎傷左手掌。受傷后，她按實驗室應急程序通知了實驗室有關人員，并立即就醫(yī)，1周后出現(xiàn)臨床癥狀，5月19日因救治無效死亡[7-8]。

1.5 2009年德國針刺暴露事件

2009年3月12日，德國漢堡Bernard Nocht熱帶醫(yī)學研究所一名病毒研究人員在BSL-4實驗室進行小鼠埃博拉病毒感染實驗時扎傷了手指。注射器內(nèi)裝有超離濃縮的Zaire型埃博拉病毒培養(yǎng)上清與弗氏不完全小鼠免疫佐劑的1∶1混合液。在注射完畢后給針頭蓋帽時，針從側面穿過并刺穿了全部3層手套。皮膚刺破處傷口明顯，但并沒有出血。研究人員在扎傷后未立即擠血，且在退出實驗室后才對傷口進行了消毒。第2 d的RT-PCR檢測結果顯示，針頭中殘留2 μL混合液的埃博拉病毒滴度達1.4× 108拷貝/mL。漢堡大學醫(yī)學中心的傳染病專家在事故發(fā)生后立即對扎傷人員進行了醫(yī)療觀察，并決定與加拿大和美國同行共同商討暴露后預防和感染的處理方案。因沒有用于埃博拉出血熱的有效治療和暴露后預防方法，在當夜和第2 d經(jīng)專家組討論和風險評估后，推薦使用對非人靈長類感染薩伊埃博拉病毒具有暴露后預防作用的試驗性疫苗，該疫苗為能表達薩伊埃博拉病毒的糖蛋白減毒重組水皰性口炎病毒，尚未在人類使用。在患者同意住院接受預防性治療后，事故48 h后對患者注射了從加拿大運達的總量5×107CFU的疫苗，接種時無明顯不良反應，12 h后出現(xiàn)發(fā)熱，2 d后PCR檢測到水皰性口炎病毒病毒血癥，其他檢查均正常，并且在3周的觀察期內(nèi)在血清和外周血單核細胞中未發(fā)現(xiàn)埃博拉病毒RNA[9-10]。

1.6 2014年美國樣本錯誤傳出實驗室事件

2014年12月，亞特蘭大CDC下屬的VSPB（Viral Special Pathogens Branch）實驗室發(fā)現(xiàn)一名實驗員可能將活性埃博拉病毒樣品攜出BSL-4實驗室并在BSL-2實驗室開展核酸檢測操作。實驗操作應從豚鼠采集2份口腔拭子，其中一份置于含有可滅活病毒的裂解緩沖液的試管中，用于傳出BSL-4實驗室在BSL-2實驗室進行核酸檢測；另一份置于含有病毒轉移液（VTM）的試管中，用于在BSL-4實驗室進行病毒分離。由于實驗員操作與交接失誤，未仔細辨別試管標記，將VTM管中的樣品誤作核酸檢測樣品，轉移到96孔板中，熱封后經(jīng)渡槽轉移到實驗室外并流入BSL-2實驗室開展核酸分析。所幸后續(xù)評價結果表明，事發(fā)當天前后的動物樣本中均未檢測到活病毒，提示所傳出樣本中可能也沒有活病毒[11]。

2 埃博拉病毒實驗意外事件分析及啟示

2.1 埃博拉病毒實驗意外事件分析

埃博拉病毒被國際公認為最危險的病毒之一，需要在最高防護等級的實驗室（BSL-4實驗室）方可開展病毒培養(yǎng)及動物感染等實驗活動，因此相對而言，相關實驗活動僅能在有限實驗室內(nèi)展開，歷史上的實驗室事件不多，但均很典型。表1匯總了本文收集的6起事件的情況。

從表1可以看出，6起事件中有4起是針刺事件，其中3起是生物安全實驗室中難以徹底杜絕的意外事件，另一起則是生物安全標準微生物學操作中禁止的操作（給用畢的注射器戴回針帽）。樣本錯誤傳出源于人員疏忽，也反映了管理及實驗設計和操作中的問題。

表1 埃博拉病毒實驗意外事件匯總表

2.2 埃博拉病毒實驗意外事件的啟示

2.2.1 規(guī)范銳器操作 銳器的使用始終是實驗室生物安全關注的重點之一，在埃博拉病毒這樣的一類病原微生物實驗活動中，最難控制的實驗室意外之一就是針刺，這從埃博拉實驗室事件中也得到了證明。特別是事件1中，針刺后在未見明顯傷口、擠壓未出血的情況下即發(fā)生感染，表現(xiàn)出埃博拉病毒對人的高度易感性，也揭示了埃博拉實驗中針刺的高度風險和危害。

GB19489-2008《實驗室 生物安全通用要求》[12]“生物安全實驗室良好工作行為指南”中規(guī)定，關于銳器，實驗室應“配備降低銳器損傷風險的裝置和建立操作規(guī)程”。并應在使用銳器時注意4點，即：①不要試圖彎曲、截斷、破壞各種銳器，不要試圖取下針頭或套上針頭護套（事件5中的錯誤操作）；②使用過需廢棄的銳器要置于專用的耐扎容器中，在達到規(guī)定的盛放容量前高壓處理；③需要重復利用的銳器要置于專用的耐扎容器中，經(jīng)消毒滅菌和清潔后再安全處置；④不能直接用手處理打破的玻璃器具等，盡量避免使用易碎的器具。而針對動物實驗中銳器的使用，也規(guī)定了“只要可能，限制使用針頭、注射器或其他銳器，盡量使用替代的方案，如改變動物染毒途徑等”。

高級別生物安全實驗室減少和避免銳器事件的措施包括：①盡量減少銳器使用，盡量使用替代方案；②使用新型的安全器具來替代傳統(tǒng)銳器（如注射器、玻璃勻漿器等）；③使用專用的安全銳器容器；④加強人員培訓、規(guī)范銳器操作；⑤加強過程監(jiān)督，從事使用銳器的實驗活動時，在進入實驗室前特別警示。

2.2.2 嚴控未知暴露 在科特迪瓦發(fā)生的一例感染事件，3名解剖人員在未佩戴口罩、未穿防護服的情況下，2位佩戴乳膠檢查手套的人員未感染，而恰好一位佩戴家用手套的人員事后發(fā)生感染。原文作者分析患者可能是手直接接觸了黑猩猩的血或有液體濺灑到臉上，但由于無法回溯解剖時的詳細情況，該人員感染的確切原因未知。所幸的是在進行適當防護的條件下，包括科特迪瓦22位（18位接觸感染者的人員和其他4位操作黑猩猩器官的人員）和瑞士52位（包括8位感染者家屬朋友和4位護送人員）接觸該感染者的人員，其血清學檢查均為陰性，表明整個治療、護理過程中預防感染的措施是有效的。

在實驗室生物安全事故的歷史長河中，未知暴露曾經(jīng)占有很大比例[13-14]，后來分析其中多數(shù)屬于氣溶膠感染。據(jù)目前所知，自然條件下埃博拉病毒通過接觸患者的血液、體液和皮膚或感染者的尸體傳播[3,15]，而動物實驗則證實了埃博拉病毒等絲狀病毒可通過氣溶膠途徑感染豚鼠和非人靈長類動物[16]。在本次西非埃博拉疫情中，據(jù)報道截止2014年12月17日已有450名醫(yī)護人員感染埃博拉，其中244人死亡，而其中不乏在嚴格個體防護條件下、避免直接接觸仍被感染的醫(yī)護人員。因此，在從事埃博拉實驗活動過程中，不應忽視氣溶膠暴露感染這一在實驗室生物安全中重點防范的暴露途徑。我國在援非抗埃前線圓滿實現(xiàn)了“打勝仗、零感染”的目標，為我們在實驗室做好埃博拉病毒實驗活動的生物安全防護提供了經(jīng)驗。

2.2.3 規(guī)范實驗室管理 事件6即2014年底美國實驗室將埃博拉樣本錯誤傳出實驗室的事件，反映了一系列實驗室管理上存在的漏洞。包括：①實驗操作缺乏充分的安全措施，如研究計劃流程中沒有充分考慮減少人為失誤造成暴露的可能性，沒有對實驗操作進行監(jiān)控導致執(zhí)行過程中出現(xiàn)偏差，以及出現(xiàn)差錯后沒有及時發(fā)現(xiàn)。②實驗室所在機構缺乏實驗室安全和管制劑管理的聯(lián)絡中心，也缺乏項目監(jiān)督和持續(xù)的日常指導。③缺乏采取足夠的最新的實驗室安全保障設備和措施，包括對關鍵安全控制點進行照相等再確認的措施。

經(jīng)過十多年規(guī)范化的管理和運行實踐，我國目前已經(jīng)基本形成一套高級別生物安全實驗室管理和運行的模式，特別是硬件建設方面要求越來越明確，并且能夠通過實驗室自身檢查、職能部門監(jiān)管以及第三方檢測等多種渠道來加以保障。而涉及到實驗室的日常管理以及實驗活動管理，盡管各實驗室已經(jīng)建立了生物安全管理體系，但運行中仍存在諸多薄弱環(huán)節(jié)。一方面體系本身存在缺陷，尚需要進一步完善，更重要的問題則是體系的執(zhí)行不到位，甚至不可排除其中存在僥幸心理，將實驗室生物安全寄希望于運行使用中不出問題，而不是從杜絕事故、問題的苗頭入手。在實驗室生物安全管理中努力加強生物安全文化建設，讓生物安全融入到每一個相關人員的血液中，還有很長的路要走。

2.2.4 風險評估做到實處 一定程度上講，幾乎所有的事故均與缺乏適當?shù)娘L險評估與風險控制有關，即便是人員疏忽或是不執(zhí)行操作規(guī)程，也可歸因于對于人員風險及其控制的不到位。對于計劃開展的實驗活動，如果進行了全面、深入、細致的風險分析，對其發(fā)生的概率和產(chǎn)生的后果有準確的認識，并采取了切實可行的防范措施或是有可以依賴的應急預案，那么絕大多數(shù)的實驗室生物安全事故都可以避免。如本文所述的幾起埃博拉實驗室事件中，都存在缺乏適當?shù)娘L險評估與風險控制問題。

目前我們國內(nèi)運行中的高級別生物安全實驗室，按照國家的有關管理要求，已經(jīng)建立起了一套風險評估與風險控制的機制。但從運行的實際情況來看，各實驗室在風險評估方面還存在很大的差異，如風險發(fā)生的概率和危害程度怎么劃分？風險評估的結果怎么應用到實際運行中去？實驗室運行過程中最不可控的人員風險（包括思想狀態(tài)、情緒波動、心理活動、健康水平）如何把握？這些問題在操作一類病原微生物的實驗活動中，顯得更為關鍵。另一個突出問題則是風險評估和實際操作脫節(jié)，其原因則是部分實驗室風險評估的目的還不僅是為了實際操作中的風險控制，更主要的是為了滿足標準、檢查的要求。因此，掌握風險評估的方法，糾正風險評估的目的，把風險評估做到實處，真正地為控制、減小實驗室運行中的風險服務，這將是風險評估工作在今后的努力目標。

3 我國高級別實驗室建設現(xiàn)狀及規(guī)劃

自2004年《國家高級別生物安全實驗室建設規(guī)劃》發(fā)布以來，我國已形成了高級別生物安全實驗室體系的基本框架，一批生物安全三級實驗室投入運行，已經(jīng)成為傳染病重大專項等科學研究不可或缺的基礎平臺，為我國的烈性與重大傳染病防控、生物防范和產(chǎn)業(yè)發(fā)展做出了重要貢獻。截至2017年1月，我國已建成并通過國家認可的BSL-3實驗室共有48個。2015年1月，我國首個BSL-4實驗室在武漢竣工[17]，2017年1月，該實驗室成為我國獲得認可的首個BSL-4實驗室，標志著我國正式具備開展一類病原體病毒培養(yǎng)和動物感染等研究工作的條件。

面臨復雜多變的國際生物安全形勢，為貫徹落實總體國家安全觀，圍繞烈性、突發(fā)、外來、熱帶傳染病病原體的監(jiān)測預警、檢測、消殺、防控、治療五大環(huán)節(jié)的需求，國家發(fā)改委、科技部于2016年11月30日印發(fā)了《高級別生物安全實驗室體系建設規(guī)劃（2016-2025年）》[18]，計劃在現(xiàn)有基礎上建設一系列的生物安全實驗室，包括5～7個四級實驗室，到2025年形成高級別生物安全實驗室國家體系，增強生物安全科技創(chuàng)新能力。

4 結語

高級別生物安全實驗室的建設與運行，為從事高致病性病原微生物實驗活動提供了安全平臺，同時也需要實驗室做好設施設備使用維護、人員培訓考核與醫(yī)學監(jiān)督以及實驗活動的風險評估、安全管理和應急預案等各方面的工作。一旦實驗室運行保障或?qū)嶒灢僮鬟^程中某一環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，就可能引發(fā)嚴重的生物安全事故，并帶來生命財產(chǎn)的巨大損失。

隨著我國高級別生物安全實驗室建設的不斷推進，必將有越來越多的BSL-3和BSL-4實驗室投入運行，從而使我們國家在傳染病防控、突發(fā)公共衛(wèi)生事件應對中具備更強的能力，并在與病原微生物相關的國際事務中發(fā)揮越來越重要的作用。但目前我國尚缺乏BSL-4實驗室的運行經(jīng)驗，我們還需要不斷地通過廣泛借鑒國外BSL-4實驗室的經(jīng)驗并汲取教訓，來提高我們高級別生物安全實驗室管理和運行的水平。有效確保高級別生物安全實驗室的運行安全，保障相關人員及環(huán)境的安全，是我們的責任；尊重科學、汲取教訓，從國內(nèi)外實驗室生物安全事故中發(fā)現(xiàn)實驗室生物安全的規(guī)律和真諦，并應用到實踐中去，通過制定科學的標準法規(guī)、適宜的技術規(guī)程保障實驗室運行安全，是我們始終追求的目標。

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[7]Miller J.Russian scientist dies in Ebola accident at former weapons lab[EB/OL].http://www.nytimes.com/2004/05/25/world/russian-scientist-dies-in-ebola-acci?dent-at-former-weapons-lab.html.[2016-12-30]

[8]Stone R.Russian scientist dies after Ebola lab acci?dent[J].Science,2004,304:1225b.

[9]Günther S,Feldmann H,Geisbert T W,et al.Man?agementofaccidentalexposure to Ebola virus in the biosafety level4 laboratory,Hamburg,Germany [J].J Infect Dis,2011,204(Suppl 3):S785-S790.

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[12]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局,中國國家標準化管理委員會.實驗室生物安全通用要求（GB 19489-2008）[S].北京:中國標準出版社,2008.

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[17]中國新聞網(wǎng).中國建成亞洲首個P4實驗室[EB/ OL].http://www.chinanews.com/sh/2015/01-31/7022623.shtml.[2016-12-30]

[18]國家發(fā)展改革委,科技部.關于印發(fā)高級別生物安全實驗室體系建設規(guī)劃（2016-2025年）的通知[EB/OL].http://www.sdpc.gov.cn/gzdt/201612/t20161220_830461.html.[2016-12-30]

Lessons and Learning from Ebola Virus Laboratory Acci?dents

JIN Xiao-Jun1，2,XIE Shuang1,CHENG Hong-Liang1,LI Jing-Jing1,LU Bing1，2*
1.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100071;
2.Department of Science and Technology,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100071;China
*Corresponding author,E-mail:13693506666@163.com

In China,laboratory activities relating to Class I pathogen,such as Ebola virus cultivation and ani?mal infection have the chance to be taken in the newly completed BSL-4 laboratory in the near future.We try to learn from the reported Ebola virus laboratory accidents in history so as to provide more practical information for high-risk pathogen operators.In this paper,firstly we listed these accidents,then we briefly summarized,andana?lyzed the causing reasons.Finally,based on these reflections and supported with general requirements of laborato?ry biosafety management,we put forward the preventive strategies suitable for BSL-4 laboratory.

Ebola virus;laboratory accidents;laboratory biosafety

R373

A

1009-0002（2017）01-0016-07

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.01.004

2017-01-12

國家重點研發(fā)計劃“生物安全關鍵技術研發(fā)”重點專項（2016YFC1202600）

靳曉軍（1987-），男，博士研究生

陸兵，（E-mail）13693506666@163.com