潘毅++何飛民++陳軍喜++夏芝輝++閆智杰++吳麗麗++程英

[摘要]目的 探討低分子肝素對膿毒癥大鼠肝損傷的保護作用及其機制。方法 將50只雄性SD大鼠隨機分為對照組（10只）、模型組（20只）、治療組（20只）。采用盲腸結(jié)扎穿刺法（CLP）制作膿毒癥模型，模型組采用尾靜脈注射生理鹽水，治療組采用尾靜脈注射低分子肝素。檢測大鼠血清在不同時間點的血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）水平，并觀察12 h肝臟組織病理學改變。結(jié)果 與對照組比較，模型組和治療組各時間點的血清ALT、AST、PT、APTT、TNF-α、IL-6水平均明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，治療組血清ALT、AST、PT、APTT、TNF-α、IL-6水平在不同時間點（6、12 h）有所降低（P<0.05）。治療組12 h肝組織病理學改變較模型組明顯改善。結(jié)論 低分子肝素對膿毒癥大鼠肝損傷具有保護作用，其機制可能與其抗凝、抑制炎癥因子的釋放有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]低分子肝素；膿毒癥；肝損傷；炎癥因子

[中圖分類號] R332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）02（c）-0007-04

Experimental study of protective effect of low molecular weight heparin on hepatic injury induced by sepsis in rat

PAN Yi1 HE Fei-min2 CHEN Jun-xi1 XIA Zhi-hui1 YAN Zhi-jie1 WU Li-li1 CHENG Ying1

1.Intensive Care Unit，the 4th Affiliated Hospital of Nanchang University in Jiangxi Province，Nanchang 330000，China；2.Jiangxi Health Vocational College in Jiangxi Province，Nanchang 330000，China

[Abstract]Objective To explore the protective effect and mechanism of low molecular weight heparin in liver injury of septic rats.Methods 50 male SD rats were randomly divided into control group （10 cases），model group （20 cases） and treatment group （20 cases）.Cecal ligation puncture （CLP） was used to made sepsis model.Rats in model group were given tail vein injection saline，and the treatment group was given tail vein injection low molecular weight heparin.The level of serum alanine aminotransferase （ALT），aspartate aminotransferase （AST），prothrombin time （PT），activated partial thromboplastin time （APTT），tumor necrosis factor-α（TNF-α） and interleukin-6 （IL-6） of rats′ serum was detected at different time points，and histopathological changes of liver were observed at 12 h.Results Compared with control group，the level of serum ALT，AST，PT，APTT，TNF-αand IL-6 in model group and treatment group at different time points were obviously increased （P<0.01）.Compared with model group，the level of serum ALT，AST，PT，APTT，TNF-α and IL-6 in treatment group at different time points （6 and 12 h） were decreased （P<0.05）.Histopathological changes of liver at 12 h in treatment group obviously improved than model group.Conclusion Low molecular weight heparin has protective effect on liver damage of septic rats，the mechanism may be related to anticoagulation and inhibition of release of inflammatory factors.

[Key words]Low molecular weight heparin；Sepsis；Liver injury；Inflammatory factor當前，膿毒癥的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，由于膿毒癥極易引起多臟器障礙綜合征，是危重病患者死亡的主要原因之一。肝臟是人體重要的器官之一，承擔包括生物合成、代謝、清除毒物和免疫防御等多種功能，同時它也易受各種代謝產(chǎn)物、毒物、微生物、循環(huán)因素等的侵害，是膿毒癥早期易損器官[1]，因此，尋求一種有效的藥物防治患者膿毒癥過程中誘發(fā)的急性肝損傷并提高其存活率已成為危重病醫(yī)學亟待解決的問題。本實驗采用經(jīng)典的大鼠盲腸結(jié)扎穿孔膿毒癥造模，使用低分子肝素從抗凝、調(diào)節(jié)炎癥反應、減輕脂質(zhì)過氧化損傷、清除自由基等途徑共同干預，研究其對膿毒癥誘發(fā)急性肝損傷的保護作用及其作用機制，為低分子肝素治療膿毒癥肝損傷提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗動物和膿毒癥模型制備

選取購自南昌大學醫(yī)學院實驗動物中心的Wistar雄性大鼠50只，體重（180±20）g。以10%水合氯醛（3 ml/kg）經(jīng)腹腔麻醉后，于前腹正中作長約2 cm切口，游離腸系膜和盲腸，在距盲腸末端1 cm處用7-0絲線結(jié)扎盲腸，用22G針頭于盲端部位貫通穿刺2次，兩針孔相距約3 mm，還納腸管，逐層縫合關(guān)腹。術(shù)畢，碘伏消毒包扎傷口。對照組動物除不行盲腸結(jié)扎和穿孔外，其余步驟與CLP組相同。模型成功標準：發(fā)熱（肛溫超過自身正常參考值1℃）、心率加快（約為自身正常參考值的2倍）、呼吸頻率加快（約為自身正常參考值的2倍），TNF-α等急性期血漿炎癥介質(zhì)顯著增高等。

1.2實驗分組

實驗大鼠隨機分為對照組10只，模型組20只、治療組20只共三組50只；模型組給予生理鹽水1 ml尾靜脈注射，治療組給予低分子肝素100 U/kg體重加生理鹽水稀釋至1 ml尾靜脈注射。造模后根據(jù)6、12 h不同的觀察的時間點將模型組和治療組各分為2組，每組10只。

1.3主要試劑及儀器

10%水合氯醛（南昌大學醫(yī)學院實驗中心），0.9%氯化鈉注射液100 ml∶0.9 g（江西科倫藥業(yè)有限公司，批號：F16061904）；低分子肝素鈣注射液0.4 ml：4100AXaIU（河北常山生化藥業(yè)有限公司，批號：F402160906）；大鼠TNF-α、IL-6的ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程公司）。生命體征監(jiān)護儀（型號Bene View T5，深圳邁瑞公司），-70℃超低溫冰箱（日本SANYO公司）；高速臺式離心機TCL-16G（上海安亭科學儀器廠）；貝克曼AU2700全自動生化分析儀，希森美康CS-5100全自動血凝儀及與儀器配套的專用含鈣組織凝血活酶試劑盒，德國GeneCore公司全自動酶聯(lián)免疫檢測儀，OLYMPUS BX41光學顯微鏡，HMIAS-200W多功能病理圖像分析系統(tǒng)（武漢千屏影像技術(shù)有限責任公司）等。

1.4 樣本采集

經(jīng)右側(cè)頸動脈放血采集血樣2.0 ml，加入枸櫞酸鈉抗凝的真空采血管，立即離心（2000 r/min，7 min）后，取上清保存于-70℃的冰箱待檢。為了避免批間誤差的測量誤差，在全部標本收集完后，一次性成批檢驗。

1.5肝臟病理標本的制作

在12 h采血后處死大鼠，留取各組大鼠肝組織同一部位以及取肉眼觀察有膿點的部位，將取下來的組織用10%甲醛固定后，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、蘇木精-伊紅染色（HE染色）、透明處理封片后，利用多功能病理圖像分析系統(tǒng)放大400倍照相，觀察肝臟的病理學改變。

1.6 觀察內(nèi)容及方法

觀察各組大鼠一般狀況（血壓、心率、體溫、呼吸頻率等生命體征變化）。各實驗組大鼠手術(shù)后分別于0、6、12 h時間點從大鼠右側(cè)頸動脈取血留取標本，全自動生化分析儀檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）水平；全自動血凝儀檢測凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）水平；采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清中的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）水平。

1.7 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標準（x±s）表示，多組比較采用重復測量的方差分析，先行方差齊性檢驗，方差齊，各組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1低分子肝素對大鼠ALT、AST水平的影響

與對照組比較，模型組和治療組各時間點血清ALT、AST水平均明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，治療組血清ALT、AST水平降低，兩組在不同時間點（6、12 h）差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表1）。

2.2各組大鼠不同時間點血清PT、APTT的比較

與對照組比較，模型組和治療組各時間點的血清PT、APTT水平均明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，治療組血清PT、APTT降低，兩組在不同時間點（6、12 h） 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表2）。

與對照組比較，aP<0.01；與模型組同時間比較，bP<0.05

2.3各組大鼠不同時間點血清TNF-α、IL-6水平的比較

對照組血清TNF-α、IL-6處于低水平，模型組和治療組各時間點的血清TNF-α、IL-6水平顯著高于對照組（P<0.01）。與模型組比較，治療組血清TNF-α、IL-6降低，兩組在不同時間點（6、12 h）差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表3）。

2.4肝臟組織病理損傷的改變

制模后12 h光鏡下可見，對照組肝細胞結(jié)構(gòu)完整，肝小葉形態(tài)正常，肝血竇無擴張和炎性細胞浸潤；模型組肝細胞腫脹、空泡樣脂肪變性，肝索排列紊亂，肝血竇擴張，少量淤血，并可見炎性細胞沒潤，局灶性肝細胞壞死；治療組肝細胞水腫、淤血減輕，輕度脂肪變性，肝細胞壞死明顯減少，肝血竇中中性粒細胞浸潤較輕（圖1）

3討論

膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應綜合征，往往導致多器官功能受損，是危重病患者死亡的重要原因之。本實驗選擇膿毒癥導致的肝損傷的大鼠作為研究對象，一是因為肝臟是膿毒癥最常受累的器官之一，導致肝功能障礙甚至肝功能衰竭；二是肝細胞受到損傷時，使其代謝、合成、解毒、分泌與免疫功能發(fā)生障礙，這些變化又反過來加劇了機體的損傷，從而使膿毒癥進一步惡化[2]，因此，防治膿毒癥肝損傷是膿毒癥研究的重要課題，積極開展膿毒癥肝損傷研究具有較大的現(xiàn)實意義。

膿毒癥引起肝細胞損傷的發(fā)病機制復雜，研究表明，在膿毒癥發(fā)生過程中肝組織經(jīng)受了內(nèi)毒素血癥、炎癥損傷和缺血缺氧性損傷等的多重打擊[3]。膿毒癥早期，腸黏膜通透性增高，腸道細菌或內(nèi)毒素通過門靜脈移位至肝臟，內(nèi)毒素等作用于肝臟庫普弗細胞可釋放大量細胞因子[4]；其中，促炎細胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6表達明顯高于抗炎細胞因子如IL-4、IL-10，導致機體產(chǎn)生過度炎癥反應[5]，這些炎癥反應進一步通過炎癥級聯(lián)反應，生成大量氧自由基和過氧化反應產(chǎn)物，引發(fā)膜脂質(zhì)過氧化反應，導致肝細胞膜及線粒體膜完整性破壞，細胞及線粒體腫脹，呼吸鏈完整性遭受破壞，ATP合成減少，能量代謝障礙，引起肝細胞壞死或凋亡[6]。在膿毒癥時，機體處于高代謝狀態(tài)，肝臟是參與眾多物質(zhì)代謝的重要器官，多種激素、神經(jīng)、體液因子等可引起肝臟發(fā)生高代謝，如蛋白合成與分解均增加、糖異生增強，這使肝臟氧耗超過氧供。此時即使肝血流量不減少，肝臟也存在相對性缺血、缺氧[7]。同時，肝臟微血管收縮、黏附分子過度表達、吞噬細胞功能下降、分泌型細胞因子（IL-1、血小板活化因子等）產(chǎn)生等通過物理性阻塞和炎癥性損傷加劇了肝臟微循環(huán)障礙，使肝臟缺氧加重，也是膿毒癥引起肝細胞損傷的重要原因[8]。

在針對膿毒癥肝損傷治療方面，依據(jù)諸多可能的發(fā)病機制，許多學者采用了相應的保肝藥物治療，如以異甘草酸鎂為代表的抗炎類藥物，以多烯磷脂酰膽堿為代表的肝細胞膜修復保護類藥物，以谷胱甘肽為代表的解毒類藥物，以水飛薊素為代表的抗氧化類藥物，以S-腺苷蛋氨酸為代表的利膽類藥物等。膿毒癥肝損傷的發(fā)病機制是多種因素迭加的，是一個十分復雜的過程，上述藥物在某一方面，一定程序上具有一定作用，但尚未完全解決根本問題。近20多年來治療膿毒癥的重點主要是針對體內(nèi)失控的炎癥反應，包括各種炎癥介質(zhì)的單克隆抗體、各種致炎細胞因子的特異性抑制劑及糖皮質(zhì)激素等。但是多項大規(guī)模、多中心的臨床試驗結(jié)果均未證實這種抗炎治療能夠改善膿毒癥患者的預后[9]。

多項研究表明，在膿毒癥過程中凝血系統(tǒng)在內(nèi)毒素等細菌成分和單核細胞、內(nèi)皮細胞表達的組織因子及大量釋放的炎性介質(zhì)損傷血管內(nèi)皮細胞的共同作用下被激活[10]；同時，纖溶途徑因纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）產(chǎn)生的增加，導致纖溶酶原轉(zhuǎn)化成纖溶酶顯著減少，引起機體的凝血、纖溶系統(tǒng)功能紊亂[11]；此外， 膿毒癥肝功能不全，生理性抗凝物質(zhì)如抗凝血酶Ⅲ、蛋白C系統(tǒng)和組織因子途徑抑制物的在肝臟合成受阻，也參與了膿毒癥凝血功能障礙的發(fā)生、發(fā)展。這些炎癥反應和凝血激活的相互促進、相互影響構(gòu)成了膿毒癥的病理、生理過程[12]，隨著對膿毒癥炎癥和凝血兩途徑相互間作用的認識不斷加深，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，膿毒癥炎癥反應和凝血功能紊亂造成的微循環(huán)障礙與膿毒癥發(fā)生、發(fā)展及預后密切相關(guān)[13]，利用抗凝物質(zhì)對膿毒癥進行干預以改善各組織器官損傷已成為膿毒癥治療研究的熱點[14]?；谶@些最新研究成果，本研究探討低分子肝素對膿毒癥大鼠肝損傷保護作用的可行性及其相關(guān)機制，期望為臨床治療膿毒癥肝損傷找到確實有效，又經(jīng)濟可行的治療方法。

低分子肝素由普通肝素經(jīng)化學或酶學方法解聚而成，相對分子質(zhì)量為45 000 D，因為其具有相對較低的抗凝活性，在臨床上彌補了普通肝素容易導致出血、生物利用度低等缺點而被廣泛應用。低分子肝素作為一種抗凝藥物，具有快速和持續(xù)抗血栓形成作用，能夠抑制膿毒癥患者炎性介質(zhì)和氧自由基的釋放，抑制細胞黏附和激活、補體系統(tǒng)的激活，保護血管內(nèi)皮細胞的連續(xù)性和完整性，從而改善膿毒癥患者微循環(huán)功能[15]。低分子肝素治療膿毒癥的臨床報告呈增多趨勢，有一定療效，但基礎(chǔ)研究很少，缺乏基礎(chǔ)理論依據(jù)，有待于進一步研究。本實驗結(jié)果表明低分子肝素對肝損傷具有保護作用。應用低分子肝素后，治療組ALT、AST、PT、APTT、TNF-α、IL-6較模型組明顯下降，表明低分子肝素能夠抑制炎癥瀑布效應和凝血級聯(lián)反應，改善凝血功能障礙，從而減輕膿毒癥肝損傷，改善肝功能。

綜上所述，低分子肝素對膿毒癥大鼠肝損害具有保護作用，其機制可能與其抗凝、抑制炎癥因子的釋放有關(guān)。

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（收稿日期：2016-11-09 本文編輯：許俊琴）