李奇恒，蘇繼源，丁 茹，賀治青，梁 春，吳宗貴

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)論著/研究·

痰瘀同治方藥對(duì)高脂血癥小鼠脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制研究

李奇恒，蘇繼源，丁 茹，賀治青，梁 春，吳宗貴

目的 觀察復(fù)方中藥對(duì)高脂血癥模型小鼠脂質(zhì)代謝的調(diào)控作用及機(jī)制。方法 選取60只雄性C57小鼠，隨機(jī)分為3組：高脂飲食組、高脂+復(fù)方中藥組、高脂+他汀組，單純高脂飲食喂養(yǎng)制備模型。模型制備成功后連續(xù)灌藥12周后，觀察各組間小鼠血漿膽固醇、膽汁酸及相關(guān)基因表達(dá)的變化。結(jié)果 與高脂飲食組小鼠相比，復(fù)方中藥治療組小鼠血漿總膽固醇水平顯著降低(P<0.05)，但有關(guān)肝臟HMG-GA還原酶(HMGR)水平則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，同時(shí)伴有末端回腸頂端鈉依賴性膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(ASBT)基因表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)，與高脂模型及阿托伐他汀治療組小鼠相比，復(fù)方中藥組小鼠肝臟膽鹽輸出泵(BSEP)基因的表達(dá)有顯著上升(P<0.05)。結(jié)論 復(fù)方中藥可顯著降低高脂血癥小鼠的血漿膽固醇，增加糞便中次級(jí)膽汁酸的濃度，其可能機(jī)制是通過抑制腸細(xì)胞ASBT基因表達(dá)以及上調(diào)肝臟BSEP基因綜合作用的結(jié)果。

高膽固醇血癥；痰瘀同治方；膽汁酸腸肝循環(huán)；膽鹽輸出泵

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)作為全球性流行的高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的疾病嚴(yán)重危害人類健康。究其原因高膽固醇血癥是致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)生進(jìn)展的重要危險(xiǎn)因素之一。多個(gè)隨機(jī)對(duì)照研究證實(shí)他汀、PCSK9抑制劑、膽酸螯合劑等降低血膽固醇水平的藥物，可顯著降低動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病的發(fā)生率。

膽汁酸在脂質(zhì)代謝中起重要作用，其可促進(jìn)食物中脂肪和脂溶性維生素在腸道的吸收。膽固醇在肝內(nèi)轉(zhuǎn)化為膽汁酸。肝內(nèi)膽汁酸主要通過膽鹽輸出泵(bile salt export pump，BSEP)泵入膽囊內(nèi)儲(chǔ)存。當(dāng)食物進(jìn)入腸道后其釋放進(jìn)入腸道促進(jìn)脂質(zhì)和脂溶性維生素的消化吸收[1]。在末端回腸初級(jí)膽汁酸通過厭氧菌轉(zhuǎn)化為次級(jí)膽汁酸。在腸道內(nèi)約5%的次級(jí)膽汁酸隨糞便排出，這是人體最重要的消除膽固醇的方式[2]。而其余95%的膽汁酸通過末端回腸上的頂端鈉依賴性膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(apicalsodium-dependent BA uptake transporter，ASBT)主重吸收通過門靜脈重新回流至肝臟。次級(jí)膽汁酸相較初級(jí)膽汁酸具有更高的毒性，這可能與其較高的疏水性密切相關(guān)[3]，例如脫氧氧膽酸和石膽酸，系列研究揭示其在結(jié)直腸癌、肝癌、膽固醇性膽石癥中具有促進(jìn)作用[4-7]。

中醫(yī)亦對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)行了深入的研究。中醫(yī)研究發(fā)現(xiàn)血瘀在斑塊破裂后并發(fā)血栓時(shí)表現(xiàn)最為顯著，而在AS發(fā)生以及斑塊形成早期以富含脂質(zhì)軟斑塊為主要病理特征時(shí)，則以痰濁為重。據(jù)此，從“從痰論治”的角度，提出“痰瘀同治”的治法原則，對(duì)“治瘀”和“治痰”兩者兼顧，將治療時(shí)間窗從“活血化瘀”提前到“痰瘀同治”。以漢代張仲景所著《金匱要略》一書中著名方劑栝樓薤白白酒湯為基礎(chǔ)，結(jié)合現(xiàn)代西醫(yī)學(xué)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化認(rèn)識(shí)和治療的新進(jìn)展，對(duì)配方進(jìn)行優(yōu)化，形成了新型“痰瘀同治”方藥(以下簡稱復(fù)方中藥)。本研究觀察復(fù)方中藥調(diào)節(jié)高脂血癥小鼠膽固醇的作用，并初步探索其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 動(dòng)物與試劑 SPF級(jí)雄性C57小鼠60只，8周齡，20 g左右。復(fù)方中藥膠囊：由上海長征醫(yī)院制劑室提供，每粒含藥粉0.35 g；阿托伐他汀鈣片(立普妥，輝瑞公司)；特殊高脂飼料(常州開源動(dòng)物飼料有限公司，D12109C，致高血脂小鼠特殊飼料)；L-苯丙氨酸購自Sigma公司；石膽酸、熊脫氧膽酸、脫氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)品均購自Sigma公司。

1.1.2 分組、造模及給藥 60只小鼠隨機(jī)分為3組：高脂飲食組、高脂+復(fù)方中藥組以及高脂+他汀組。適應(yīng)喂養(yǎng)2周后采用給予特殊高脂誘導(dǎo)高血脂，高脂喂養(yǎng)兩月經(jīng)隱靜脈采血測定血漿總膽固醇(TC)，剔除血脂正常小鼠。藥物干預(yù)組小鼠經(jīng)口灌胃給藥，連續(xù)12周，每日一次。各組給藥劑量分別為：阿托伐他汀10 mg/(kg·d)和復(fù)方中藥0.27 kg/(kg·d)，高脂飲食組用等體積生理鹽水灌胃。末次給藥24 h后處死小鼠，留取血漿、糞便、末端回腸、肝臟等組織。

1.2 血漿膽固醇的測定 實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)頸動(dòng)脈采集全血，離心分離血漿，采用酶法檢測盒檢測不同組小鼠TC水平。

1.3 UPLC-MS/MS測定膽汁酸

1.3.1 UPLC-MS/MS條件 色譜條件：流動(dòng)相：0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)；洗脫梯度：0～4 min 5%～70%B；4～8 min 70%B；8～9 min 70%～98%B；9～10 min 98%B流速 0.4 mL/min；進(jìn)樣量 3 μL；柱溫 25℃；質(zhì)譜條件為：氣簾氣 30℃；碰撞氣 8℃；電噴霧電壓 4 500 V；溫度55℃；離子源輔助氣1為55 ℃；離子源輔助氣2為55 ℃。

1.3.2 樣品處理 取糞便樣本10 mg，加入1 mL含內(nèi)標(biāo)100 ng/mL的甲醇溶液超聲溶解10 min，離心(13 000 r/min，4 ℃)10 min，取上清液得到含內(nèi)標(biāo)濃度100 ng/mL樣品溶液。

1.4 Real-Time PCR

1.4.1 RNA提取及CDNA的反轉(zhuǎn) 所有組織(肝、腸)的RNA的提取按照TaKaRa試劑盒說明書提供的提取RNA。根據(jù)PrimeScript?RT Master Mix 試劑盒的說明，配制10 μL反應(yīng)體系。逆轉(zhuǎn)錄全程需在冰板上操作。

1.4.2 Real Time qPCR反應(yīng) 根據(jù)SYBR?PremixEx TaqTM 試劑盒說明，配制10 μL 反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃，3 min；反應(yīng)階段95℃，15 s，60℃，45 s，循環(huán)數(shù)40；溶解階段60℃，5 s，95℃，0.5℃/5 s。引物序列：以下引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成。詳見表1。

表1 定量引物序列

2 結(jié) 果

2.1 復(fù)方中藥降低高脂血癥小鼠血漿總膽固醇水平分析 復(fù)方中藥及阿托伐他汀治療組血漿總膽固醇水平較高脂飲食組均有顯著降低(P<0.05)，但藥物干預(yù)兩組間總膽固醇水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖1。

阿托伐他汀組肝臟HMG-CoA還原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMGR) 基因表達(dá)水平較高脂飲食組及復(fù)方中藥組均有顯著降低(P<0.05)，但復(fù)方中藥治療組與高脂飲食組肝臟HMGR水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖2。復(fù)方中藥降脂的作用機(jī)制與他汀不同，可能存在其他機(jī)制。

與高脂模型組比較，*P<0.05。

與高脂模型組相比，*P<0.05；與復(fù)方中藥治療組小鼠比較，#P<0.05。

2.2 復(fù)方中藥對(duì)高脂血癥小鼠糞便膽汁酸譜的影響 高脂+復(fù)方中藥組糞便次級(jí)膽汁酸(石膽酸、脫氧膽酸、熊脫氧膽酸)濃度較高脂飲食組及高脂+阿托伐他汀治療組均顯著上升(P<0.05)。高脂飲食組和高脂+阿托伐他汀組糞便次級(jí)膽汁酸濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表 2。

組別n糞便次級(jí)膽汁酸濃度(ng/g)高脂飲食組103616.65±791.861)高脂+復(fù)方中藥組107924.46±815.39高脂+阿托伐他汀組104796.02±742.871) 與高脂+復(fù)方中藥組相比,1)P<0.05。

2.3 復(fù)方中藥改變高脂血癥小鼠膽汁酸腸肝循環(huán)相關(guān)基因的表達(dá) 高脂+復(fù)方中藥組末端回腸的ASBT基因表達(dá)水平較高脂飲食組及高脂+阿托伐他汀組均有顯著下降(P<0.05)。詳見圖3A。高脂+復(fù)方中藥組肝臟Bsep基因的表達(dá)水平較高脂飲食組及阿托伐他汀組均有顯著上升(P<0.05)。詳見圖3B。高脂飲食組和高脂+阿托伐他汀治療組ASBT和Bsep的基因表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖3。

與高脂+復(fù)方中藥組比較，*P<0.05。

3 討 論

高脂血癥是動(dòng)脈粥樣硬化和相關(guān)疾病發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素[8]。高膽固醇水平的升高，公認(rèn)為在一系列的慢性疾病(包括動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)退行性病變、糖尿病等)的發(fā)生和發(fā)展中起決定性作用[9]。多個(gè)研究顯示服用降低膽固醇的藥物，可顯著降低動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病的發(fā)生率。他汀是應(yīng)用最廣的降低膽固醇的藥物，其主要通過抑制膽固醇合成的限速酶HMG-CoA還原酶來降低血膽固醇，但其療效在不同個(gè)體之間有一定差異，臨床中也常見病人對(duì)其不耐受的現(xiàn)象。近年來多個(gè)新型降膽固醇藥物的面世，研究表明輔助他汀進(jìn)一步降低了血膽固醇水平，使患動(dòng)脈粥樣硬化及其相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)一步降低。本實(shí)驗(yàn)比較不同干預(yù)下血漿膽固醇證明復(fù)方中藥具有顯著降低血漿膽固醇的作用。復(fù)方中藥對(duì)肝臟HMG-CoA還原酶的基因表達(dá)無顯著影響，提示其降低膽固醇的作用機(jī)制不同于他汀。

在正常個(gè)體中，90%的初級(jí)膽汁酸包括：膽酸(cholic acid，CA)和鵝脫氧膽酸(chenodeoxycholicacid，CDCA)通過經(jīng)典通路合成。膽固醇通過膽固醇7固醇羥化酶轉(zhuǎn)化為膽汁酸，膽固醇7固醇羥化酶是CA和CDCA合成的限速酶。大部分的膽汁酸一旦合成就立即在肝內(nèi)同甘氨酸和牛磺酸結(jié)合。結(jié)合膽汁酸主要通過膽鹽輸出泵將膽汁酸從肝臟輸送至膽囊內(nèi)。膳食，特別是那些含有脂肪的食物，刺激腸細(xì)胞分泌膽囊收縮素，促進(jìn)膽汁酸分泌到十二指腸。大于95%的膽汁酸通過ASBT被腸細(xì)胞重吸收。大約5%的膽汁酸在腸道通過腸道菌群酶轉(zhuǎn)化為次級(jí)膽汁酸，主要有脫氧膽酸(deoxycholic acid，DCA)、石膽酸(litocholicacid，LCA)、?；敲撗跄懰?taurodeoxycholic acid，TDCA)、熊脫氧膽酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)等。這些膽汁酸主要隨糞便排出體外，為人體最重要的消除膽固醇的方式。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，高脂血癥與脾腎關(guān)系密切，因脾為后天之本，氣血生化之源，精液輸布之樞紐，根據(jù)“脾主運(yùn)化”的機(jī)制，高脂血癥的形成與脾的關(guān)系緊密。《證治匯補(bǔ)》言：“脾虛不運(yùn)清濁，停留精液而痰生?！倍I主一身之陽氣，為氣化之源，五臟之根，腎主精液的存儲(chǔ)、分布、利用及精液、精、血之間的轉(zhuǎn)化起主導(dǎo)作用。清代醫(yī)家趙延儒在《趙李合璧·雜癥門》中云：“夫痰者水也，其本在腎，其標(biāo)在脾……故脾、腎一虛，其痰必多?！庇纱丝梢娖⒛I是影響脂濁成化之關(guān)鍵，脾不健運(yùn)和腎氣不足是引起高脂血癥的主要病機(jī)。高脂血癥導(dǎo)致人體臟腑組織功能失調(diào)，其致病因素并不是血脂本身，而是由血脂引起的病理產(chǎn)物痰濁、瘀血所為[10]。痰生成的內(nèi)因是臟腑功能失調(diào)，從遺傳角度講中醫(yī)體質(zhì)狀況如“肥人多痰”也是重要因素[11]。高脂血癥以及高血糖等AS 致病因素可稱之“血中之痰濁”。而腸道中的過多的脂質(zhì)、膽汁酸等可稱之為“腑中之痰濁”，在AS的發(fā)生發(fā)展中亦起重要作用。我們從“從痰論治”的角度，提出“痰瘀同治”的治法原則，對(duì)“治瘀”和“治痰”兩者兼顧。由此，我們以漢代張仲景所著《金匱要略》一書中著名方劑栝樓薤白白酒湯為基礎(chǔ)，結(jié)合現(xiàn)代西醫(yī)學(xué)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化認(rèn)識(shí)和治療的新進(jìn)展，在古方中加入三七、紅曲等多味中藥材，形成了新型方藥，前期研究他汀藥物調(diào)節(jié)血脂的同時(shí)引起肝內(nèi)脂質(zhì)沉積，而復(fù)方中藥在調(diào)節(jié)血脂的同時(shí)無此現(xiàn)象，由此，推測復(fù)方中藥不是通過抑制膽固醇合成而是通過抑制吸收及促進(jìn)其分解代謝而控制血脂，根據(jù)中醫(yī)“實(shí)則下之”、“瘀則通之”的理論，對(duì)屬標(biāo)實(shí)、瘀滯的AS，考慮復(fù)方中藥作用機(jī)制可能亦包括對(duì)腸道的作用，對(duì)瘀于腸道中的“痰濁”下之通之，即抑制腸道中脂質(zhì)的吸收，促進(jìn)脂質(zhì)代謝產(chǎn)物膽汁酸的排泄。

本研究表明，復(fù)方中藥可顯著降低高脂血癥小鼠的血漿總膽固醇，增加糞便中膽汁酸的含量，其可能是通過抑制腸細(xì)胞ASBT基因的表達(dá)，促進(jìn)肝臟BSEP基因的表達(dá)綜合作用的結(jié)果。但膽汁酸肝腸循環(huán)及膽固醇代謝較為復(fù)雜，仍需進(jìn)一步研究探究復(fù)方中藥改善高膽固醇血癥的相關(guān)機(jī)制。

[1] Zhang Y，Klaassen CD.Effects of feeding bile acids and a bile acid sequestrant on hepatic bile acid composition in mice[J].J Lipid Res，2010，51(11)：3230-3242.

[2] Li Y，Jadhav K，Zhang Y.Bile acid receptors in non-alcoholic fatty liver disease[J].Biochem Pharmacol，2013，86(11)：1517-1524.

[3] Song P，Zhang Y，Klaassen CD.Dose-response of five bile acids on serum and liver bile acid concentrations and hepatotoxicty in mice[J].Toxicol Sci，2011，123(2)：359-367.

[4] Powolny A，Xu J，Loo G.Deoxycholate induces DNA damage and apoptosis in human colon epithelial cells expressing either mutant or wild-type p53[J].Int J Biochem Cell Biol，2001，33(2)：193-203.

[5] Ridlon JM，Kang DJ，Hylemon PB.Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria[J].J Lipid Res，2006，47(2)：241-259.

[6] McGarr SE，Ridlon JM，Hylemon PB.Diet，anaerobic bacterial metabolism，and colon cancer： a review of the literature[J].J Clin Gastroenterol，2005，39(2)：98-109.

[7] Bajor A，Gillberg PG，Abrahamsson H.Bile acids： short and long term effects in the intestine[J].Scand J Gastroenterol，2010，45(6)：645-664.

[8] Mannu GS，Zaman MJ，Gupta A，et al.Evidence of lifestyle modification in the management of hypercholesterolemia[J].Curr Cardiol Rev，2013，9(1)：2-14.

[9] Poli G，Biasi F，Leonarduzzi G.Oxysterols in the pathogenesis of major chronic diseases[J].Redox Biol，2013，1：125-130.

[10] 錢小奇.試論高脂血癥的病因病機(jī)[J].天津中醫(yī)，2002，19(6)：50-52.

[11] 宋劍南.中醫(yī)藥防治動(dòng)脈粥弱硬化研究進(jìn)展[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2009，9(11)：71-74.

(本文編輯王雅潔)

Effects of Tanyu Tongzhi Prescription on Lipid Metabolism in Hyperlipidemic Mice and Its Mechanisms

Li Qiheng， Su Jiyuan， Ding Ru， He Zhiqing， Liang Chun， Wu Zonggui

Shanghai Changzheng Hospital， Second Military Medical University， Shanghai 200003，China

Wu Zonggui

Objective To investigate the effects and mechanism of Tanyu Tongzhi prescription (TTP) on lipid metabolism in hyperlipidemic mice.Methods Sixty male C57 mice were randomly divided into three groups:HFD group (group A) fed with high fat diet， HFD plus TTP group (group B) given with high fat diet and TTP， HFD plus statin (group C) group fed with high fat and statin.After 12 weeks of administration， the changes of plasma cholesterol， bile acid and related genes expression were observed.Results Compared with group A，the levels of plasma total cholesterol and the expressions of gut apicalsodium-dependent BA uptake transporter (ASBT) gene were significantly decreased in group B (P<0.05).Compared with group A and group C， the expressions of bile salt export pump (BSEP) gene in liver were significantly increased in group B (P<0.05).Conclusion TTP could reduce plasma cholesterol and increase fecal secondary bile acid， which might be attributed to gut ASBT expression inhibition and liver BSEP expression up-regulation.

hyperlipidemia；Tanyu Tongzhi prescription；bile acid enterohepatic circulation

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81130065、91539118、81473445)；上海市科委中醫(yī)引導(dǎo)性項(xiàng)目(No.15401931500)

上海長征醫(yī)院(上海200003)

吳宗貴，E-mail：wu_zonggui@yeah.net

R589.2 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.06.008

1672-1349(2017)06-0663-04

2017-02-10)

引用信息：李奇恒，蘇繼源，丁茹，等.痰瘀同治方藥對(duì)高脂血癥小鼠脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(6)：663-666.