楊耀剛， 田瑞華

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

纖維素是地球上極為豐富的生物聚合物，是生物質(zhì)資源之一，它是由葡萄糖通過β-1，4糖苷鍵連接而成的線性不分枝的同聚多糖，纖維素是植物除水分以外的主要成分，約占其干質(zhì)量的30%～50%，是目前分布最廣且最多的天然碳水化合物[1]。

目前對(duì)纖維素有效的利用很少，其中一小部分用于紡織、造紙、建筑和飼料等，一部分用作生產(chǎn)燃料乙醇，大部分沒有被利用，而是被農(nóng)民取粒后直接焚燒，嚴(yán)重影響環(huán)境。秸稈自然還田，即生物降解是處理和利用秸稈等木質(zhì)纖維素最具前景的方法，主要利用微生物可分泌產(chǎn)生纖維素酶這一特點(diǎn)，經(jīng)微生物自然分解，參加自然界碳素循環(huán)，是增加作物產(chǎn)量、提高土壤肥力的有效途徑[2]，但微生物受外界環(huán)境因素所致及自生可分泌的纖維素酶較少，且纖維素酶水解玉米秸稈的過程中，纖維素酶不可逆地吸附在木質(zhì)素表面，使纖維素酶的活性降低，導(dǎo)致秸稈的分解速度變慢，這樣存在降低地溫、加重病蟲害、影響播種等問題[3-4]。為加快纖維素的酶解速度，在纖維素酶解過程中添加表面活性劑來阻止木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的無效吸附，添加纖維素酶的激活劑金屬離子來提高纖維素酶解的反應(yīng)速度。

到目前為止，有很多與產(chǎn)纖維素酶生產(chǎn)菌的相關(guān)報(bào)道，如青霉、假單胞菌屬、木霉屬、曲霉屬以及構(gòu)建的工程菌，這些研究都集中在工業(yè)酶的基礎(chǔ)上[5-6]，對(duì)于土壤自身土著菌微生物的研究甚少。在長期的生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，植物細(xì)胞壁成分的復(fù)雜性及不同細(xì)胞壁成分的差異導(dǎo)致分解纖維素微生物單獨(dú)作用下不能完成或只能微弱完成纖維素的降解，所以必須依靠2種及2種以上的微生物共同作用[7-8]。因此，本研究以玉米秸稈為原料，在不破壞原有土壤中降解纖維素菌群平衡的基礎(chǔ)上，通過植物生長所需的金屬離子及有利于土壤修復(fù)的表面活性劑對(duì)土著菌產(chǎn)酶條件優(yōu)化的研究[9-11]，找出能夠提高產(chǎn)酶效率的因子，制作成加速還田秸稈分解的菌劑，在秸稈還田時(shí)配施在土壤中，加快還田秸稈的有效降解，為提高土壤的肥力及增加農(nóng)作物產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

土樣于2017年4月采自內(nèi)蒙古自治區(qū)磴口縣巴彥高勒鎮(zhèn)周邊玉米地，樣品采集到無菌自封袋中，迅速壓實(shí)擠掉多余空氣，于4 ℃冰箱中保存；試驗(yàn)用秸稈采自當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶家中，除去樣品中的雜質(zhì)，截成長度8～10 cm，帶回實(shí)驗(yàn)室，粉碎，常溫干燥環(huán)境條件下貯存，備用。

1.2 試驗(yàn)試劑

pH值為6.5的0.05 mol/L檸檬酸緩沖液、1%羧甲基纖維素鈉溶液、DNS試劑(配制)；硫酸鐵、硫酸亞鐵、硫酸鈉、硫酸鋅、硫酸鎂、硫酸銅、硫酸錳、氯化鈣、氯化鈷、硫酸鉀，十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，簡稱SDS)、Tween 20、Tween 80、PEG 2000、PEG 6000、PEG 8000為化學(xué)純。

1.3 土著菌的最適溫度、pH值、氮源

將采到的土樣各稱取10 g于廣口瓶中，加入已滅菌 490 mL 水、5 g秸稈粉、1 g微晶纖維素、1 g羧甲基纖維素鈉、3 g尿素、3 g濾紙條，放置于常溫，隔1 d搖晃1次，為1代菌。20 d后取50 mL 1代菌液，加入滅菌后的水450 mL、5 g秸稈粉、1 g微晶纖維素、1 g羧甲基纖維素鈉、3 g尿素、3 g濾紙條，放置于常溫，隔1 d搖晃1次，為2代菌，連續(xù)傳代到第10代。各取第9代菌液20 mL，加入已滅菌80 mL水、0.5 g秸稈粉、0.2 g微晶纖維素、0.3 g羧甲基纖維素鈉、0.1 g尿素、0.2 g濾紙條，于250 mL三角瓶中，2個(gè)平行，分別置于20、30、40、50 ℃，pH值為5、6、7、8，氮源尿素、硫酸銨、蛋白胨的恒溫?fù)u床中，50 r/min，測定酶活。

1.4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

制備不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入1 mL DNS(3，5-二硝基水楊酸)溶液，搖勻，沸水浴5 min，冷卻、定容到5 mL。在540 nm波長處測定其吸光度，以葡萄(mg/mL)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 酶活的測定及計(jì)算方法

向比色管中加入0.5 mL、12 000 r/min離心后的上清，加入0.5 mL的1%羧甲基纖維素納(CMC-Na)溶液，混勻后50 ℃水浴 45 min，加入1 mL的DNS液，沸水浴5 min，立刻冷卻，加入 3 mL 蒸餾水，搖勻，取200 μL，540 nm波長下測定各溶液的D540 nm值。

纖維素酶活力定義：以CMC-Na為底物，在溫度為 50 ℃、pH值為6.3、恒溫45 min的條件下，以水解反應(yīng)中 1 min 催化CMC-Na水解形成1 μmol葡萄糖的酶量為1個(gè)單位，用“U”表示。

1.6 不同金屬離子對(duì)土著菌產(chǎn)酶的影響

試驗(yàn)考察植物在生長過程中所需的9種金屬離子對(duì)纖維素產(chǎn)酶的影響，在土著菌群水解玉米秸稈的同時(shí)分別添加各自不同濃度的金屬離子鹽溶液與菌液充分混合(表1)，發(fā)酵7 d，根據(jù)上述方法測定其纖維素酶活力。

表1 添加不同金屬離子的濃度梯度

1.7 不同表面活性劑對(duì)土著菌產(chǎn)酶的影響

向水解反應(yīng)體系中加入不同濃度的6種表面活性劑，發(fā)酵7 d，根據(jù)上述方法測定表面活性劑在不同加入量下對(duì)土著菌產(chǎn)纖維素酶的影響。

表2 添加不同表面活性劑的濃度梯度

2 結(jié)果與分析

濾紙是結(jié)晶度和聚合度都居中等的纖維材料，濾紙酶活性即纖維素酶的總酶活力，以其為底物測濾紙崩解可用來表征纖維素酶的總糖化能力，因此對(duì)濾紙有良好降解效果的則具有較強(qiáng)的產(chǎn)纖維素酶能力[8，12]。故根據(jù)不同單因素下的濾紙崩解情況，確定土著菌的最適生長產(chǎn)酶溫度為30 ℃、pH值為偏酸性、氮源為蛋白胨，含量為0.2%。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.791 6x-0.087 6(r2=0.995 2)(圖1)。

2.1 不同金屬離子對(duì)土著菌產(chǎn)酶的影響

在纖維素酶合成過程中，F(xiàn)e3+是許多酶的激活劑，由圖2可知，在發(fā)酵過程中，低濃度的Fe3+對(duì)土著纖維素菌劑產(chǎn)酶有促進(jìn)作用，當(dāng)Fe3+的濃度為0.3 mmol/L時(shí)，促進(jìn)作用最強(qiáng)，此濃度下使纖維素酶合成水平有較大的提高。隨著Fe3+濃度的增加，對(duì)土著菌產(chǎn)酶幾乎沒有影響。

由圖3可知，低濃度的Na+能夠促進(jìn)土著菌產(chǎn)纖維素酶，從而有利于對(duì)秸稈的水解，當(dāng)Na+濃度為0.7 mmol/L時(shí)，其相對(duì)酶活達(dá)到最大值，為111 U，隨著溶液中Na+濃度的增加，對(duì)土著菌體的滲透壓增高，抑制菌的生長，產(chǎn)纖維素酶下降，因此由促進(jìn)轉(zhuǎn)變?yōu)橐种啤?/p>

在土著菌生長過程中，圖4顯示低濃度的Zn2+作為營養(yǎng)離子能夠刺激土著菌加快完成生理代謝過程，有利于酶的合成，Zn2+的濃度為1.8 mmol/L時(shí)，酶活力達(dá)到最大值。當(dāng)Zn2+的濃度高于1.8 mmol/L時(shí)，影響菌體對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，不利于酶的合成，成為毒性離子，因此由促進(jìn)作用變?yōu)橐种谱饔谩?/p>

圖5顯示，Ca2+濃度在0.0～0.1 mmol/L時(shí)，對(duì)纖維素酶活力呈激活作用，且激活作用逐漸增加，從0.1 mmol/L開始，激活作用開始下降。在濃度大于0.1 mmol/L時(shí)，Ca2+對(duì)纖維素酶的作用轉(zhuǎn)為抑制作用，抑制作用隨濃度增大而加強(qiáng)。

由圖6可知，Cu2+對(duì)纖維素酶活性整體呈激活作用，Cu2+濃度在0.0～0.9 mmol/L時(shí)，激活作用不顯著，Cu2+濃度在1.0 mmol/L以后，激活作用開始增加。可能是因?yàn)镃u2+是構(gòu)成漆酶不可缺少的金屬離子，銅作為漆酶活力中心的組成成分，參與漆酶蛋白的合成，在限銅或缺銅時(shí)，漆酶蛋白表達(dá)受限，所以活力較低。在秸稈的分解中，漆酶降解玉米秸稈中的木質(zhì)素，使秸稈中的纖維素暴露出來，間接地有利于土著菌對(duì)纖維素酶的分泌。

Mn2+能夠參與細(xì)菌超氧化物歧化酶的活動(dòng)，是錳過氧化物酶(MnP)、丙酮酸竣化酶、精氨酸酶等的輔助因子，也是腺嘌呤核苷酸酶和一些水解酶的激活劑，Mn2+對(duì)纖維素酶活力整體呈激活作用，Mn2+在濃度為0.3 mmol/L時(shí)，激活作用達(dá)到最大，以后開始減弱，但依舊表現(xiàn)為激活作用。

Co2+是微生物生長需要的具有特殊生物學(xué)功能的微量金屬元素，其與微生物之間存在著密切的相互作用，在給定的范圍內(nèi)，對(duì)土著菌產(chǎn)酶具有促進(jìn)作用。Co2+濃度為0.6 mmol/L時(shí)，其激活作用最強(qiáng)，隨著環(huán)境中Co2+濃度增高，會(huì)影響甚至抑制微生物的生長及代謝活動(dòng)，其激活作用呈下降趨勢。

K+對(duì)土著菌產(chǎn)酶的影響與Na+相似，在低濃度是具有促進(jìn)作用，當(dāng)濃度為0.6 mmol/L時(shí)，其相對(duì)酶活達(dá)到最大值，隨著環(huán)境濃度的升高，在微生物體內(nèi)形成Na-K泵，影響土著菌的滲透壓，因此變?yōu)橐种谱饔谩?/p>

水解纖維素酶是蛋白質(zhì)，物理、化學(xué)、生物等因子都能影響蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變，金屬離子對(duì)酶的催化作用尤其重要，金屬離子主要通過影響底物反應(yīng)定向或可逆改變金屬離子的氧化態(tài)來調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)等途徑參加催化過程[13]。國內(nèi)外對(duì)此進(jìn)行了研究，其結(jié)論有所不同，研究結(jié)果表明，金屬離子對(duì)纖維素酶的影響除了金屬離子本身以外，還與反應(yīng)的條件及環(huán)境有關(guān)，在一定的濃度下有的表現(xiàn)為激活作用，有的則相反，何林富等在金屬對(duì)林芝纖維素酶活力的研究中發(fā)現(xiàn)，K+、Zn2+對(duì)纖維素酶活有促進(jìn)作用，Cu2+、Mn2+則對(duì)靈芝纖維素酶活有抑制作用[14]。王娜娜等在金屬離子對(duì)纖維素酶水解玉米秸稈中研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+在一定的濃度范圍內(nèi)對(duì)纖維素酶有不同程度的促進(jìn)作用[15]。安剛等研究金屬離子對(duì)白蟻纖維素酶活力的影響發(fā)現(xiàn)，Na+、K+對(duì)酶活沒有影響，Ca2+、Mn2+、Zn2+有激活作用，Cu2+有抑制作用[16]。李德瑩等在金屬離子對(duì)纖維素酶活力影響的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e3+、Co2+對(duì)纖維素酶活性有激活作用，Cu2+、Zn2+、Mn2+對(duì)纖維素酶活性有抑制作用[6]。李文歡等研究認(rèn)為，Co2+、Mn2+對(duì)纖維素酶有激活作用，Cu2+、Ca2+對(duì)纖維素酶具有不同程度的抑制作用[17]。Ferchark等研究了金屬離子對(duì)纖維素酶活的影響，結(jié)果表明，Ca2+對(duì)纖維素酶活也有輕微的激活作用[18]。王聞等研究認(rèn)為，Ca2+、Mn2+、Co2+在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)纖維素酶有激活作用，但效果不明顯[19]。李金寶等認(rèn)為，F(xiàn)e3+、Cu2+、Co2+能夠促進(jìn)纖維素酶對(duì)纖維素的水解[20]。

2.2 不同表面活性劑對(duì)土著菌產(chǎn)酶的影響

表面活性劑能起到良好的增溶和乳化作用，可以降低纖維素及所處溶液的表面張力，使纖維素酶在整個(gè)反應(yīng)體系中分散得更均勻，提高纖維素這種高分子聚合物的親水性，并促進(jìn)底物與纖維素酶結(jié)合，提高酶的降解效率[21-22]。

圖7所示，添加非離子表面活性劑Tween 20、Tween 80時(shí)，對(duì)土著菌分解纖維素產(chǎn)糖在設(shè)定的范圍內(nèi)低濃度時(shí)有輕微的促進(jìn)作用，Kim等研究發(fā)現(xiàn)，0.5% Tween 80能夠使纖維素和濾紙的轉(zhuǎn)化率分別提高21.9%、23.0%[23]。Tween可以增加底物與酶的有效結(jié)合，提高纖維素酶的熱穩(wěn)定性，且Tween 20強(qiáng)于Tween 80，隨著添加濃度的增加，由輕微的促進(jìn)作用變?yōu)橐种谱饔?，這與Kaar等研究結(jié)果[24-25]類似。

添加不同分子量大小非離子表面活性劑PEG時(shí)，在設(shè)定的范圍內(nèi)對(duì)土著菌分解纖維素產(chǎn)糖低濃度有促進(jìn)作用，其中PEG 6000提高幅度最大(圖8)。Qing等對(duì)作用機(jī)制進(jìn)行了研究[26]；Kristensen等在秸稈的水解中加入PEG，同樣得到PEG 6000對(duì)秸稈水解的影響最大[27]。李鑫等在水解玉米秸稈中報(bào)道，PEG 6000減少纖維素酶的非生產(chǎn)性吸附，改善纖維素酶對(duì)玉米秸桿的水解性能效果最好[28]；席琳喬等在探究不同分子量大小PEG對(duì)棉稈木質(zhì)纖維素酶解的影響中發(fā)現(xiàn)，同樣得到PEG 6000可以提高纖維素的轉(zhuǎn)化率[29]。

添加離子表面活性劑SDS，在設(shè)定的濃度范圍內(nèi)有明顯的促進(jìn)作用，當(dāng)加入SDS加入量為6.85 mmol/L時(shí)，效果最好，相對(duì)酶活為169 U(圖9)。王娜娜等同樣發(fā)現(xiàn)，SDS對(duì)纖維素酶水解玉米秸稈有促進(jìn)作用[15]。

金屬離子與表面活性劑對(duì)土著菌產(chǎn)纖維素酶的試驗(yàn)結(jié)果與其他學(xué)者研究結(jié)果不盡相同，可能主要有2個(gè)原因：一是不同微生物源所產(chǎn)生的纖維素酶結(jié)構(gòu)上有差別；二是不同的研究者所設(shè)定的金屬離子及表面活性劑濃度不同。

3 結(jié)論

通過試驗(yàn)初步探索土著菌生長產(chǎn)酶的最適環(huán)境，混菌的產(chǎn)酶最適pH值為偏酸性，溫度為30 ℃，最適產(chǎn)酶的氮源為蛋白胨，其含量為0.2%。本研究只在單因素水平上探索不同的金屬離子與表面活性劑對(duì)土著纖維素菌產(chǎn)酶的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明，金屬離子與表面活性劑在一定的濃度范圍內(nèi)對(duì)秸稈的水解具有促進(jìn)作用，可以提高土著纖維素菌劑對(duì)秸稈的有效降解速度，在玉米秸稈還田時(shí)配施菌劑，從而提高土壤的肥力，增加農(nóng)作物產(chǎn)量。然而金屬離子復(fù)配對(duì)纖維素菌產(chǎn)酶的研究較少，只有李文歡等研究2種金屬離子的復(fù)配，結(jié)果表明，比單獨(dú)添加1種金屬離子效果好[17]。因此，金屬離子復(fù)配以及金屬離子與表面活性劑相結(jié)合對(duì)纖維素菌產(chǎn)酶的影響有待不斷地深入研究。