李 謀，楊小琳，趙金禮

(陜西慧康生物科技有限責(zé)任公司，陜西 西安 710054)

乳鐵蛋白(Lactoferrin ,Lf)相對分子質(zhì)量大小約為80kDa，是一種不依賴血紅素鐵離子結(jié)合的鐵離子結(jié)合糖蛋白，是轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin,Tf)家族的成員之一。1939年Sorense等首次發(fā)現(xiàn)牛乳鐵蛋白[1]，1960年Johanson等學(xué)者首次從人乳中分離得到人乳鐵蛋白[2]，乳汁中含有大量乳鐵蛋白，膽汁、唾液、眼淚等外分泌液中也檢測到乳鐵蛋白存在[3-5]。人乳汁中含有大量的乳鐵蛋白，其他哺乳動物亦同，但存在種屬差異。人乳鐵蛋白是人乳中含量最多的乳清蛋白，其含量高達(dá)2～4 mg/mL，初乳中達(dá)6～8 mg/mL[6]。研究表明乳鐵蛋白具有抗細(xì)菌[7]、抗真菌[7]、抗病毒[6]、抗炎[8]、抗氧化[9]、美白[10]、促進(jìn)鐵離子吸收[11]等廣泛的生物功能，可應(yīng)用于功能食品、化妝品、保健品及藥品等多種生物制劑的開發(fā)，而被研究者廣泛關(guān)注。

隨著經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，越來越多的人開始注重生活品質(zhì)的提升，美麗的容顏和不老的肌膚成為愛美人士的重要需求之一。安全、功效顯著的生物功能護(hù)膚品可滿足此類需求，而乳鐵蛋白具有豐富的生物學(xué)功能被認(rèn)為是一種極具潛力的化妝品新原料。

1 乳鐵蛋白的生物學(xué)特征

1.1 乳鐵蛋白概述

人乳鐵蛋白是轉(zhuǎn)鐵蛋白家族成員之一，人乳鐵蛋白前體蛋白攜帶19個氨基酸的信號肽，信號肽可攜帶乳鐵蛋白蛋白分泌至胞外，隨后切除信號肽，成熟的人乳鐵蛋白由692個氨基酸組成。相對分子質(zhì)量大小約80kDa，人乳鐵蛋白與血清轉(zhuǎn)鐵蛋白同源性達(dá)60%，二者氨基酸組成相似，二級結(jié)構(gòu)相近，均具有較高的Fe3+鐵離子結(jié)合能力。

乳鐵蛋白由兩個同源性極高的葉片狀結(jié)構(gòu)域N-葉和C-葉構(gòu)成，N-葉包含氨基酸1～332，C-葉包含氨基酸344～692，N-葉和C-葉之間由333～343氨基酸組成的α螺旋構(gòu)成的鉸鏈區(qū)連接，N-葉和C-葉均由α螺和β折疊組成，形成二級結(jié)構(gòu)，被相應(yīng)的分為N1、N2區(qū)和C1、C2區(qū)[12]，N-葉和C-葉均可結(jié)合Fe2+、Fe3+，乳鐵蛋白能夠可逆性地結(jié)合Fe3+離子和1個CO32-離子。也有研究報道乳鐵蛋白可結(jié)合Cu2+、Zn2+和Mn2+[13]。乳鐵蛋白內(nèi)的Cys可形成分子內(nèi)二硫鍵，N-葉和C-葉的Asn與乳鐵蛋白的糖基化相關(guān)[12]。

1.2 乳鐵蛋白熱穩(wěn)定性

熱穩(wěn)定性是活性蛋白重要理化性質(zhì)之一，直接影響其是否可應(yīng)用于下游制劑的開發(fā)及制劑開發(fā)過程中工藝參數(shù)的制定。研究發(fā)現(xiàn)，乳鐵蛋白85℃保溫10min，對其抑菌活性無影響，酸性條件下乳鐵蛋白的熱穩(wěn)定性良好[15-16]。LUIS等研究發(fā)現(xiàn)，72℃保溫20s或135℃保溫8s幾乎不影響乳鐵蛋白的鐵結(jié)合能力[17]。但是，閆序東等的研究表明，乳鐵蛋白屬于熱敏性物質(zhì)，過強(qiáng)的熱處理會降低乳鐵蛋白的抗菌活性和鐵結(jié)合活性，巴氏殺菌對乳鐵蛋白結(jié)構(gòu)和抗菌、鐵結(jié)合活性影響不大[18]。加熱處理是否會對乳鐵蛋白的其它功能產(chǎn)生影響，尚待研究。

1.3 乳鐵蛋白的來源

乳鐵蛋白因其具有多種生物學(xué)功能，受到各領(lǐng)域?qū)W者的廣泛關(guān)注，如何獲得足量的乳鐵蛋白以便用于后續(xù)制劑的開發(fā)及應(yīng)用是重要的研究課題。目前主要是從乳汁中提取、通過重組表達(dá)系統(tǒng)獲得乳鐵蛋白。

已有研究報道的乳鐵蛋白重組表達(dá)系統(tǒng)有細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)、真菌表達(dá)系統(tǒng)、轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因動物、動物細(xì)胞系表達(dá)系統(tǒng)。研究表明使用乳鐵蛋白重組表達(dá)系統(tǒng)獲得高產(chǎn)量的乳鐵蛋白是可行的。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)可獲得17 mg/L的乳鐵蛋白[19]，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中最高可獲得1200 mg/L的乳鐵蛋白[20]，CHO細(xì)胞系表達(dá)系統(tǒng)可獲得200 mg/L的乳鐵蛋白[21]，轉(zhuǎn)基因羊可獲得30000 mg/L的乳鐵蛋白[22]。開發(fā)更高效的重組表達(dá)系統(tǒng)，尤其是具有產(chǎn)業(yè)化意義的乳鐵蛋白重組表達(dá)系統(tǒng)，對滿足乳鐵蛋白潛在的市場需求具有重要意義。

2 乳鐵蛋白的生物學(xué)功能

乳鐵蛋白廣泛存在于外分泌液中，具有豐富的生物學(xué)功能，已有研究報道乳鐵蛋白具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、促進(jìn)成骨細(xì)胞膠原形成及抑制黑色素形成等功能。

2.1 抗菌

體內(nèi)外研究表明，乳鐵蛋白具有廣泛的抑菌能力，被稱為體內(nèi)第一道免疫防御，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌、真菌均有抑制作用，對金色葡萄球菌、李斯特菌及肺炎球菌這些耐藥株亦有抑制作用，乳鐵蛋白對這些可整合到宿主細(xì)胞的流感嗜血桿菌和鏈球菌也能有效抑制。

目前認(rèn)為乳鐵蛋白的抑菌機(jī)理是通過螯合鐵離子，競爭性地剝奪細(xì)菌生長所需要的鐵元素，從而抑制細(xì)菌的生長[23]；也有研究報道乳鐵蛋白通過與革蘭氏陰性菌的脂多糖(LPS)結(jié)合，使得LPS從細(xì)菌細(xì)胞壁中滲漏，導(dǎo)致細(xì)菌崩解死亡[24-25]；另有報道乳鐵蛋白通過阻止G+性菌和G-性菌與宿主細(xì)胞結(jié)合，從而發(fā)揮抗菌功能[26]。

2.2 抗病毒

研究報道，乳鐵蛋白具有廣泛的抗病毒活性，其對RNA病毒和DNA病毒均有效[27]，可有效抵御多種病毒感染，如輪狀病毒、人免疫缺陷病毒、腸道病毒、腺病毒等。目前乳鐵蛋白抗病毒的機(jī)理尚不明確，主要的抗病毒機(jī)理假設(shè)為：乳鐵蛋白通過與病毒的粘多糖受體結(jié)合，與之結(jié)合的受體主要為硫酸肝素，從而阻止病毒和宿主細(xì)胞結(jié)合，產(chǎn)生抗病毒功能[28-29]。

2.3 抗炎

乳鐵蛋白可以結(jié)合脂多糖，預(yù)防炎癥途徑激活、敗血癥及組織損傷，參與機(jī)體天然免疫和獲得性免疫的調(diào)節(jié)，是重要的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)因子。Sfeir等研究報道，乳鐵蛋白可增加IgA的產(chǎn)生，增加血清IgG(2a)抗體和Th1細(xì)胞因子的分泌，調(diào)節(jié)粘膜免疫和T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答[30]，具有降低免疫細(xì)胞的活化、遷移和生長的功能?？赡芘c乳鐵蛋白的靶標(biāo)為帶負(fù)電荷的分子，這些負(fù)電分子如促炎的微生物分子、脂多糖、病毒DNA、蛋白聚糖鏈和表面細(xì)胞受體。乳鐵蛋白通過與上述受體相互作用，影響免疫細(xì)胞活化、分裂和遷移[31]。

2.4 抗氧化

戴亞妮等通過二苯代苦味肼基( DPPH) 自由基抑制率、羥基自由基抑制率、超氧陰離子自由基抑制率、還原能力和抑制大鼠肝臟體外脂質(zhì)過氧化等試驗評價重組人乳鐵蛋白和牛乳鐵蛋白的體外抗氧化性能，發(fā)現(xiàn)重組人乳鐵蛋白和牛乳鐵蛋白具有抗氧化活性[32]。李婷等采用分光光度法測定乳鐵蛋白的脂質(zhì)過氧化抑制率、羥自由基(·OH)清除率和DPPH自由基清除率，結(jié)果表明乳鐵蛋白對各種自由基的作用能力由大到小為：脂質(zhì)過氧化抑制率>·OH清除率>DPPH自由基清除率[33]。提示乳鐵蛋白可作為天然抗氧化劑用于化妝品制劑開發(fā)。

2.5 促進(jìn)膠原形成

周澤淵等研究表明，乳鐵蛋白可顯著促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞I型膠原蛋白(Col1)mRNA和蛋白的表達(dá)，加入ERK1/2通路抑制劑后，Col1顯著降低，提示乳鐵蛋白可能通過ERK1/2信號通路的傳導(dǎo)影響I型膠原蛋白的表達(dá)[34]。Yaonan等研究發(fā)現(xiàn)50～100 mg/mL的乳鐵蛋白在體外實驗中可促進(jìn)膠原蛋白的形成，然而機(jī)理尚不明確，有待深入研究[35]。

2.6 抑制黑色素形成

宋薇等的專利中報道牛乳鐵蛋白和蝦青素聯(lián)合使用獲得了良好的美白效果，然而未提及美白機(jī)理[36]。Nanase等研究表明人乳鐵蛋白和牛乳鐵蛋白抑制黑色素形成的效果相當(dāng)，該研究團(tuán)隊采用3D皮膚模型對乳鐵蛋白美白效果進(jìn)行研究，結(jié)果表明，乳鐵蛋白可透過皮膚；乳鐵蛋白的美白效果具有劑量效應(yīng)，可減少黑色素20%；乳鐵蛋白通過抑制小眼轉(zhuǎn)錄因子(MITF)，在轉(zhuǎn)錄水平抑制小眼轉(zhuǎn)錄因子mRNA形成，在蛋白水平降解MITF蛋白，降低黑色素形成限速酶-酪氨酸酶的活性，減少黑色素形成的數(shù)量實現(xiàn)美白功效[10]。

3 乳鐵蛋白在化妝品中的應(yīng)用

乳鐵蛋白因具有廣泛的抗菌、抗炎、促進(jìn)膠原蛋白形成及抑制黑素素形成的作用，可應(yīng)用于相應(yīng)功能化妝品的開發(fā)。戴亞妮等已經(jīng)就重組人乳鐵蛋白對哺乳動物局部皮膚和眼睛的刺激作用、皮膚的光毒性進(jìn)行考察，認(rèn)為重組人乳鐵蛋白安全，對皮膚和眼睛均無刺激性且無光毒性[37]。于添等對基因重組乳鐵蛋白致畸效應(yīng)進(jìn)行考察，表明重組人乳鐵蛋白和牛乳鐵蛋白為安全物質(zhì)[38]。乳鐵蛋白作為一種安全物質(zhì)且具有廣泛的生物學(xué)功能被認(rèn)為是一種極具潛力的化妝品新原料，可作為多種效成分用于化妝品制劑的開發(fā)。

3.1 防腐劑

乳鐵蛋白具有廣譜的抗G+性菌、G-性菌及真菌、DNA病毒、RNA病毒等致病微生物的功能，且乳鐵蛋白為體內(nèi)天然成分，可作為新型防腐劑用于化妝品制劑的開發(fā)。研究表明，乳鐵蛋白的抑菌效果和pH值密切相關(guān)，在pH值為7.5～8.0 時抑菌效果最佳。HCO32-濃度與乳鐵蛋白的抑菌活性成正相關(guān)；檸檬酸鈉和陽離子濃度與乳鐵蛋白的抑菌活性呈負(fù)相關(guān)。在50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液中，乳鐵蛋白喪失抑菌活性。宋薇等已經(jīng)將乳鐵蛋白作為防腐成分與其它防腐劑配伍應(yīng)用于化妝品的開發(fā)中[36]。但并見到將乳鐵蛋白作為化妝品制劑防腐劑的系統(tǒng)研究報告，乳貼蛋白在化妝品制劑開發(fā)中的應(yīng)用濃度及其防腐配伍體系有待深入研究。

3.2 痤瘡治療

Kim等對36名受試者進(jìn)行研究，受試者飲用含乳鐵蛋白200 mg的日劑量的發(fā)酵乳制品，發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白組與對照組比較可顯著降低痤瘡的等級，痤瘡體積顯著變小，但乳鐵蛋白組和對照組皮膚水合度和PH值無顯著差異[39]。Mueller等研究表明，39名受試者每次服用含牛乳鐵蛋白100 mg的咀嚼片，每日2次，8周后痤瘡程度顯著降低[40]。宋薇等的專利報道牛乳鐵蛋白制成的化妝品可預(yù)防和祛除痤瘡。但目前市場上尚未見到乳鐵蛋白類化妝品上市銷售。鑒于乳鐵蛋白具有良好的透皮性和廣譜的抗菌、抗炎功效，將乳鐵蛋白及其他具有抗菌、抗炎、調(diào)節(jié)皮脂腺分泌的生物活性分子如重組人溶菌酶、抗菌肽等活性成分組合，可望開發(fā)制得具有痤瘡治療功效且安全性高的新一代生物功能化妝品。

3.3 抗衰

膠原蛋白流失、膠原蛋白錯誤交聯(lián)是影響皮膚衰老進(jìn)程的重要因素，文獻(xiàn)中報道乳鐵蛋白可促進(jìn)細(xì)胞中膠原蛋白的合成，提示乳鐵蛋白可開發(fā)為抗衰老化妝品制劑，刺激機(jī)體合成膠原蛋白來彌補(bǔ)因年齡因素、疾病因素及外部環(huán)境因素引起的皮膚內(nèi)膠原蛋白的流失，從而延緩肌膚衰老。但目前文獻(xiàn)報道的乳鐵蛋白促進(jìn)膠原蛋白合成的功能僅局限于成骨細(xì)胞，未對成纖維細(xì)胞中乳鐵蛋白的功能進(jìn)行研究。后續(xù)研究亟待明確乳鐵蛋白在成纖維細(xì)胞中對膠原蛋白合成是否有影響。

3.4 美白

宋薇等的專利中已經(jīng)將乳鐵蛋白開發(fā)成化妝品，專利報道牛乳鐵蛋白和蝦青素為核心成分的化妝品美白效果顯著。Nanase等對乳鐵蛋白的美白機(jī)理進(jìn)行深入研究，結(jié)果顯示乳鐵蛋白可抑制黑色素形成限速酶(酪氨酸酶)的活性，從而減少黑色素形成，雖然乳鐵蛋白的分子量較大，但3D皮膚模型測定結(jié)果顯示乳鐵蛋白的透皮性較好，開發(fā)為美白化妝品制劑可被有效吸收，研究結(jié)果顯示乳鐵蛋白可減少黑色素數(shù)量的20%。目前關(guān)于乳鐵蛋白美白化妝品制劑研究的報道較少，市場上尚無此類產(chǎn)品銷售，乳鐵蛋白美白制劑的開發(fā)市場潛力大。

4 展望

乳鐵蛋白作為天然活性分子，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、促進(jìn)膠原蛋白合成及抑制黑色素形成等功效，被各領(lǐng)域?qū)W者廣泛關(guān)注。在化妝品領(lǐng)域被認(rèn)為是極具潛力的化妝品新原料，可開發(fā)為多種功效無防腐劑化妝品制劑，具有廣闊的應(yīng)用前景，對乳鐵蛋白功能進(jìn)一步深入研究、并對其安全性持續(xù)監(jiān)測，將促進(jìn)乳鐵蛋白化妝品制劑的開發(fā)。

參考文獻(xiàn)

[1]Sorensen M,Sorensen S.The proteins in whey[J].Compte rendu des Travaux du Laboratoire de Carlsberg Ser Chim,1939,23:55-99.

[2]Johanson B.Isolation of an iron-containing red protein from human milk[J].Acta Chemica Scandinavica,1960,14:510-512.

[3]Iyer S,Lonnerdal B.Lactoferrin,lactoferrin receptors and iron metabolism[J].Eur J Clin Nutr,1993,47:232-241.

[4]Levay P F,Viljoen M.Lactoferrin: A general review[J].Haematologica,1995,80:252-267.

[5]Steijns J M.Milk ingredients as nutraceuticals[J].Int J Dairy Technol,2001,54:81-88.

[6]García-Montoya I A,Cendón T S,Arévalo-Gallegos S,et al.Lactoferrin a multiple bioactive protein: An overview[J].Biochim Biophys Acta,2012,1820(3):226-236.

[7]Hirai Y,Kawakata N,Satoh K,et al.Concentrations of lactoferrin and iron in human milk at different stages of lactation[J].Nutr Sci Vitaminol,1990,36:531.

[8]Teraguchi S,Wakabayashi H,Kuwata H,et al.Protection against infections by oral lactoferrin: Evaluation in animal models[J].Biometals,2004,17:231-234.

[9]Sakai T,Banno Y,Kato Y,et al.Pepsin-digested bovine lactoferrin induces apoptotic cell death with JNK/SAPK activation in oral cancer cells [J].Pharmacol Sci,2005,98:41-48.

[10]Ishii N,Ryu M,Suzuki Y A,et al.Lactoferrin inhibits melanogenesis by down-regulating MITF in melanoma cells and normalmelanocytes [J].Biochem Cell Biol,2017,95(1):119-125.

[11]Chen K,Zhang L,Li H,et al.Iron metabolism in infants:influence of bovine lactoferrin from iron-fortified formula[J].Nutrition,2015,31(2): 304-309.

[12]Shanbacher F L,Goodman R E,Talhouk R S.Bovine mammary lactoferrin: implications from messenger ribonucleic acid (mRNA) sequence and regulation contrary to other milk proteins[J].J Dairy Sci,1992;76:3812-3831.

[13]Van der Strate B W A,Belijaars L,Molema G,et al.Antiviral activities of lactoferrin [J].Antiviral Res,2001;52:225-239.

[14]Nagasako Y,Saito H,Tamura Y,et al.Iron-binding properties of bovine lactoferrin in iron-rich solution [J].J Dairy Sci,1993,76(7):1876-1881.

[15]Hiroaki A,Hitoshi S,Hiroshi M,et al.Heat stability of bovine lactoferrin at acidic pH[J].Dairy Sci,1991,74(1):65-71.

[16]Celia C,Carmen R,Eduardo C,et al.Effect of heat treatment on the antibacterial activity of bovine lactoferrin against three food borne pathogens [J].International Journal of Dairy Technology,2010,63(2):209-215.

[17]Luis M,Lourdes S,Denis R H,et al.Thermal denaturation of human lactoferrin and its effect on the ability to bind iron[J].Agric Food Chem,1998,46:3964-3970.

[18]閆序東,王彩云,云戰(zhàn)友.乳鐵蛋白熱穩(wěn)定性研究[J].中國乳品工業(yè),2014,42(4):18-20.

[19]Wang J R,Tian Z G,Teng D,et al.Expression and characterization of Kunming mice lactoferrin and its N-lobe[J].Biometals,2010,23(3):523-530.

[20]Jiang T M,Chen L J,Jia S Q,et al.High-level expression and production of human lactoferrin in Pichia pastoris[J].Dairy Sci Technol,2008,88(2):173-181.

[21]Blachier F,Tomé D.Effects of lactoferrin on intestinal epithelial cell growth and differentiation: an in vivo and in vitro study[J].Biometals,2014,27(5): 857-874.

[22]Yu H Q,Chen J Q,Sun W,et al.The dominant expression of functional human lactoferrin in transgenic cloned goats using a hybrid lactoferrin expression construct[J].J Biotechnol,2012,161(3):198-205.

[23]Sherman M P,Bennett S H,Hwang F F,et al.Neonatal small bowel epithelia: enhancing anti-bacterial defense with lactoferrin and lactobacillus GG[J].Biometals,2004,17(3): 285-289.

[24]Majerle A,Kidric J,Jerala R.Enhancement of antibacterial and lipopolysaccharide binding activities of a human lactoferrin peptide fragment by the addition of acyl chain[J].J Antimicrob Chemother,2003,51(5):1159-1165.

[25]Orsi N.The antimicrobial activity of lactoferrin: current status and perspectives[J].Biometals,2004,17(3):189-196.

[26]Ellison R T,Giehl T J,LaForce F M.Damage of the outer membrane of enteric gram-negative bacteria by lactoferrin and transferring[J].Infect Immun,1988,56(11):2774-2781.

[27]Ng T B,Cheung R C,Wong J H,et al.Antiviral activities of whey proteins[J].Appl Microbiol Biotechnol,2015,99(17):6997-7008.

[28]Hasegawa K,Motsuchi W,Tanaka S,et al.Inhibition with lactoferrin of in vitro infection with human herpes virus[J].Jpn J Med Sci Biol,1994,47(2):73-85.

[29]Seganti L,Di Biase A M,et al.Antiviral activity of lactoferrin towards naked viruses[J].Biometals,2004,17(3):295-299.

[30]Sfeir R M,Dubarry M,Boyaka P N,et al.The mode of oral bovine lactoferrin administration influences mucosal and systemic immune responses in mice[J].J Nutr,2004,134(2):403-409.

[31]Legrand D.Overview of lactoferrin as a natural immune modulator[J].J Pediatr,2016,173:S10-S15.

[32]戴亞妮,于 添,朱 松,等.重組人乳鐵蛋白抗氧化活性研究[J].中國食品衛(wèi)生雜志,2017,9(3):251-256.

[33]李 婷,王彩云,閆序東,等.重組人乳鐵蛋白抗氧化活性研究[J].食品科學(xué),2012,33(21):111-113,193-197.

[34]周澤淵,楊禎瑾,黃 鸝,等.乳鐵蛋白及張應(yīng)力對成骨細(xì)胞成骨功能影響的實驗研究[J].現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志,2017,31(4):193-197.

[35]Zhang Yaonan,Wang Xiao,Qiu Yiwei,et al.Effect of indomethacin and lactoferrin on human tenocyte proliferation and collagen formation in vitro[J].Biochem Biophys Res Commun,2014,454(2):301-307.

[36]宋 薇.一種含牛乳鐵蛋白的化妝品:中國,201410036850.7[P].2014-01-26.

[37]戴亞妮,楊雪珍,王建武,等.重組人乳鐵蛋白作為化妝品新原料的安全性評價[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2017,27(13):1851-1854.

[38]于 添,劉 燊,王建武,等.重組人乳鐵蛋白大鼠致畸試驗[J].毒理學(xué)雜志,2017,31(3):247-250.

[39]Kim J,Ko Y,Park Y K,et al.Dietary effect of lactoferrin-enriched fermented milk on skin surface lipid and clinical improvement of acne vulgaris[J].Nutrition,2010,26(9):902-909.

[40]Mueller E A,Trapp S,Frentzel A,et al.Efficacy and tolerability of oral lactoferrin supplementation in mild to moderate acne vulgaris: An exploratory study[J].Curr Med Res Opin,2001,27(4):793-797.