馬 婧， 楊系玲， 孫 聰， 范文艷， 戴凌燕， 金麗娜， 宮占元， 貝麗霞， 姜述君

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江大慶 163319； 2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江大慶 163319)

老山芹(HeracleummoellendorffiiHance)屬傘形科多年生草本植物，為藥食兩用植物，其幼嫩莖葉是美味的山野菜，具有極高的經(jīng)濟開發(fā)價值，同時其干燥根入藥作獨活[1]。獨活是我國常用的傳統(tǒng)中藥，廣泛用于風(fēng)寒濕痹、腰膝疼痛、感冒頭痛、痛瘡腫痛和慢性氣管炎的治療[1-3]。一些研究表明，老山芹含有檞皮素、山奈素和蕓香苷等黃酮類化合物[4]，此外還含有聚乙炔化合物[5]及佛手柑內(nèi)酯、茴芹內(nèi)酯、異茴芹內(nèi)酯等香豆素化合物[6]。研究表明，佛手柑內(nèi)酯具有顯著的抗癌作用[7-8]，因此，老山芹潛在藥用價值也不可忽視。由于老山芹種子萌發(fā)困難，導(dǎo)致老山芹的自然分布數(shù)量較少，分布片斷化明顯，從而使其開發(fā)利用受到制約。在眾多生物技術(shù)中，植物組織培養(yǎng)技術(shù)是解決重要野生植物資源保護和可持續(xù)發(fā)展的重要手段之一。

玻璃化現(xiàn)象是植物組織培養(yǎng)中經(jīng)常發(fā)生的一種生理失調(diào)現(xiàn)象，并且嚴(yán)重影響組培體系的穩(wěn)定性。由于物種間在遺傳和代謝等方面的差異性，導(dǎo)致不同種類植物玻璃化苗在生理生化方面存在一定差異。如香草玻璃化苗的可溶性糖含量顯著降低[9]，而菊花玻璃化苗可溶性糖含量顯著高于正常苗[10]；蘋果玻璃化苗的葉片中赤霉素(GA)含量極顯著上升[11]，然而雜交山楊玻璃化苗的GA含量降低[12]。目前關(guān)于老山芹試管苗培育及其玻璃化方面的研究鮮有報道。本研究擬分析老山芹玻璃化試管苗生理生化特征的變化，以期為揭示老山芹試管苗玻璃化的發(fā)生機制奠定基礎(chǔ)，并為老山芹試管苗玻璃化的有效預(yù)防及恢復(fù)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及培養(yǎng)

老山芹正常試管苗與玻璃化苗：由新梢莖段在MS基本培養(yǎng)基上初代培養(yǎng)得到初代苗，然后截取莖段，進行2次增殖繼代培養(yǎng)獲得。繼代培養(yǎng)20 d后調(diào)查增殖苗數(shù)和增殖系數(shù)，35 d后調(diào)查玻璃化率。增殖培養(yǎng)基配方為1/2MS+1.2 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+2.5%蔗糖。培養(yǎng)基pH值為6.5，培養(yǎng)室溫度為(25±2) ℃，光照時間為16 h/d，光照度為 35 μmol/(m2·s)。

1.2 生理生化指標(biāo)的測定

淀粉、可溶性蛋白、總?cè)~綠素、葉綠素a、葉綠素b、可溶性糖和丙二醛(MDA)含量及相對電導(dǎo)率的測定參考蒼晶等的方法[13]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 老山芹正常苗與玻璃化苗增殖能力的比較

將老山芹玻璃化的試管苗進行繼代培養(yǎng)后，其分化出的苗仍呈現(xiàn)出玻璃化狀態(tài)，玻璃化率顯著高于正常苗，而正常苗增殖后的玻璃化苗率僅為12.56%，可見老山芹玻璃化苗增殖能力顯著低于正常苗；老山芹正常試管苗的增殖系數(shù)為 5.52，而玻璃化苗的增殖系數(shù)為3.38，比正常苗的增殖系數(shù)降低38.77%(表1)。結(jié)果表明，在試管苗培養(yǎng)過程中，玻璃化現(xiàn)象的出現(xiàn)嚴(yán)重降低了老山芹試管苗的繁殖速度。

2.2 老山芹正常苗與玻璃化苗可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白含量及干物質(zhì)積累率的比較

由表2可以看出， 玻璃化苗的可溶性糖含量顯著高于正常苗，但其淀粉、可溶性蛋白含量及干物質(zhì)積累率顯著低于正常苗。正常苗的可溶性糖含量比玻璃化苗低17.09%；但正常苗的淀粉含量、可溶性蛋白含量、干物質(zhì)積累率分別比玻璃化苗高33.65%、30.09%、66.94%。這些結(jié)果說明，玻璃化苗將光合產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化為淀粉的能力較正常苗下降了。

表1 老山芹正常苗與玻璃化苗增殖的差異

表2 老山芹正常苗與玻璃化苗的可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白含量及干物質(zhì)積累比較

2.3 老山芹正常苗與玻璃化苗葉綠素含量的比較

從表3可見，正常苗與玻璃化苗的總?cè)~綠素、葉綠素a、葉綠素b含量和葉綠素a/葉綠素b均存在顯著差異。正常苗的葉綠素a含量比玻璃化苗高42.68%，葉綠素b含量比玻璃化苗高52.17%，總?cè)~綠素含量比玻璃化苗高44.76%。而正常苗的葉綠素a/葉綠素b比玻璃化苗降低了6.18%。以上結(jié)果表明，老山芹玻璃化苗的光合能力與正常幼苗相比有所下降。

表3 老山芹正常苗與玻璃化苗葉綠素含量差異

2.4 老山芹正常苗與玻璃化苗葉片丙二醛含量、相對電導(dǎo)率及活性氧含量的比較

表4 老山芹正常苗與玻璃化苗丙二醛含量、相對電導(dǎo)率及活性氧差異

2.5 老山芹正常苗與玻璃化苗抗氧化酶活性的比較

由表5可知，老山芹玻璃化苗出現(xiàn)了抗氧化酶系統(tǒng)的失調(diào)。老山芹玻璃化苗抗氧化酶系統(tǒng)中的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶、抗壞血酸過氧化物酶活性顯著高于正常苗，上述4種抗氧化酶活性分別比正常苗提高了23.84%、44.41%、92.07%、26.64%。

表5 老山芹正常苗與玻璃化苗抗氧化酶活性的差異

3 討論

玻璃化現(xiàn)象是植物組織培養(yǎng)過程中最為常見一種生理障礙。本試驗結(jié)果顯示，與正常苗相比，老山芹玻璃化苗的葉綠素、淀粉、可溶性蛋白含量和干物質(zhì)積累率均出現(xiàn)大幅度的降低，而可溶性糖含量卻比正常試管苗顯著增加。這些結(jié)果表明，老山芹玻璃化苗出現(xiàn)了光合作用失調(diào)和代謝紊亂現(xiàn)象。在本試驗中，玻璃化老山芹的可溶性糖含量顯著高于正常苗，而網(wǎng)紋甜瓜[16]、滿天星[17]和藍(lán)莓[18]的玻璃化苗可溶性糖含量顯著低于正常苗，這種差異可能是由于不同植物種類對糖類吸收和利用方面存在差異造成的。