張麗

【摘 要】目的：探討4型超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道在1型糖尿病大鼠房室結(jié)中的表達(dá)。方法：腹腔注射鏈脲佐菌素溶液建立1型糖尿病大鼠模型，通過免疫熒光染色觀察HCN4在房室結(jié)中的表達(dá)，免疫印記檢測(cè)HCN4在房室結(jié)中蛋白水平表達(dá)變化。結(jié)果：HCN4在正常大鼠房室結(jié)細(xì)胞膜上可見有相對(duì)聚集的點(diǎn)狀、條索狀表達(dá)，1型糖尿病大鼠HCN4在細(xì)胞膜上表達(dá)減少，呈點(diǎn)狀表達(dá)。Western blot顯示糖尿病大鼠房室結(jié)HCN4蛋白質(zhì)表達(dá)明顯降低（P<0.05）。結(jié)論：正常大鼠房室結(jié)HCN4有表達(dá)，1型糖尿病大鼠房室結(jié)HCN4在蛋白質(zhì)水平表達(dá)下降。

【關(guān)鍵詞】1型糖尿病 HCN4 房室結(jié)

1型糖尿?。═1DM）患病率呈世界性上升趨勢(shì)，絕大部分患者死于心血管系統(tǒng)疾病[1]。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者在出現(xiàn)臨床癥狀前已出現(xiàn)心室舒張功能障礙，原因是高血糖狀態(tài)下心肌中K+流受抑制、Ca2+泵活性降低等電生理學(xué)異常導(dǎo)致心肌功能降低[2，3，4]。房室結(jié)是心傳導(dǎo)系的重要組成，超級(jí)化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道（HCN）是其自律性產(chǎn)生的重要基礎(chǔ)，其中HCN4通道在房室結(jié)上有顯著的表達(dá)，HCN4異常表達(dá)與房室結(jié)功能紊亂密切相關(guān)[5]。目前對(duì)于T1DM房室結(jié)中HCN4變化尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過建立1型糖尿病大鼠動(dòng)物模型，運(yùn)用免疫熒光、Western-blot的方法，觀察大鼠房室結(jié)HCN4表達(dá)變化，為認(rèn)識(shí)、預(yù)防和治療糖尿病相關(guān)的心肌病提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

成年健康雄性SD大鼠60只，體重（170±20）g（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。鏈脲佐菌素（美國(guó)Sigma公司）、兔多克隆抗HCN4通道蛋白抗體（以色列Alomone公司）、TR標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（美國(guó)Santa cruz公司）、Anti-β-Actin及Goat Anti-Rabbit IgG/HRP二抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 1型糖尿病動(dòng)物模型制作及實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組（20只）和實(shí)驗(yàn)組（40只）。兩組大鼠普通飲食喂養(yǎng)1w后禁食12h，期間自由飲水，對(duì)照組大鼠腹腔一次性注射不含STZ的檸檬鈉-檸檬酸緩沖液，實(shí)驗(yàn)組大鼠按劑量55mg/kg一次性腹腔注射STZ，3d后取尾靜脈血測(cè)空腹血糖，血糖≥16.7mmol/L者為糖尿病大鼠。DM大鼠模型成功后，兩組均持續(xù)喂養(yǎng)3m。

1.2.2 取材

水合氯醛腹腔麻醉后，開胸取房室結(jié)組織，一部分（對(duì)照組10只、實(shí)驗(yàn)組14只）液氮速凍，-80℃保存，用作冰凍切片；一部分（對(duì)照組10只、實(shí)驗(yàn)組15只）液氮速凍，-80℃保存，用于免疫印跡實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 免疫熒光染色分析

Leica CM1850恒冷冰凍切片機(jī)中進(jìn)行切片，厚度10um。一抗HCN4多克隆抗體（1： 50），二抗TR標(biāo)記山羊抗兔IgG，熒光顯微鏡下觀察熒光的分布。

1.2.4 免疫印跡反應(yīng)（Western Blot）

取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組房室結(jié)組織提取蛋白質(zhì)，進(jìn)行Western Blot分析。兔抗大鼠HCN4（1：400）、兔抗大鼠β-Actin抗體（1：500）作為一抗，辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記的二抗，ECL顯色。用凝膠成像分析儀采集圖像并用Image J圖像處理軟件進(jìn)行吸光度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS14軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光染色

房室結(jié)縱切面上HCN4分布于細(xì)胞膜上，呈相對(duì)聚集的點(diǎn)狀、條索狀表達(dá)。1型糖尿病大鼠房室結(jié)HCN4在細(xì)胞膜上表達(dá)減少，呈點(diǎn)狀表達(dá)（圖1、2）。

2.2 免疫印跡反應(yīng)（Western Blot）

12w時(shí)，對(duì)照組HCN4蛋白質(zhì)有表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組HCN4表達(dá)明顯降低，與對(duì)照組相比有顯著性差異（P=0.01，P<0.05） （表1、圖3）。

3 討論

持久的高血糖對(duì)心肌細(xì)胞的損害是糖尿病患者心肌病變產(chǎn)生的根本原因，其病理特征是心肌細(xì)胞肥大、心肌間質(zhì)纖維化[6]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠從糖尿病病程4w開始出現(xiàn)心肌的病理改變，心肌細(xì)胞凋亡顯著增加且以心肌纖維的變性壞死為主。HCN4是正常起搏電流（If）產(chǎn)生的重要因素，對(duì)基礎(chǔ)心率的維持起重要作用，并能隨著機(jī)體的不同生理狀態(tài)對(duì)頻率進(jìn)行調(diào)整。在各種病理因素的刺激下，心肌中HCN 通道表達(dá)異常或結(jié)構(gòu)功能異常，導(dǎo)致 If增大或減小，最終導(dǎo)致各種心律失常。Zicha[7]等發(fā)現(xiàn)犬慢性心衰時(shí)竇房結(jié)的主要亞型HCN4表達(dá)下調(diào)而右心房HCN4的表達(dá)明顯上調(diào)，并認(rèn)為這可能是引起房性異位心律的主要原因。Yeh等[8]證實(shí)，在房性心動(dòng)過速犬模型中，竇房結(jié)組織和心房組織中HCN表達(dá)也呈現(xiàn)了反向分化，這可能是快速房性心律失常伴有竇房結(jié)功能減退的發(fā)生機(jī)制。以上研究均提示心力衰竭患者病竇綜合征和房顫發(fā)生率增多的機(jī)制可能與HCN4在傳到系統(tǒng)即竇房結(jié)表達(dá)下調(diào)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在病理情況下HCN4通道在房室結(jié)中表達(dá)降低，這與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致，表明HCN4通道的下降會(huì)引起心臟電生理活動(dòng)的變化而產(chǎn)生心率失常，提示HCN4通道表達(dá)的變化可能在房室傳導(dǎo)阻滯、室性心律失常的發(fā)展中有一定的作用。

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