丁 芹

甘肅省張掖市疾病預防控制中心 甘肅省張掖市 734000

多重PCR檢測在多種常見腸道致病菌中的效果觀察

丁 芹

甘肅省張掖市疾病預防控制中心 甘肅省張掖市 734000

目的：探討多重PCR檢測在多種常見腸道致病菌中的應用效果。方法：取四種常見的腸道致病菌作為研究對象，包括：大腸桿菌O157、副溶血性孤菌、普通變形桿菌、單核細胞增生李斯特菌等，采用多重PCR法對四種腸道致病菌進行檢測，并與臨床模擬樣品進行驗證，分析多重PCR檢測在多種常見腸道致病菌中的應用效果。結果：單重PCR結果顯示：對于變形桿菌擴增出大小為522bp的特異性片段；單核細胞增生李斯特菌擴增出大小為155bp的特異性片段；大腸桿菌O157擴增出大小為366bp的特異性片段；副溶血性孤菌擴增出大小為199bp的特異性片段。多重PCR結果測定顯示：大腸桿菌O157、副溶血性孤菌、普通變形桿菌、單核細胞增生李斯特菌特異性表明只有該四種菌擴增出特異性條帶，其他均為陰性；靈敏度結果顯示：多重PCR測定菌落計數(shù)數(shù)量級為103CFU/mL。結論：將多重PCR技術用于多重常見腸道致病菌中效果理想，能快速、準確的篩查致病菌，為臨床治療提供依據(jù)。

多重PCR檢測；腸道致病菌；應用效果

近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，人們對于食品安全問題提出了更高的要求，而食源性致病菌是威脅食品安全的重要原因，包括：大腸桿菌O157、副溶血性孤菌、普通變形桿菌、單核細胞增生李斯特菌等[1]。傳統(tǒng)的腸道致病菌采用生理、生化、血清型水平方法測定，這些方法雖然能幫助患者確診，但是測定所需周期較長，耗時也相對較多，靈敏度受到限制。因此，需要建立一種快速、簡單、靈敏度高的檢測手段實現(xiàn)腸道致病菌的鑒別。文獻報道顯示：將多重PCR檢測用于腸道致病菌中效果理想，能實現(xiàn)不同病原菌的檢測，為臨床疾病治療提供依據(jù)和參考，但是該結論尚未得到進一步證實[2]。為了探討多重PCR檢測在多種常見腸道致病菌中的應用效果。取2015年1月-2016年9月醫(yī)院四種腸道致病菌作為研究對象，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

菌種及來源。副溶血性孤菌、普通變形桿菌及蠟樣芽胞桿菌均由北京蘭博瑞公司提供；大腸桿菌O157、單核細胞增生李斯特菌、傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等均由疾病預防控制中心提供。

1.2 儀器及試劑

試驗中使用的儀器和試劑包括：DNA提取試劑盒、PCR試劑（北京全式金生物有限公司）；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、血平板、溶菌肉湯液體培養(yǎng)基等（北京陸橋技術有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱、水浴箱（德國進口）；離心機、梯度PCR儀器（德國進口）。

1.3 方法

采用多重PCR法對四種腸道致病菌進行檢測，并與臨床模擬樣品進行驗證。（1）菌株培養(yǎng)及DNA培養(yǎng)。菌株培養(yǎng)過程中，將大腸桿菌及變形桿菌采用營養(yǎng)瓊脂進行培養(yǎng)，37℃下培養(yǎng)，挑選出可用的3-5個菌種，將其接種在LB液體培養(yǎng)基中，完成DNA的提取。（2）引物的設計與合成。將四種腸道致病菌的基因序列進行提取，通過對比，篩選出不同的特異基因作為靶序列，根據(jù)靶序列形式設計出相應的引物。（3）單重PCR擴增及多重PCR建立。對大腸桿菌O157、副溶血性孤菌、普通變形桿菌、單核細胞增生李斯特菌四種致病菌進行單獨擴增，呈現(xiàn)反應體系，其擴增條件在90℃預變性2.5min；90℃下變性30s，65℃退火30s，75℃延伸30s，連續(xù)進行36個循環(huán)，75℃下進行10min延伸。在單重PCR基礎上建立多重PCR體系，根據(jù)電泳帶的亮度確定最佳退火溫度。（4）多重PCR檢測。將所有的菌群放入同一反應體系中，實施多重PCR擴增。多重PCR反應靈敏性檢測是將4種不同的腸道致病菌群進行24h培養(yǎng)，取出懸液，根進行梯度稀釋，然后根據(jù)1:3:3比例提取DNA，根據(jù)優(yōu)化后的多重體系進行反應，實施多重PCR檢測[3]。

2 結果

2.1 單重PCR結果

單重PCR結果顯示：對于變形桿菌擴增出大小為522bp的特異性片段；單核細胞增生李斯特菌擴增出大小為155bp的特異性片段；大腸桿菌O157擴增出大小為366bp的特異性片段；副溶血性孤菌擴增出大小為199bp的特異性片段。

2.2 多重PCR結果測定溫度的設定

采用梯度PCR儀依次設定退火溫度，PCR產(chǎn)物結果顯示：64℃對應的條帶最亮、最清晰，提示：64℃位最佳退火溫度，見圖1。

2.3 多重PCR結果測定靈敏度、特異度

多重PCR結果測定顯示：大腸桿菌O157、副溶血性孤菌、普通變形桿菌、單核細胞增生李斯特菌特異性表明只有該四種菌擴增出特異性條帶，其他均為陰性；靈敏度結果顯示：多重PCR測定菌落計數(shù)數(shù)量級為103CFU/mL，見圖2。

3 討論

近年來，多重PCR技術在多重常見腸道致病菌中得到應用，且效果理想。多重PCR反應時在同一個反應體系中加入幾種目的基因的引物，通過一次反應實現(xiàn)對多重目的基因的同時擴增。由于一個反應體系中不同的基因組之間、不同的引物之間會存在相互影響，必須對多重PCR體系進行重新優(yōu)化，包括：反應中各個組分的濃度、退火溫度等，通過PCR技術能測定腸道的病原菌類型，為臨床治療提供依據(jù)和參考。

綜上所述，將多重PCR技術用于多重常見腸道致病菌中效果理想，能快速、準確的篩查致病菌，為臨床治療提供依據(jù)。

圖1：多重PCR結果測定溫度的設定

圖2：多重PCR結果測定靈敏度

[1]傅翔.幾種常見腸道致病菌多重PCR檢測的效果評價[J].醫(yī)學信息,2016,29(01):160-161.

[2]胡茂秀,王莎莎,俞超,等.雞糞中沙門氏菌和大腸桿菌O78多重PCR檢測方法的建立[J].中國預防獸醫(yī)學報,2016,38(01):58-62.

[3]燕雯雯,沈繼錄,李曉峰，等.多重實時PCR檢測腹膜透析相關性腹膜炎致病菌的應用分析[J].安徽醫(yī)科大學學報,2016,51(05):712-717.

丁芹，女，主管檢驗師。