馮東凡+范東旭+金松+韓梅++楊婷+劉彥東++王凱峰++孫瑤

[摘要] 目的 探討γ-分泌酶抑制劑（DAPT）對體外培養(yǎng)糖尿病（DM）大鼠血管平滑肌細胞（VSMCs）Notch信號通路相關(guān)蛋白表達的影響。 方法 體外培養(yǎng)DM大鼠VSMCs，隨機分為兩組：正常培養(yǎng)基組（con組）、加入不同濃度（0.15、2.50、7.50 μmol/L）DAPT的培養(yǎng)基組（實驗組），72 h后收集細胞，分別用雙向電泳方法和Western blot法檢測Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4蛋白的表達。 結(jié)果 ①雙向電泳圖譜證實提取的蛋白中含有目的蛋白。②Western blot檢測結(jié)果顯示：隨DAPT濃度的增加，Nocth1、Nocth3、Nocth4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4各蛋白的表達均遞減；7.50 μmol/L組與對con組比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；0.15、1.25 μmol/L組與con組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；0.15、1.25 μmol/L組與7.50 μmol/L組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；0.15 μmol/L組與1.25 μmol/L組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 DAPT作用于體外培養(yǎng)的DM大鼠VSMCs后，使其Notch信號通路相關(guān)蛋白表達減少，在一定濃度范圍內(nèi)（1.25～7.50 μmol/L）呈濃度依賴性。

[關(guān)鍵詞] Notch信號通路；γ-分泌酶抑制劑；血管平滑肌細胞；雙向電泳

[中圖分類號] R587.1 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）02（c）-0024-04

糖尿病足（DF）是糖尿?。―M）的慢性并發(fā)癥之一，是高血糖、周圍血管病變、周圍神經(jīng)病變等多種因素共同所致，病因復(fù)雜，致殘、致死率高，治療費用高。目前針對DF及微血管病變的治療效果難以令人滿意。Notch信號通路具有促進非DM動物缺血區(qū)血管新生、動靜脈分化等作用。本課題通過γ-分泌酶抑制劑（DAPT）干預(yù)體外培養(yǎng)的DM大鼠血管平滑肌細胞（VSMCs），研究對Notch信號通路中Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

凍存的DM大鼠VSMCs（SPF級SD大鼠購自大連醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，質(zhì)量合格證號：0003546，經(jīng)DM大鼠模型建立、取材后凍存）[1]。

1.2 主要試劑和儀器

DAPT（美國Sellect公司）；全自動凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)（日本Olympus公司）；Mini-Protean 3電泳系統(tǒng)、Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（北航圖像中心）；蛋白濃度測定試劑、β-actin（美國Sigma公司）；兔抗Notch1單克隆抗體、兔抗Notch3單克隆抗體、兔抗Notch4單克隆抗體、倉鼠抗大鼠Jagged-1蛋白（JAG1）單克隆抗體、倉鼠抗大鼠Jagged-2蛋白（JAG2）單克隆抗體、倉鼠抗大鼠DLL4蛋白單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；Bio-Lyte載體兩性電解質(zhì)、IEF電泳槽、IPG預(yù)制膠條（美國BioRad公司）。

1.3 細胞培養(yǎng)

取凍存的DM大鼠VSMCs進行細胞復(fù)蘇，將其接種于96孔板，D-Hank′s液沖洗2遍，加入0.25%TRYPSIN+0.02% EDTA·4Na約3 mL進行消化，制成單細胞懸液。按1∶2傳代培養(yǎng)，傳至3代后，隨機分為兩組：正常培養(yǎng)基（con）組和加入DAPT的培養(yǎng)基（實驗）組（濃度梯度分別為0.15、1.25、7.50 μmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)傳至6代。

1.4 方法

1.4.1 蛋白提取 取配置好的單細胞懸液，加入預(yù)冷的細胞裂解液400 mL，冰浴靜置40 min，提取蛋白。

1.4.2 雙向電泳檢測目標(biāo)蛋白 在198 mm×256 mm×1 mm SDS凝膠上，標(biāo)記縱橫坐標(biāo)，將目的蛋白加入坐標(biāo)原點，進行第一向等電聚焦電泳，聚焦結(jié)束后的膠條經(jīng)平衡處理后立即進行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后，取出凝膠，拍照，應(yīng)用計算機軟件分析處理。取提取的蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，計算上樣量。煮沸，變性，標(biāo)記，上樣檢測或于-80℃保存。

1.4.3 Western blot 檢測蛋白表達情況 取30 μg蛋白，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入抗Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4單克隆抗體（1∶200），4℃孵育過夜，加入二抗IgG（1∶5000稀釋），室溫孵育1 h，ECL試劑盒顯影，以β-actin為內(nèi)參進行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，以對照組為參照樣本，計算Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4蛋白的相對表達水平。實驗重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雙向電泳檢測結(jié)果

DM大鼠VSMCs蛋白雙向電泳檢測結(jié)果顯示，在凝膠上可以看到800多個蛋白點，其中大多數(shù)蛋白位于pH 5.0～8.5，分子量為134～300 kD。應(yīng)用計算機軟件Image-Master 2D Platinum software分析，其中“十字”表示計算機探測到的凝膠分離出的蛋白質(zhì)點，“標(biāo)簽”表示經(jīng)過計算機軟件自動編號后的目標(biāo)蛋白點，說明提取的蛋白質(zhì)中含有實驗所需目的蛋白。見圖1。

2.2 Western blot檢測結(jié)果

Western blot檢測結(jié)果顯示：隨DAPT濃度的增加，Nocth1、Nocth3、Nocth4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4各蛋白表達水平遞減；7.50 μmol/L組與con組相比，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），0.15、1.25 μmol/L組與con組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；0.15、1.25 μmol/L組與7.50 μmol/L組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；0.15 μmol/L組和1.25 μmol/L組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖2～3。

3 討論

DM已成為世界性疾病[2]，根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）發(fā)布的2015全球DM版圖[3]，目前世界成年DM患者約4.15億人，中國目前為1.096億人，且處于不斷增加中。據(jù)統(tǒng)計，15%～25%的DM患者一生中會發(fā)生DF[4]，而DM患者的截肢率與非DM患者相比要高40倍[5]，且截肢預(yù)后較差。據(jù)統(tǒng)計[6]截肢后5年死亡率達40%。

在DM血管病變過程中，VSMCs從中膜移行到內(nèi)膜，增殖、分泌生長因子，參與纖維膜的形成，VSMCs還分泌合成許多基質(zhì)分子參與血管病變的發(fā)生[7-8]。因此可見，VSMCs在DM血管病變的進展過程中發(fā)揮著重要作用。

目前針對DM血管病變的治療主要以內(nèi)科藥物保守治療、腔內(nèi)介入手術(shù)[9]、旁路移植手術(shù)[10]為主，但效果均欠佳，近年來開展的細胞因子治療[11]用于誘導(dǎo)和促進DM血管缺血區(qū)血管再生的探索取得一定效果，但也存在一定不足。因此，尋求新的方式以促進更多血管生成是非常有必要的。

有研究證實，Notch信號通路能促進非DM動脈缺血區(qū)的血管新生[12-14]，在血管發(fā)育的過程中發(fā)揮重要的作用。在Notch信號通路的受體和配體中，Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4在血管平滑肌細胞表達[15]。Notch1、Notch3、Notch4受體分別主要由Jagged-1、Jagged-2、DLL4配體啟動[16-17]。Qiao等[18]、Zela等[19]證實Notch信號通路對體外培養(yǎng)正常大鼠血管VSMCs的增殖、分化、凋亡等具有重要的調(diào)控作用，進而促進血管新生。但是Notch信號通路是否對DM動脈缺血區(qū)具有相同的作用尚未清楚。DAPT是Notch信號通路的抑制劑，可特異性抑制γ-分泌酶活性，進而抑制Notch受體在S3位點的酶切，有效抑制Notch信號通路的激活[20]。

本課題組既往實驗經(jīng)流式細胞學(xué)檢測證實，體外培養(yǎng)的DM大鼠VSMCs經(jīng)DAPT作用72 h，對其細胞的抑制率較其余各時間段明顯，且當(dāng)DAPT濃度在0.25、1.25、7.50 μmol/L時，其半抑制率最為明顯[1]，所以本實驗選用以上3個濃度的DAPT作用72 h后行相關(guān)檢查。實驗結(jié)果顯示：各實驗組與con組提取Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4蛋白后行雙向電泳及Western blot檢測證實DAPT可以抑制Notch信號通路的活動，抑制Notch相關(guān)蛋白的表達。雙向電泳圖譜經(jīng)計算機軟件分析表明提取蛋白中含有目的蛋白。Western blot檢查結(jié)果顯示：隨DAPT濃度的增加，各蛋白的表達均遞減，說明DAPT干預(yù)Notch信號通路能抑制DM大鼠Notch信號通路相關(guān)蛋白的表達；其中，當(dāng)DAPT濃度在7.50 μmol/L時，對Notch信號通路各蛋白表達的抑制作用最明顯；當(dāng)DAPT濃度在0.15～1.25 μmol/L之間時，干預(yù)Notch信號通路后對相關(guān)蛋白的抑制作用無明顯差異；當(dāng)DAPT濃度在1.25～7.50 μmol/L之間時，隨著濃度的升高，DAPT對Notch信號通路的抑制作用逐漸增強，呈劑量依賴型。從結(jié)果中可看出，Nocth1、Nocth3、Nocth4蛋白分別與Jagged-1、Jagged-2、DLL4蛋白降低的幅度相似，證實了Notch1、Notch3、Notch4受體分別主要由Jagged-1、 Jagged-2、DLL4配體啟動這一理論。本實驗結(jié)果提示：Nocth1、Nocth3、Nocth4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4各蛋白在體外正常條件下培養(yǎng)的DM大鼠VSMCs中均有所表達；且DAPT能不同程度阻斷DM大鼠VSMCs Notch信號通路的活性，抑制Notch信號通路相關(guān)蛋白的表達，且該抑制作用在一定濃度范圍內(nèi)（1.25～7.50 μmol/L）呈正相關(guān)。結(jié)合本課題前期實驗證實DAPT干預(yù)Notch信號通路后可抑制DM大鼠VSMCs的增殖、促進凋亡等，提示Notch信號通路與DM大鼠VSMCs的增殖、凋亡等有關(guān)。此項研究提示，促進Notch信號通路的表達或許可以促進DM患者缺血區(qū)VSMCs的增殖，促進更多新生血管的再生，但目前對Notch信號通路在DM患者中的具體機制還存在許多亟需解決的問題。

總之，DAPT干預(yù)DM大鼠VSMCs后能抑制Notch信號通路相關(guān)蛋白的表達，抑制Notch信號通路的活性，證明Notch信號通路在DM大鼠血管再生中起著重要作用，而進一步研究Notch信號通路在DM大鼠中的作用機制或許為治療DM患者缺血區(qū)血管新生提供一種新的可能。

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（收稿日期：2016-11-15 本文編輯：程 銘）