廖煥蘭，柏彩英，陳富，李松，張文，屈平華，張偉錚

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 廣東省中醫(yī)院檢驗科，廣東 廣州 510006；2.廣東省婦幼保健院檢驗科，廣東 廣州 510010）

6株枝孢霉的鑒定與分析

廖煥蘭1，柏彩英2，陳富1，李松1，張文1，屈平華1，張偉錚1

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 廣東省中醫(yī)院檢驗科，廣東 廣州 510006；2.廣東省婦幼保健院檢驗科，廣東 廣州 510010）

目的 利用ITS基因序列分析對臨床分離的6株枝孢霉進行分子生物學(xué)鑒定與分析，以提高對枝孢霉的鑒定能力。方法從皮膚病患者中分離6株枝孢霉，通過觀察培養(yǎng)后菌落的形態(tài)及其顯微鏡下特征，并利用ITS序列對其進行PCR分子生物學(xué)分析，并將PCR產(chǎn)物送公司進行測序。結(jié)果6株枝孢霉由顯微鏡下的形態(tài)和培養(yǎng)的菌落特征鑒定，提取其DNA進行PCR擴增，產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，再由Tanon-3500凝膠成像系統(tǒng)確定擴增所得電泳帶的大小在500～750 bp之間，測序結(jié)果經(jīng)Blast比對，其中4株鑒定為球孢枝孢霉100%，1株鑒定為枝孢樣枝孢霉100%，1株鑒定為枝孢霉屬97%。結(jié)論通過ITS基因序列分析技術(shù)，能更有效準確地提高對枝孢霉的鑒定能力，為臨床的準確治療方案提供有力的依據(jù)。

枝孢霉菌；ITS基因序列分析；PCR分子技術(shù)

枝孢霉是近些年常報道的引起暗色真菌皮膚病的常見真菌，治療起來也較為困難，還因其廣泛的存在于自然環(huán)境中，特別是在免疫力低下的老年人或者外傷等直接接觸條件下?？蓪?dǎo)致人和動物的感染，如甲真菌病和真菌性皮膚病，嚴重的可引起肺部感染等[1]，目前，對枝孢霉的微生物學(xué)特征和所致的病情尚缺乏一定的了解，對其所致的暗色皮膚病的診斷與治療存在很大的困難，并且枝孢霉的顯微鏡下的形態(tài)特征以及培養(yǎng)后菌落的特點與其他暗色真菌的極其相似，如分生孢子的形態(tài)、菌絲隔的顏色深淺和分生孢子的生長方向等等，更何況暗色真菌培養(yǎng)后的菌落特點與平板的種類、培養(yǎng)的環(huán)境以及培養(yǎng)時間的影響很大，通過主觀的判斷難免會有所誤差。由此，僅從鏡下的形態(tài)和培養(yǎng)后的菌落特點對其鑒定會有一定的誤診，那么能提高對枝孢霉的鑒定能力就顯得至關(guān)重要。因此，本文對臨床上6株鑒定的枝孢霉進行ITS基因序列分析[2]，通過對比分析前后的結(jié)果，能更好的提高對這類真菌的鑒別能力，為臨床的準確治療方案提供有力的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年6月至2016年4月本院的5例皮膚科門診的患者和1例皮膚科住院的患者，其臨床表現(xiàn)為均有典型的真菌皮膚病的特征，經(jīng)甲屑或皮屑真菌鏡檢為陽性，并進一步進行真菌培養(yǎng)后，通過形態(tài)上以及培養(yǎng)特點而鑒定為枝孢霉屬6例標本。

1.2 直接鏡檢及培養(yǎng) ①取材：用刀片刮取或用膠布貼住少量患者病患部位的皮屑或直接剪下部分患病的甲屑；②直接顯微鏡檢查：將刮取的皮屑標本于玻片上，然后蓋上蓋玻片,然后在蓋玻片旁加入1～2滴10%的KOH溶液，靜置后直接鏡檢；或直接貼住膠布直接鏡檢；③真菌培養(yǎng)：將刮取的病患部位的皮屑或患病的甲屑直接嵌入(SDA)沙氏培養(yǎng)基中，于25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d左右，大約4 d可以看到真菌的生長，之后隔天取出觀察菌落的生長情況、表面的形態(tài)和顏色的變化等情況，并拍照留底和做好記錄。

1.3 菌株的鑒定 于SDA培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)種至馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)中，于25℃進行分離培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中記錄根據(jù)菌落的顏色、菌落的生長速度、菌落的大小和表面及背面的特征，再綜合培養(yǎng)后的真菌在鏡下的形態(tài)特點，如分生孢子的形態(tài)、顏色及數(shù)量，分生孢子梗的形態(tài)特征及菌絲的長短寬厚等特征以及直接鏡檢的形態(tài)特點等來進行鑒定。

1.4 分子生物學(xué)鑒定 利用真菌通用的引物進行ITS序列分子學(xué)測定，以鑒定菌種。使用真菌通用引物ITS4、ITS5對純培養(yǎng)后真菌提取的DNA片段進行PCR擴增，然后將所得的PCR產(chǎn)物送往上海的美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行雙向測序[3]。將檢測的測序結(jié)果在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)數(shù)據(jù)庫中進行比對以鑒定菌種。

1.5 儀器與試劑 自配的10%KOH，沙氏培養(yǎng)基(SDA)，馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，恒溫培養(yǎng)箱，Tanon-3500凝膠成像系統(tǒng)(上海天能)，奧林巴斯顯微鏡，DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠)等。

2 結(jié) 果

2.1 菌落形態(tài) 將刮取的病患部位的皮屑或患病的甲屑直接嵌入(SDA)沙氏培養(yǎng)基中，于25℃培養(yǎng)約10 d，約第4天就開始長出菌落，之后隔天取出培養(yǎng)基觀察菌落表面的形態(tài)、菌落表面的質(zhì)地的變化和菌落顏色的變化，記錄菌落的生長情況，第9天左右菌落長的比較完整，此時可見菌落的質(zhì)地的變化由柔軟到粉末狀再到羊毛樣，菌落的生長方向從中央向四周分散，從SDA培養(yǎng)基的前面可見顏色逐漸變黑，背面觀察為黑色，部分菌落形態(tài)見圖1。

2.2 鏡下的特征 直接挑取SDA平板上的菌落涂片進行顯微鏡檢查，鏡下可見菌絲為細枝狀，為有隔菌絲，隔的顏色為棕色，菌絲可見有分枝，有分生孢子梗，分生孢子成串狀并呈頂端生長。部分鏡下形態(tài)見圖2。

圖1 左為平板正面，右為平板背面

圖2 枝孢霉菌的鏡下形態(tài)(×400)

2.3 PCR擴增后的電泳結(jié)果 取SDA培養(yǎng)基上的菌進行PCR擴增，擴增的產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析，再由Tanon-3500凝膠成像系統(tǒng)進行檢測，最后所得的電泳條帶為500～750 bp(見圖3)。

圖3 6株真菌的電泳圖

2.4 測序結(jié)果 PCR的擴增產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行雙向測序，測序結(jié)果可見圖4。將獲得的序列輸入生物技術(shù)信息網(wǎng)進行Blast分析比對(www.ncbi.him.nih.gov/blast)，得出4株為球孢枝孢霉(100%)，1株為枝孢樣枝孢霉(100%)，1株為枝孢霉屬(97%)。

圖4 三種枝孢霉的測序圖

3 討 論

枝孢霉能引起的暗色真菌皮膚病的種類有很多，在本院中檢出的主要為球孢枝孢霉和枝孢樣枝孢霉，由于在自然界中枝孢霉廣泛存，那么與其接觸的機會也會相應(yīng)增多，甚至在一些常見的動物的體表也存在，如野鼠身上也有發(fā)現(xiàn)[4]。機體因皮膚的外傷而接觸感染源后則有被感染的機會，特別是有基礎(chǔ)疾病的老年人、免疫力低下的患者，最極其容易由于接觸后被感染，輕則引起皮膚表面的瘙癢、潰爛。也可引起皮下組織的炎性肉芽腫、膿腫等，嚴重還會引起系統(tǒng)性感染的深部真菌病，治療起來將非常困難，而且治愈后也極易復(fù)發(fā)。由于目前霉菌的藥敏操作起來比較復(fù)雜，且在操作的過程中也可能有一定的危險性，所以開展霉菌藥敏實驗的醫(yī)院很少，而臨床治療上往往都是根據(jù)經(jīng)驗用藥或根據(jù)檢驗科的鑒定報告進行用藥治療。也就是說，除了經(jīng)驗用藥外，準確鑒定就是選擇用藥的最好選擇。而不同的菌種對不同的真菌藥物的藥敏性是有差異的，如一般的暗色真菌對氟康唑的較為敏感，臨床上也較為常用，而枝孢樣枝孢霉則對氟康唑的敏感性較差[5]，因此，霉菌的準確鑒定對臨床上的治療效果有著非常重要的作用。

目前對霉菌的鑒定主要還是依靠培養(yǎng)后的菌落的生長速度、表面的質(zhì)地感的變化和顏色的變化以及培養(yǎng)前后的鏡下的形態(tài)來進行初步的辨別，主觀性大，加上培養(yǎng)后的菌落形態(tài)變化的影響因素較多，所以難免會有鑒定有誤的發(fā)生，進而影響或延誤了患者的治療。而今，隨著分子生物學(xué)不斷的發(fā)展，PCR技術(shù)不斷的進步，在真菌學(xué)上的研究特別是菌種鑒定能力也得到了很大程度的發(fā)展，特別在基因分子診斷方面也有日新月異的進步，近年來，真核生物基因組中編碼核糖體的基因rDNA的間隔區(qū)為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)的擴增序列檢測，是在真菌的鑒定方面最為常用的，也是目前真菌鑒定的金標準，由于操作繁瑣以及費用昂貴，一般的醫(yī)院都未能開展。近年有人提出，皮膚癬菌鑒定的金標準就是直接從臨床標本上獲得的真菌rDNA的ITS序列分析[6]，隨著ITS序列檢測的應(yīng)用和發(fā)展，其對真菌種屬的鑒定已成為最好的選擇之一。

本文檢測的6例真菌患者的標本，根據(jù)鏡下的特點和培養(yǎng)前后的菌落特征最后鑒定為枝孢霉，從大的方向來說，這菌屬診斷還是比較準確的，但對種的診斷就很困難了。因此，本文就是通過利用ITS基因序列對進6例標本進行分析診斷，利用真菌的通用引物ITS4、ITS5對純培養(yǎng)后真菌提取的DNA片段進行PCR擴增，然后將所得的PCR產(chǎn)物送往上海的美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行雙向測序，測序結(jié)果在GenBank(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)數(shù)據(jù)庫中進行比對，最終確定結(jié)果為4株球孢枝孢霉(100%)，1株枝孢樣枝孢霉(100%)，1株枝孢霉屬(97%)。通過ITS基因序列的診斷鑒定可以提高鑒定能力[7]，對枝孢樣枝孢霉感染患者的治療就起到非常重要的作用。

總之，真菌的種類多種多樣，形態(tài)和感染方式又極為相似，而我們對許多真菌的微生物學(xué)特性了解又甚少，所以真菌的診斷是非常困難的。但是，隨著分子生物學(xué)的不斷進步，經(jīng)過ITS序列檢測的結(jié)果，再去比較之前的鑒定，從中學(xué)習(xí)經(jīng)驗，對這類真菌的鑒別能力也必定會提高的。

[1]桑紅,何威,鄭稀,等.枝孢樣枝孢霉對小鼠致病性實驗研究[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報,2008,21(1):25-27.

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Identification and analysis of six strains of Cladosporium.

LIAO Huan-lan1,BO Cai-ying2,CHEN Fu1,LI Song1, ZHANG Wen1,QU Ping-hua1,ZHANG Wei-zheng1.1.Department of Clinical Laboratory,the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine/Guangdong Provincial Traditional Chinese Medicine Hospital, Guangzhou 510006,Guangdong,CHINA;2.Department of Clinical Laboratory,Guangdong Women and Children Hospital, Guangzhou 510010,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo perform molecular biological identification and analysis of six strains ofCladosporiumclinically by ITS gene sequencing,and to improve the ability to identifyCladosporium.MethodsSix strains ofCladosporiumwere isolated from the patients with dermatosis.Colony characteristics and microscopic morphology of the isolates were observed by methods of culture and direct microscopy.PCR analysis of the isolates was performed by ITS gene sequencing and the PCR product was sent for sequencing.ResultsSix strains ofCladosporiumcould be identified by microscopic morphology and colony characteristics.DNA was extracted for PCR analysis,and PCR product was analyzed on 1%agarose gel electrophoresis.The size of product was 500-750 bp using Tanon-3500 gel imaging system.By BLAST,four isolates displayed 100%consistence withBeauveria Cladosporium,one showed 100%consistence withcladosporium cladosporioides,and one had 97%consistence withCladosporium.ConclusionITS gene sequencing can identifyCladosporiumeffectively and provide strong basis for clinical treatment.

Cladosporium;ITS gene sequencing;PCR analysis

R379

A

1003—6350（2017）06—0920—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.06.021

2016-09-17)

廣東省科技計劃項目(編號：粵科社字2011 106號)

張文。E-mail：13610235698@163.com