蔡展宇　蘇廣華

摘要：實驗目的：在小尾寒羊的畜牧業(yè)良種繁育中，探索液氮氣相存儲技術應用于胚胎玻璃化冷凍的可行性。實驗方法：采用小尾寒羊母羊作為胚胎的供體，利用超數(shù)排卵技術和體外輸精之后，并且胚胎在供體羊體內發(fā)育的7天之后，將胚胎沖出。之后，利用新的玻璃化冷凍技術對所采集的胚胎進行冷凍處理，冷凍處理24小時之后復蘇，之后移植同期發(fā)情蒙古母羊受體體內，并且以鮮胚移植同批發(fā)情母羊受體作為對照組。實驗結果：玻璃化胚胎移植的妊娠率與胚胎的發(fā)育的不同階段密切相關（fisher精確檢驗：p=0.01 8），CH（緊縮桑葚胚）的懷孕率顯著高于BL（囊胚期）。實驗結論：在氣相液氮存儲條件下，羊胚胎玻璃化冷凍采用緊縮桑葚期胚胎，能提高妊娠率。

關鍵詞：胚胎移植；玻璃化；液氮蒸汽相存儲；低溫生物學

低溫保存胚胎技術是優(yōu)良種畜生育和種群擴大的重要組成技術。從1985年Rail和Fahv使用玻璃化冷凍法成功地冷凍了小鼠胚胎（Rall&Fahv 1985）以來，玻璃化已成為常規(guī)的低溫動物胚胎保存技術之一，廣泛用于動物和人的胚胎保存中。玻璃化形成于-80℃--130℃，在這個轉變溫度以下，分子運動和化學轉化都會停止，胚胎等生物樣品可以無限期地保存，因此是種群保存、動物基因克隆建庫、運輸和胚胎移植等應用的有效手段（Woods，Benson，Agca&Critser，2004）。在當前的玻璃化冷凍技術中，胚胎等生物活性-樣品通常被儲存在液氮液體內，溫度是-196℃，大大低于玻璃化形成所需要的溫度，液氮液體存儲具有價格低廉并普及的優(yōu)點。然而，液氮蒸氣相中同樣可以實現(xiàn)低溫樣品的保存，被稱為氣相存儲，目前已有很多商品化的液氮氣相存儲裝置可供選擇。液氮氣相存儲具有以下優(yōu)點：1）可避免共處一個液氮池中的各樣品之間發(fā)生潛在的相互污染以及防止傳染介質在其中的傳播；2）由于存儲溫度在-130℃--150℃，長期存儲可以節(jié)約液氮的使用，從而降低成本提高經(jīng)濟效益；3）可以防止樣品的碎裂現(xiàn)象發(fā)生，在玻璃化冷凍中有一個問題是碎裂，這通常發(fā)生在較大的樣品中（mL體積以上），碎裂會發(fā)生在大幅低于玻璃體形成溫度的以下溫度，例如液氮液體溫度（-196℃）。防止樣品碎裂發(fā)生要求生物樣品存儲的溫度保持在玻璃體形成溫度以下10攝氏度到20攝氏度之內，例如：-130℃到-150℃之間，這就要求進行氣相存儲。我們設計并制作了一種恒定溫度在-140.5℃的液氮氣相存儲裝置，在此次試驗中玻璃化冷凍小尾寒羊供體的胚胎，在本次實驗證明有效，并申請了專利保護。

目前，對于在液氮氣相玻璃化冷凍綿羊胚胎并應用于胚胎移植，報道和研究較少，我們設計進行這種玻璃化胚胎冷凍的試驗，同時使用鮮胚移植作為陽性對照，以驗證試驗方法及試驗過程的可靠性，探索液氮氣相存儲玻璃化冷凍在綿羊胚胎移植中應用技術。通過對小尾寒羊在氣相液氮裝置進行胚胎玻璃化冷凍，解凍后進行胚胎移植，為綿羊優(yōu)良種畜生育和種群擴大探索新的低溫技術，最終為胚胎移植技術的改進和低溫冷凍設施的改良奠定基礎。這對于綿羊的良種育種和良種擴大，都有很大意義。

1.材料與方法

1.1實驗設計

以30只小尾寒羊作為供體以三種FSH（卵泡刺激素），分別為加拿大（Canada），寧波（Ningbo）和中科院（CAS）進行超排卵，并進行人工授精。120只蒙古羊同期發(fā)情作為胚胎移植受體。沖洗取出受精的胚胎，按形態(tài)學標準對胚胎分級。取50枚胚胎進行氣相條件下玻璃化冷凍，并在自制的液氮氣相裝置中溫度控制在-140℃過夜，24h后解凍，并且移植25只蒙古羊，每只羊移植兩枚胚胎。作為對照組，以50枚新鮮采集的胚胎移植另外25只蒙古羊作為陽性對照組，同樣每羊移植2枚新鮮采集的胚胎。

1.2氣相液氮裝置的制備：

所用裝置按本實驗進行設計和制作，存儲空間為液氮的蒸汽相（氣相），可以保證實現(xiàn)存儲室的溫度不超過-140.5℃的溫度范圍，有效克服氣相冷凍裝置溫度變化大的缺點。進行驗證后，此裝置已被申請發(fā)明專利，發(fā)明名稱：恒定低溫存儲系統(tǒng)及去除杜瓦霧氣的方法。申請?zhí)枮椋篊N201710024975.1

注：在過夜玻璃化冷凍所存儲的胚胎中，x軸為時間從凌晨0：00到下午16：48的溫度監(jiān)控。Y軸為溫度變化。如圖所示：T Bottom為氣相存儲室底部的溫度探頭所檢測到的溫度，T Top為氣相存儲室頂部的探頭所測溫度，T Center為氣相存儲室中部的探頭所測溫度；以上溫度探頭均為OMEGA的熱電偶，Tc為RTD類型的溫度探頭。Tset（PID）proportional-integral-derivative控制器作為本裝置的控制單元。PID單元的控制溫度加上一個補償值來和實際溫度相一致。

1.3主要藥品：

羊用同期發(fā)情陰道栓（CIDRG，20枚/包新西蘭），Controlled drug release dispenser，簡稱CIDR。供體用CIDR+LH+FSH進行同期發(fā)情和超數(shù)排卵，受體用CIDR+LH進行同期發(fā)情；中科院動物所生產(chǎn)的FSH，規(guī)格10mg/瓶；加拿大Bioniche公司生產(chǎn)的FSH，規(guī)格為400mg（20mL）/盒；寧波激素制品廠生產(chǎn)，規(guī)格為100IU/支。促黃體素（LH）為寧波激素制品廠生產(chǎn)，規(guī)格為200IU/支。胚胎培養(yǎng)保持液（Complete Embryo holding medium 100ml/瓶，新西蘭）、供體羊沖卵用營養(yǎng)液（Complete Embryo flush solution，1000 ml/袋，新西蘭）。

1.4試驗時間及地點：

試驗于2016年3月～6月進行，牧區(qū)為內蒙古呼和浩特和羊牧場。同期發(fā)情、超數(shù)排卵、配種和胚胎收集也都在和羊牧場進行，方法按照相關標準流程進行（Gibbons A.，Gueto M.，2011）。對120只蒙古羊進行同期發(fā)情處理作為胚胎移植的受體羊，在2016年3月27日-28號總計采集到147枚可供移植的胚胎，其中，對3月27日采集的56枚胚胎進行玻璃化冷凍處理，剩余胚胎在3月28日進行采集，作為對照，進行鮮胚移植。

1.5方法

1.5.1供體羊超數(shù)排卵

在內蒙古呼和浩特市郊區(qū)和羊牧場，選取30只小尾寒羊作為供體，以三種FSH（卵泡刺激素），分別為加拿大（Canada），寧波（Ningbo）和中科院（CAS）。供體均采用陰道栓誘導同期發(fā)情。在放栓第11d撤栓，分別注射三種FSH。本研究第1次注射總劑量為138 u，分6次遞減注射（28、28、23、23、18、18 u），每天上午、下午各注射1次。在第5次、第6次注射之問注射1次LH（80-130 U）。

1.5.2供體羊人工輸精

超排處理后發(fā)情當日，將使用假陰道法采集的同種公羊精液稀釋4倍，使用腹腔內子宮角輸精技術，將0.25 ml稀釋精液輸入供體子宮角前端。

1.5.3沖胚及胚胎質量認定

在人工腹腔鏡輸精后的第7 d進行沖胚。手術前，清洗供體羊手術部位并剃除腹部細毛，實施麻醉，腹中線一側手術切口，暴露子官角及卵巢，在確認黃體出現(xiàn)之后按照子宮沖胚的方法進行沖胚。之后，在體視鏡下對沖出的囊胚進行分級（0verstrom 1996），分為CM（（compacted morula）緊縮桑葚胚、BL（blastocyte）囊胚、ExB（Expanded Blastocyte）擴大囊胚、以及HB孵化囊胚（hatched blastocyst）和未受精等。

1.5.4玻璃化冷凍胚胎和復蘇方法

選取三個發(fā)育階段的胚胎fCM，ExB，BL）進行玻璃化冷凍：采用含有20%乙二醇（ethylene glycol，EG）+20%二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide.DMSO）的L-15溶液做為玻璃化冷凍的濃儲液。將選取的胚胎依次移人4℃的含有25%、50%、75%和100%濃度用L-15稀釋的玻璃化冷凍濃儲液中各2.5 min，最后將胚胎裝進含有100%的胚胎玻璃化冷凍濃儲液的胚胎冷凍管中，之后移入到我們自主研發(fā)的-140.5℃的氣相恒溫罐當中。復蘇時，在儲存罐中取出胚胎，迅速將其投入室溫的水浴當中，當液體完全溶解之后，將其依次轉移到含有0.5，0.25和0.125 mol/L蔗糖的L-15溶液中各5min，之后放入培養(yǎng)液中37℃培養(yǎng)箱中靜置備用。

1.5.5胚胎移植

用自制輸卵器將7日齡的囊胚移植到經(jīng)同期發(fā)情處理后的蒙古羊作為受體羊的子官角前1/3處，移植后注射1ml黃體酮。對3月27日采集到的56個胚胎在特制的液氮氣相冷凍裝置中進行玻璃化冷凍，過夜后于3月28日對經(jīng)過玻璃化冷凍的胚胎進行解凍處理，其中50枚胚胎在解凍后，采用腹腔手術法移植A25只發(fā)情處理的蒙古母羊體內，每羊兩枚胚胎。作為對照組，挑選50枚新鮮采集的小尾寒羊的胚胎移植到25只發(fā)情處理的蒙古母羊體內，采用同樣手術方法，由內蒙古大學實驗動物中心同一支研究隊伍進行手術操作。方法參照Gibbons&Gueto，201 1進行。

1.5.6妊娠觀察

胚胎移植后三個月之內采用B超方法確認懷孕。在胚胎移植后6個月隨訪確認無流產(chǎn)和畸形胚胎的產(chǎn)生。

1.5.7統(tǒng)計分析：

統(tǒng)計采用Fisher精確檢驗。

2.實驗結果

2.1在對照組（鮮胚移植）懷孕率為80%，在玻璃化冷凍胚胎組，懷孕率為38%

2.2胚胎移植的懷孕率

·縮寫：CM：緊縮桑葚胚；B：胚囊期；ExB：擴大胚囊期

·耳號為9029 and 9015分別被接種了1只和3只緊縮桑葚胚，并且都成功受孕

2.3實驗結論

玻璃化胚胎移植的懷孕率與胚胎的發(fā)育階段密切相關（fisher精確檢驗：p=0.018），在CM（緊縮桑葚胚）的懷孕率顯著高于BL（囊胚期）。在液氮氣相玻璃化冷凍中，CM胚胎對于玻璃化過程及其融化過程和高濃度的玻璃化保護液具有較高的耐受性，后期的受體羊的妊娠情況明顯優(yōu)于其他時期。鮮胚的胚胎移植成功率高于液氮氣相冷凍胚胎。這同文獻記載相一致。液氮蒸氣相玻璃化胚胎進行移植的懷孕成功率與液氮液相玻璃化胚胎的懷孕成功率相似。鑒于液氮氣相玻璃化存儲的優(yōu)點，氣相玻璃化冷凍技術在動物良種繁育中是一種很有競爭力的選擇。

3.討論

使用玻璃化技術進行胚胎冷凍，可以有效降低種羊繁育成本，對綿羊的優(yōu)良種群進行擴繁有很大意義。本實驗在內蒙古和羊牧場由同一支研究隊伍對實驗組和對照組進行操作，有效避免了不同方法和不同手術操作引入的試驗誤差。本實驗中新鮮胚胎的移植達到80%的受孕率，這與國外的相關報道相一致（Gibbons&Gueto，2011）。使實驗結果與其它研究報道相互印證，具有較高的可信度。

在高等哺乳動物的桑葚期的胚胎可分以被為早期、中期和晚期三個階段。早期桑葚階段，胚胎細胞似有相互‘融合”（compact）之勢，但單個細胞仍可辨認，被稱為緊縮桑葚胚（CM）；到了桑葚胚中期，胚胎細胞進行“融合”，形成一個大而圓的細胞球（morula），細胞膜的界限不再清晰，低倍鏡下整個胚胎看似一個大細胞，稱為桑葚胚；晚期桑葚胚的細胞界限重新顯現(xiàn)，細胞數(shù)量較“融合”前明顯增多，部分細胞尤其是周邊細胞呈梭形，細胞之間可出現(xiàn)小腔隙，形成初期的囊胚腔即早期囊胚。有研究認為桑葚胚玻璃化冷凍在妊娠率和胚胎種植率達到了卵裂期胚胎水平，在胚胎種植率方面并優(yōu)于卵裂期胚胎。并具有很多優(yōu)點：如具有細胞骨架，易于冷凍保護劑滲透，經(jīng)過4天培養(yǎng)，可以剔除無潛力胚胎、降低篩選的工作量，且不需要人工皺縮等，桑葚期胚胎的冷凍較囊胚冷凍經(jīng)濟、方便，在冷凍胚胎的移植中值得推廣（曹金鳳等，2013）。由于各地采用的供體和受體的品種、年齡、體況各異，操作技術及試驗條件不同，所以移植結果有所不同（王銳等，2005）。對于琉璃化冷凍羊胚胎的移植效果也有不同的水平。道賽特等綿羊凍胚移植中，囊胚的受胎率顯著高于桑葚胚（王麗娟，2003）。在杜泊羊上，囊胚的受胎率顯著高于桑葚胚（陳永昌，2004）一般認為處于桑葚胚前的胚胎的移植效果好、受胎率較高。但本研究中，以蒙古羊受體，小尾寒羊的桑葚胚移植受胎率高于囊胚期，和其它一些研究結果相一致（吐爾洪.阿木提等，2016）。

目前已有高質量的商業(yè)化綿羊凍胚移植服務，成功率約為40%左右（奧群牧業(yè)n.a.），本次玻璃化冷凍胚胎的移植總體成功率38%略低于這—水平。但是商品化運營的胚胎移植，選用移植成功率較高階段的胚胎（如桑葚胚和囊胚期）進行玻璃化冷凍和解凍。而在本試驗研究中，以緊縮桑葚胚的移植受孕率則高于這一數(shù)字，達到48%，說明氣相液氮裝置在玻璃化冷凍胚胎的受孕成功率可以達到商業(yè)化胚胎移植的水平。也論證了此種氣相液氮裝置應用于綿羊胚胎玻璃化冷凍的可行性。

本試驗選用三種FSH進行對比，對于胚胎超排而言無顯著差異，證實寧波產(chǎn)FSH適用于冷凍羊胚胎的移植。通過進一步完善相關操作流程，及羊場實驗條件，玻璃化胚胎的移植成功率應當還有進一步的提升空間。