石志剛++萬如++李彥龍++王亞軍

摘要：采用改進CTAB法提取枸杞（Lycium Chinense Mill.）葉片DNA，利用合成的特異引物對其DNA中nrDNA ITS區(qū)進行擴增，利用ITS條形碼序列，對枸杞屬種質資源進行鑒定，分析其親緣關系。結果表明，測序得到了17份枸杞屬近緣種的ITS條形碼序列，整個ITS序列長度變異范圍為603～632 bp，平均為624 bp，整個轉錄間隔區(qū)（ITS1+ITS2）對位排列后總長度為480 bp，有194個變異位點，占40%；保守位點288個，占60%。聚類分析結果表明，17份種質資源可分為5個大類群?；贗TS條形碼序列分析在鑒定枸杞屬種質遺傳多樣性及其親緣關系具有一定的優(yōu)越性。

關鍵詞：枸杞屬（Lycium L.）；ITS序列；DNA測序；鑒定

中圖分類號：S567.1+9 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）22-5966-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.22.059

Identification of Lycium L. Germplasm Resources Based on nrDNA ITS Sequence

SHI Zhi-gang，WAN Ru，LI Yan-long，WANG Ya-jun

（Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Yinchuan 750002，China）

Abstract：Adopting improved CTAB to acquire DNA of leaf of Lycium Chinense Mill.，and making use of composite special primers to propagate and clone nrDNA ITS area of DNA，and then sequencing analysis of the target segment. To identify genetic diversity of Lycium L. germplasm resources by the nrDNA ITS sequence. The results showed that the nrDNA ITS sequence of 17 Lycium L. was gained for the first time；the variation length of the whole ITS sequence was 603 to 632 bp，and the average was 624 bp； the total length of whole transcribe partition area（ITS1 and ITS2） sequence alignmentwas 480 bp，and there were 194 variable sites accounting for 40.4%， and 286 conserved sitesaccounting for 59.6%. Based on the nrDNA ITS sequence analysis of 17 Lycium L. germplasm resources，it was obvious that they could be divided into 5 groups. The nrDNA ITS sequence analysis is a advantageous way to study genetic diversity among Lycium L. germplasm resources.

Key words：Lycium L.； Internal transcribed spacer； measure the sequence of DNA； identification

枸杞（Lycium Chinense Mill.）屬于茄科（Solanaceae）族（Solaneae Reichb.）枸杞屬（Lycium L.），枸杞屬植物在全球的分布約有80種，多分布于南、北美洲，以美國亞利桑那州和阿根廷形成兩個分布中心；歐亞大陸約10余種。中國多數(shù)種類分布于西北與華北，中國分布的枸杞屬有7種3變種[1]，寧夏農(nóng)林科學院建成世界惟一的枸杞種質資源圃，保存了國內外分布的7種3變種2 000余份、近2萬余株枸杞種質資源。收集保存的枸杞屬種質資源種類繁多，傳統(tǒng)的單純依靠形態(tài)學的方法難以做出精確鑒別。由于ITS序列進化快，能更精確地對枸杞資源進行遺傳分析，近年來被廣泛用于種間或種內遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育關系分析[2]。本研究以保存于寧夏枸杞種質資源圃的17份枸杞種質資源為試材，利用ITS條形碼序列，對枸杞屬種質資源進行鑒定，分析其親緣關系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以收集保存在寧夏農(nóng)林科學院枸杞中心枸杞種質資源圃內的17份枸杞屬種質資源為試材，其中，美國枸杞為從美國收集到的枸杞屬種質資源，韓國枸杞為從韓國收集到的枸杞屬種質資源，其余為中國分布的枸杞種質資源，具體見表1。

1.2 試驗方法

采用CTAB法[3，4]進行DNA提取方法。依據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的茄科植物nrDNA ITS序列，設計如下引物：P1：5′-AACCTGCGGAAGGATCATTGTC-3′，P2：5′-TGATATGCTTAAACTCAG CGGGTA-3′，以上述引物對17個供試材料的基因組DNA基因PCR擴增，擴增體系為：2.5 μL 10×PCR Buffer（Mg2+），0.5 μL dNTPs，P1和P2（20 μmol/L）各1 μL，Taq酶1.5 U，模板DNA 50 ng，加ddH2O補足至25 μL。

PCR反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s（退火溫度可在58～60 ℃之間調節(jié)），72 ℃延伸45 s，36個循環(huán)；72 ℃保溫7 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，用DNA膠回收試劑盒（購于北京博大生物技術有限公司產(chǎn)品）對約650 bp的目標條帶進行回收。將回收產(chǎn)物連接于T載體（pGEM-T），轉入大腸桿菌，采用藍白斑法篩選陽性菌落。對陽性菌落進行PCR檢測后送往北京奧科公司和北京六合通經(jīng)貿有限公司測序。

1.3 17份枸杞屬種質資源發(fā)育進化樹的構建

采用MEGA4.0分析軟件對17份ITS測序結果構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 枸杞屬17份種質資源ITS區(qū)序列長度和變異信息

國產(chǎn)枸杞屬不同種植物中，整個ITS序列長度變異范圍為603～632 bp，平均為624 bp。整個ITS1序列長度變異范圍為225～253 bp，平均為247 bp。整個5.8S nrDNA序列長度變異范圍都為154 bp。整個ITS2序列長度變異范圍為207～225 bp，平均為223 bp。整個ITS區(qū)排序后的總長度為634 bp，其中ITS1，5.8S和ITS2排序后的長度分別為255、154和225 bp。將gap（空位）作missing（缺失）處理時，由于5.8S nrDNA序列過于保守，不適于用作系統(tǒng)發(fā)育分析，因而在本研究中利用ITS1和ITS2區(qū)序列進行統(tǒng)計發(fā)育分析。整個轉錄間隔區(qū)（ITS1+ITS2）對位排列后總長度為480 bp，共有192個變異位點，變異位點分別為103和89個，占40.0%；保守位點288，占60.0%；有43個信息位點，占9.0%，105個轉換位點，58個顛換位點，其中ITS1區(qū)的信息位點所占比例略高于ITS2區(qū)，而ITS2區(qū)的轉換/顛換比值高于ITS1區(qū)。17種枸杞屬種質資源ITS序列特征如表2所示。

2.2 枸杞屬17份種質資源親緣關系分析

對枸杞屬17份種質資源的ITS區(qū)堿基序列進行聚類分析，結果如圖1所示。從聚類圖中可以看出，枸杞屬17份種質資源的親緣關系與差異，明顯的分為5個大類群：第一類群，以“寧杞1號”為代表的寧夏枸杞與截萼枸杞、柱筒枸杞、紫柄枸杞、北方枸杞變種構成親緣關系較近的一支；第二類群，“黑果枸杞”和中寧黑果、青海黑果、黃果枸杞變種構成一支；第三類群，中國枸杞自成一支。第四類群，新疆枸杞、紅枝枸杞變種、韓國枸杞、蔓生枸杞、云南枸杞、常熟枸杞等構成親緣關系較近的一支；第五類群，美國枸杞自成一支。通過ITS條形碼序列能將不同親緣關系的枸杞屬近緣種種質資源區(qū)分開來。

3 小結與討論

3.1 17份枸杞屬種質資源的遺傳多樣性

由于17份種質同屬于枸杞屬近緣種，在遺傳多樣性鑒定評價過程中，植物學或農(nóng)藝性狀易受環(huán)境和栽培措施的影響不易鑒別，同時細胞學性狀多態(tài)性不豐富，同工酶性狀有器官特異性且受生長發(fā)育階段的影響，具有一定的局限性。分子標記方法的出現(xiàn)，為資源鑒定評價提供了新的方法，本研究利用真核細胞中18S、5.8S、28S RNA基因的保守區(qū)序列，設計PCR引物成功擴增出整個ITS區(qū)，并完成了擴增產(chǎn)物的DNA堿基序列的測定，得到17份枸杞屬近緣枸杞種ITS區(qū)的完整序列，基于ITS序列分析得出17份種質整個轉錄間隔區(qū)（ITS1+ITS2）對位排列后總長度為480 bp，共有192個變異位點，占40.0%，在遺傳多態(tài)性檢測中較形態(tài)學標記、同工酶標記表現(xiàn)出一定的優(yōu)越性，同時根據(jù)聚類圖17份種質分為5個大類群，可以較為清晰地看出種間的親緣關系。從聚類圖中可以看出，各分支內部具有較高的自展支持率，表明依據(jù)ITS序列差異對枸杞屬下類群的劃分，可以較好地支持依形態(tài)進行的屬內類群的劃分，但是屬內各分支間的關系與傳統(tǒng)的依形態(tài)特征確定的關系存在較大的差異。枸杞屬的起源，根據(jù)聚類圖說明，采自美國的種質材料與中國枸杞屬的ITS序列差異最為明顯，由于材料數(shù)量的限制，初步認為中國分布的枸杞屬不同種與美國分布的枸杞屬種質基于ITS序列分析，親緣關系較遠，自展支持率60%，形成各自獨特的起源和分布中心。

3.2 17份枸杞屬種質資源的親緣關系

由于枸杞屬種質資源較為豐富、起源馴化途徑多樣、栽培歷史悠久、屬內種間（滲透）雜交現(xiàn)象普遍，且地方品種本身并無科學名，導致品種資源不僅類型多而且名稱亂，因此有必要開展枸杞種質資源的鑒定評價?；贗TS序列研究表明，基于ITS序列差異劃分黑果枸杞與其他種屬于不同分支，與其依果實顏色形態(tài)進行的屬內類群的劃分基本一致，而且采自不同地域（青海省、寧夏中寧、寧夏銀川）的黑果枸杞聚在一起，說明ITS對于不同種的劃分是有效的?；贗TS序列差異將采自常熟、蔓生、云南、韓國的枸杞聚在一起，與其他種屬于不同分支，與其依樹體和枝條形態(tài)進行的屬內類群的劃分基本一致。

參考文獻：

[1] 馬德滋，劉惠蘭.寧夏植物志（第二卷）[M].銀川：寧夏人民出版社，1990.

[2] 汪小全，洪德元.植物分子系統(tǒng)學近五年的研究進展概況[J].植物分類學報，1997，35（5）：465-480.

[3] CHENG K T，CHANG H C，HUANG H，et al. RAPD analysis of Lycium bararum medicine in Taiwan market[J].Bot Bull Acad Sin，2000，41（1）：11-14.

[4] SHI Z G，WEI A N，F(xiàn)AN Y F，et al. Preliminary studies on identification of Lycium Linn. germplasm resources by nrDNA ITS sequencing[J].Agricultural Science and Technology，2008， 36（16）：6686-6687.