伍小敏，蔡放，王宏法，王文元，沈社良，胡雙飛

（浙江省人民醫(yī)院，浙江 杭州 310014）

羅哌卡因?qū)ζつw損傷愈合及GM-CSF表達(dá)的影響*

伍小敏，蔡放，王宏法，王文元，沈社良，胡雙飛

（浙江省人民醫(yī)院，浙江 杭州 310014）

目的觀察羅哌卡因?qū)ζつw損傷小鼠皮膚愈合及粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）表達(dá)的影響。方法 將小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（羅哌卡因）和對(duì)照組（生理鹽水），兩組小鼠創(chuàng)面進(jìn)行Masson染色，測(cè)定GM-CSF濃度和羥脯氨酸水平，記錄創(chuàng)面的愈合率和愈合時(shí)間。結(jié)果 第5天，實(shí)驗(yàn)組綠染膠原纖維沉積量較對(duì)照組多；第10天，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組創(chuàng)緣上皮增生明顯。實(shí)驗(yàn)組小鼠第5天GM-CSF含量高于對(duì)照組（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組小鼠創(chuàng)面愈合時(shí)間短于對(duì)照組（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組大鼠第5天和第10天創(chuàng)面愈合比例高于對(duì)照組（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組大鼠第5天和第10天創(chuàng)面羥脯氨酸水平高于對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)論 羅哌卡因局部浸潤(rùn)可以促進(jìn)小鼠全層皮膚損傷的愈合，其機(jī)制可能與局部浸潤(rùn)羅哌卡因能夠促進(jìn)GM-CSF的表達(dá)有關(guān)。

局部浸潤(rùn)；羅哌卡因；皮膚愈合；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子

術(shù)后鎮(zhèn)痛有多種模式，傷口浸潤(rùn)鎮(zhèn)痛不良反應(yīng)少，局部麻醉藥物中毒的發(fā)生率低，價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)單，在臨床中被廣泛應(yīng)用[1-2]。但是有研究發(fā)現(xiàn)，局部麻醉藥物有引起軟骨溶解的風(fēng)險(xiǎn)[3]。其是否影響傷口愈合尚不清楚。多種炎癥因子參與傷口愈合，局部麻醉藥物具有抗炎作用[4-5]。粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）作為生長(zhǎng)因子，具有多種功能，在創(chuàng)面修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用[6-7]。本實(shí)驗(yàn)研究羅哌卡因是否對(duì)傷口GM-CSF的表達(dá)及創(chuàng)面愈合產(chǎn)生影響。

附圖 兩組小鼠創(chuàng)面比較 （Masson染色×40）

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

雄性、清潔級(jí)、6周齡、昆明小鼠購(gòu)自浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙）2010-0177，體重24～32 g。羅哌卡因（規(guī)格：75 mg/10 ml，無錫阿斯利康有限公司），二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒、鼠GM-CSF酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）實(shí)驗(yàn)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 42只小鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為實(shí)驗(yàn)組（羅哌卡因）和對(duì)照組（生理鹽水），每組21只小鼠。

1.2.2 小鼠全層皮膚損傷模型的復(fù)制 兩組小鼠采用戊巴比妥鈉麻醉成功后，固定到實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，硫化鈉脫去背部毛并消毒，實(shí)驗(yàn)組小鼠皮下注射羅哌卡因（1 ml/kg），對(duì)照組小鼠皮下注射等量生理鹽水，給藥后10 min，在小鼠背部以脊柱為中線切除全層皮膚（約1 cm×1 cm）至深筋膜，創(chuàng)面不縫合不包扎。

1.2.3 制備標(biāo)本 分別在建模后第5和第10天每組選擇7只小鼠處死，處死后采用透明膜法測(cè)量創(chuàng)面面積，取包括部分正常創(chuàng)緣的小鼠創(chuàng)面組織標(biāo)本，部分用于測(cè)定GM-CSF水平，部分用于Masson染色，部分用于羥脯氨酸測(cè)定。

1.2.4 Masson染色 將兩組小鼠組織在甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片機(jī)切成4 μm厚切片，脫臘至水后Masson染色，醋酸水溶液沖洗，加入磷鎢酸5 min，醋酸水溶液沖洗，亮綠染色液染色，醋酸水溶液沖洗，染色后細(xì)胞核被染成藍(lán)黑色，膠原纖維被染成綠色，神經(jīng)、纖維素、肌肉被染成紅色。

1.2.5 小鼠創(chuàng)面GM-CSF測(cè)定 采用ELISA法測(cè)定創(chuàng)面組織中GM-CSF濃度，具體操作步驟按照鼠GM-CSF ELISA試劑盒說明書進(jìn)行，小鼠創(chuàng)面組織蛋白量采用BCA法進(jìn)行測(cè)定，GM-CSF濃度用GMCSF的ELISA測(cè)定值/BCA蛋白定量測(cè)定值表示。

1.2.6 小鼠創(chuàng)面愈合率測(cè)定 小鼠處死后采用透明膜法測(cè)量創(chuàng)面面積，計(jì)算創(chuàng)面愈合率，創(chuàng)面愈合率=[（創(chuàng)面初始面積-處死時(shí)創(chuàng)面面積）/創(chuàng)面初始面積]×100%。

1.2.7 小鼠創(chuàng)面組織羥脯氨酸測(cè)定 羥脯氨酸可反應(yīng)膠原蛋白沉積量，稱取10 mg組織塊，堿性水解液水解，將PH值調(diào)整為6.0～6.8，紫外分光光度計(jì)測(cè)定550 nm波長(zhǎng)處吸光度值，再將吸光度值轉(zhuǎn)化為羥脯氨酸。

1.2.8 小鼠創(chuàng)面愈合時(shí)間 每組取7只小鼠，觀察并記錄創(chuàng)面完全愈合時(shí)需要的時(shí)間，創(chuàng)面完全愈合的標(biāo)準(zhǔn)為肉眼看到創(chuàng)面完全上皮化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠的創(chuàng)面比較

第5天，實(shí)驗(yàn)組和觀察組小鼠創(chuàng)面均見綠染膠原纖維沉積，其中實(shí)驗(yàn)組綠染膠原纖維沉積量較對(duì)照組多。第10天，兩組小鼠創(chuàng)面均出現(xiàn)上皮化，其中實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組創(chuàng)緣上皮增生明顯。見附圖。

2.2 兩組小鼠的創(chuàng)面GM-CSF含量比較

實(shí)驗(yàn)組小鼠第5天GM-CSF含量與對(duì)照組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組小鼠第5天GM-CSF含量高于對(duì)照組。第1和第10天，兩組小鼠創(chuàng)面GM-CSF含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 兩組小鼠的創(chuàng)面愈合時(shí)間比較

實(shí)驗(yàn)組小鼠創(chuàng)面愈合時(shí)間為（16.86±1.12）d，對(duì)照組小鼠創(chuàng)面愈合時(shí)間為（20.93±1.67）d，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.107，P=0.000），實(shí)驗(yàn)組小鼠創(chuàng)面愈合時(shí)間短于對(duì)照組。

2.4 兩組小鼠的創(chuàng)面愈合率比較

兩組大鼠第5天和第10天創(chuàng)面愈合比例比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組大鼠第5和第10天創(chuàng)面愈合比例高于對(duì)照組。第1天，兩組小鼠創(chuàng)面愈合比例比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.5 兩組小鼠創(chuàng)面的羥脯氨酸水平比較

兩組大鼠第5和第10天創(chuàng)面羥脯氨酸水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組大鼠第5和第10天創(chuàng)面羥脯氨酸水平高于對(duì)照組。第1天，兩組小鼠創(chuàng)面羥脯氨酸水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表1 兩組小鼠創(chuàng)面GM-CSF含量比較（n=7，±s）

表1 兩組小鼠創(chuàng)面GM-CSF含量比較（n=7，±s）

表2 兩組小鼠創(chuàng)面愈合率比較 （n=7，%，±s）

表2 兩組小鼠創(chuàng)面愈合率比較 （n=7，%，±s）

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表3 兩組小鼠創(chuàng)面的羥脯氨酸水平比較（n=7，μg/mg，±s）

表3 兩組小鼠創(chuàng)面的羥脯氨酸水平比較（n=7，μg/mg，±s）

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3 討論

傷口愈合包括3個(gè)時(shí)期：炎癥期、粒化增殖期、重塑期。①在傷口愈合炎癥期，被激活的血小板發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，釋放趨化因子和生長(zhǎng)因子，白細(xì)胞游走殺滅細(xì)菌，角化細(xì)胞游走進(jìn)行表皮再植[8-9]。②在傷口愈合粒化增殖期，產(chǎn)生膠原蛋白，生成上皮和肉芽組織，內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移，形成新的血管，促進(jìn)細(xì)胞外成分及膠原的分泌，成纖維細(xì)胞增長(zhǎng)，成纖維細(xì)胞釋放膠原蛋白，膠原戴白和成纖維細(xì)胞的交聯(lián)增強(qiáng)傷口的張力。③在傷口愈合重塑期，細(xì)胞通過凋亡的方式死亡，傷口組織影響賴氨?；醯姆置诤湍z原束的大小，影響膠原蛋白間的交聯(lián)，傷口愈合的各個(gè)時(shí)期互相交融。在皮膚受到損傷后均會(huì)發(fā)生炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)在傷口愈合中發(fā)揮啟動(dòng)作用，為創(chuàng)面修復(fù)的起始階段[10-11]。巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞是炎癥反應(yīng)的主要細(xì)胞，局部麻醉藥物能夠抑制白細(xì)胞遷移，降低炎癥介質(zhì)水平，具有明顯的抗炎作用，局部麻醉藥物局部給藥通過周圍神經(jīng)末梢釋放神經(jīng)肽類物質(zhì)及組織損傷后的固有細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)，羅哌卡因作為局部麻醉藥物的一種，也具有抗炎作用[12-14]。

GM-CSF已成為放化療伴白細(xì)胞缺乏患者及嚴(yán)重感染伴免疫功能低下患者的重要治療方法。其能夠刺激造血祖細(xì)胞分化增殖和成熟，并誘導(dǎo)多種細(xì)胞的增殖和分化。GM-CSF可以被成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、角質(zhì)化細(xì)胞等多種創(chuàng)面修復(fù)細(xì)胞成分分泌，可能為創(chuàng)面修復(fù)過重中的重要生長(zhǎng)因子[15-16]。為探討羅哌卡因?qū)ζつw愈合及GM-CSF表達(dá)的影響，本文復(fù)制小鼠全層皮膚損傷模型，觀察羅哌卡因?qū)ζつw愈合及GM-CSF表達(dá)的影響，通過Masson染色觀察創(chuàng)面再上皮化程度和膠原纖維沉積情況，通過組織羥脯氨酸水平測(cè)定觀察膠原蛋白的沉積量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，羅哌卡因可增加綠染膠原纖維沉積量，促進(jìn)創(chuàng)緣上皮增生，促進(jìn)創(chuàng)面組織GM-CSF分泌，縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間，增加創(chuàng)面愈合率，增加創(chuàng)面羥脯氨酸水平。本研究結(jié)果表明，羅哌卡因?qū)ζつw愈合具有促進(jìn)作用，其機(jī)制可能與羅哌卡因能夠促進(jìn)創(chuàng)面組織GM-CSF分泌有關(guān)：①GM-CSF誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖，促進(jìn)新生血管形成，為組織修復(fù)提供細(xì)胞成分；②GM-CSF通過對(duì)巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、朗罕細(xì)胞的趨化作用使各種炎癥細(xì)胞在創(chuàng)面區(qū)浸潤(rùn)，形成肉芽組織，為創(chuàng)面修復(fù)提供必要條件；③GM-CSF促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和人角質(zhì)化細(xì)胞遷移和增殖，加速再上皮化。在傷口愈合過程中，巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)，羅哌卡因作為局部麻醉藥物具有抑制炎癥反應(yīng)的作用，能夠減少炎癥介質(zhì)，抑制白細(xì)胞遷移。羅哌卡因還可通過周圍神經(jīng)末梢釋放神經(jīng)肽類物質(zhì)參與炎癥反應(yīng)，羅哌卡因的局部浸潤(rùn)使切口處P物質(zhì)濃度增加，P物質(zhì)濃度的增加促進(jìn)成纖維細(xì)胞核角蛋白細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，GM-CSF由成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌，因此羅哌卡因促進(jìn)GM-CSF分泌可能與增加局部P物質(zhì)濃度有關(guān)，具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。

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（童穎丹 編輯）

Effect of local infiltration of Ropivacaine on healing of fullthickness skin lesion and expression of GM-CSF in mice*

Xiao-min Wu,Fang Cai,Hong-fa Wang,Wen-yuan Wang,She-liang Shen,Shuang-fei Hu
(Zhejiang Provincial People's Hospital,Hangzhou,Zhejiang 310014,China)

ObjectiveTo observe the effect of Ropivacaine on the healing of skin and the expression of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF)in mice with skin injury.Methods The mice were randomly divided into experimental group(Ropivacaine group)and control group(saline group).The wounds of mice in the two groups were stained by Masson staining.The concentrations of GM-CSF and hydroxyproline were determined.The wound healing rate and healing time were recorded.Results On the 5th day,the amount of green-stained collagen fibers in the experimental group was larger than that in the control group. On the 10th day,hyperplasia of margin epithelium in the experimental group was more obvious than that in the control group.The level of GM-CSF in the experimental group was significantly higher than that in the control group on the 5th day(P＜0.05).The wound healing time in the experimental group was shorter than that in the control group (P＜0.05).The wound healing ratio and the hydroxyproline level of the wound in the experimental group were higher than those in the control group on the 5th and the 10th day (P＜0.05). Conclusions Local infiltration of Ropivacaine can promote the healing of full-thickness skin lesions in mice, and the mechanism may be related to the promotion of GM-CSF expression.

local infiltration;Ropivacaine;skin healing;granulocyte-macrophage colony-stimulating factor

R614

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.06.005

1005-8982（2017）06-0023-04

2016-11-16

浙江省自然科學(xué)基金（No：LY15H090014）