劉新利++++張鴻飛+++張旭濤+++孟瑾+++張峰

[摘要] 目的 研究生長抑制因子5（ING5）對(duì)肺癌A549 細(xì)胞Warburg效應(yīng)的影響。 方法 肺癌A549 ING5過表達(dá)細(xì)胞系通過慢病毒轉(zhuǎn)染GV218-EGFP-ING5（吉?jiǎng)P基因）構(gòu)建，空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染為對(duì)照細(xì)胞系A(chǔ)549-control。Western blot驗(yàn)證ING5的表達(dá)；增殖和克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察ING5對(duì)A549細(xì)胞增殖和克隆形成的影響；乳酸脫氫酶（LDH）活性和乳酸（LD）分泌檢測(cè)實(shí)驗(yàn)觀察ING5對(duì)A549細(xì)胞Warburg效應(yīng)的影響。 結(jié)果 Western blot結(jié)果表明，A549-ING5-OE的ING5表達(dá)顯著高于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。增殖和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，A549-ING5-OE的增殖和克隆形成能力較對(duì)照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。LDH活性和LD分泌檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，A549-ING5-OE的LDH活性和LD分泌較對(duì)照組明顯降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 ING5通過逆轉(zhuǎn)肺癌A549細(xì)胞的Warburg效應(yīng)抑制其增殖。

[關(guān)鍵詞] 肺癌細(xì)胞；生長抑制因子5；Warburg效應(yīng)；增殖；克隆形成

[中圖分類號(hào)] R730.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）02（c）-0004-04

代謝重組是誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一[1-2]。腫瘤組織在有氧條件下主要依賴糖酵解獲能的代謝方式稱為“Warburg效應(yīng)”[3]。Otto Warburg首次發(fā)現(xiàn)并認(rèn)為這種代謝方式的轉(zhuǎn)變是促進(jìn)癌變的主要誘因[4]。生長抑制因子（inhibitor of growth，INGs）是近年來發(fā)現(xiàn)的重要抑癌基因家族[5-7]，該家族包含ING1～5五個(gè)成員。INGs家族蛋白高度保守，由C端結(jié)構(gòu)域、中央?yún)^(qū)和N端結(jié)構(gòu)域三部分組成[8-9]。ING5是該家族新成員，研究發(fā)現(xiàn)ING5與P53相互作用能夠抑制細(xì)胞生長和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。此外，有研究報(bào)道ING5能夠抑制腫瘤增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）[11]，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞分化、自噬和凋亡[12]。

目前關(guān)于ING5的研究報(bào)道較少，其抑癌作用及機(jī)制尚無突破性進(jìn)展。本文擬研究肺癌A549細(xì)胞ING5過表達(dá)對(duì)Warburg效應(yīng)及增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

A549細(xì)胞（上海中科院細(xì)胞庫），GV218載體（上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司），G418（美國Gibco公司），高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶消化液（美國HyClone公司），青鏈霉素混合液（北京Solarbio公司），BCA試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒、裂解液（西安碧云天科技生物有限公司），蛋白酶抑制劑（瑞士Roche公司），ING5抗體（美國Proteintech），ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國Advansta公司），兔二抗（英國Abcam公司），4%多聚甲醛溶液（西安科昊生物技術(shù)有限公司）。

1.2 肺癌A549-ING5-OE細(xì)胞株的構(gòu)建

含ING5 cDNA的慢病毒載體和對(duì)照載體為吉?jiǎng)P公司構(gòu)建。0.25%的胰酶消化293T細(xì)胞后計(jì)數(shù)并調(diào)整密度為6×105個(gè)/mL接種于培養(yǎng)皿，37℃，5% CO2孵箱培養(yǎng)至密度約80%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2 h換無血清DMEM，加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物繼續(xù)培養(yǎng)8 h后棄掉上清液，PBS清洗后加入10% FBS的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集上清液1000 r/min離心3 min，所得上清液為病毒顆粒濃縮液。取對(duì)數(shù)生長期肺癌A549細(xì)胞，用上述病毒顆粒濃縮液進(jìn)行感染12 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，無明顯細(xì)胞毒副作用則繼續(xù)培養(yǎng)24 h后換新培養(yǎng)液，感染3 d后觀察EGFP基因的表達(dá)。感染后的A549細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整密度為300個(gè)/孔接種于6孔板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。用5 μg/mL的G418篩選，每隔24 h更換新培養(yǎng)液，篩選3 d后用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞克隆，挑取陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)至所需細(xì)胞量。

1.3 Western blot檢測(cè)ING5的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長期A549-control和A549-ING5-OE細(xì)胞，0.25%的胰酶消化，4℃預(yù)冷的PBS洗滌、離心后加入適量裂解液混勻冰上裂解30 min。細(xì)胞裂解液組成：0.1%SDS、150 mmol/L NaCl、0.5%脫氧膽酸、1%NP-40和50 mmol/L Tris（pH 8.0），裂解前加入蛋白酶抑制劑（1∶25），低溫離心機(jī)離心30 min后所得上清為細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒定量。采用SDS-PAGE凝膠試劑盒配制10%分離膠和6%濃縮膠，上樣后開始電泳（濃縮膠100 V，30 min，分離膠130 V，1 h），轉(zhuǎn)膜（100 V，1.5 h），后取出NC膜，10%麗春紅染液染色30 s可見清晰的紅色條帶，裁剪目的條帶用PBST洗脫殘余染液，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后孵育一抗ING5（1∶1000）、Actin（1∶1000），4℃過夜。次日，回收一抗，PBST清洗目的條帶3次，7 min/次。山羊抗兔或鼠二抗（1∶5000）室溫孵育1 h，PBST清洗目的條帶3次，7 min/次?；瘜W(xué)發(fā)光儀檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。

1.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長期A549-control和A549-ING5-OE細(xì)胞，0.25%胰酶消化計(jì)數(shù)后，10% FBS的DMEM配成單細(xì)胞懸液，以每孔2×103個(gè)/200 μL接種于96孔板中培養(yǎng)，6個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞貼壁開始計(jì)時(shí)24、48、72、96、120 h每孔加MTT溶液（5 mg/mL，PBS配制）20 μL繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)，棄上清，每孔加150 μL DMSO，震蕩儀振蕩10 min使結(jié)晶物充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm測(cè)定OD值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長期A549-control和A549-ING5-OE細(xì)胞，0.25%的胰酶消化計(jì)數(shù)后，10% FBS的DMEM配成單細(xì)胞懸液，以每孔300個(gè)/2 mL接種于6孔板中培養(yǎng)，3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞貼壁生長5 d后每孔加500 μL FBS繼續(xù)培養(yǎng)并觀察克隆形成情況，待肉眼觀察菌落形成后（14 d左右），棄上清，PBS清洗3次，加1 mL 4%多聚甲醛溶液室溫固定15 min。棄固定液，PBS清洗3次，加0.1%結(jié)晶紫染液室溫染色15 min。棄染液，PBS清洗3次，室溫風(fēng)干后計(jì)數(shù)超過50個(gè)細(xì)胞的克隆。

1.6 乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長期A549-control和A549-ING5-OE細(xì)胞，0.25%的胰酶消化、4℃預(yù)冷的PBS洗滌、離心后加適量裂解液混勻冰上裂解30 min，低溫離心機(jī)離心30 min，所得上清液為細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒定量。根據(jù)OD值及線性回歸方程計(jì)算初始蛋白初濃度，裂解液調(diào)整蛋白終濃度為3 μg/μL。按照說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀450 nm讀取OD值，每組3復(fù)孔，重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.7 乳酸（LC）分泌檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長期A549-control和A549-ING5-OE細(xì)胞，0.25%的胰酶消化計(jì)數(shù)后，10% FBS的DMEM配成單細(xì)胞懸液，以每孔4×105個(gè)/mL接種于6孔板中培養(yǎng)，24 h后收集上清液。按照說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀530 nm讀取OD值，每組3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測(cè)ING5的表達(dá)

Western blot結(jié)果表明：與A549-control相比，A549-ING5-OE的ING5表達(dá)明顯升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。

2.2 ING5抑制A549細(xì)胞的增殖

增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與A549-control相比，A549-ING5-OE的增殖能力顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。

2.3 ING5抑制A549細(xì)胞的克隆形成

克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與A549-control相比，A549-ING5-OE的克隆形成能力顯著降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。

2.4 ING5抑制A549細(xì)胞的LDH活性

LDH活性檢測(cè)結(jié)果表明：A549-ING5-OE的LDH OD450值為（0.268±0.013），較A549-control的OD450值（0.333±0.015）明顯降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。

2.5 ING5抑制A549細(xì)胞的LD分泌

LD分泌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：A549-ING5-OE的LD分泌OD530值為（0.257±0.016），較A549-control的OD530值（0.302±0.012）明顯降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。

3 討論

腫瘤在有氧條件下以糖酵解獲能的代謝特征稱為Warburg效應(yīng)[13]。Warburg認(rèn)為代謝的異常導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14]。此外，Warburg效應(yīng)導(dǎo)致的局部酸性微環(huán)境與腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移有明顯的相關(guān)性[15-16]。Flaveny等[17]研究發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)Warburg效應(yīng)可阻斷癌癥發(fā)展。

近年來INGs蛋白家族在腫瘤中的作用及機(jī)制受到高度重視。Liu等[18]發(fā)現(xiàn)，ING5與HAT酶Tip60相互作用后誘導(dǎo)凋亡基因Bax和GADD45轉(zhuǎn)錄激活促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，研究發(fā)現(xiàn)在口腔鱗狀細(xì)胞癌[19]、胃癌[20]、乳腺癌[21]和結(jié)直腸癌[22]等多種腫瘤中，ING5 mRNA和蛋白水平均顯著降低。

本文擬研究ING5過表達(dá)對(duì)肺癌A549細(xì)胞Warburg效應(yīng)及增殖能力的影響。結(jié)果表明，ING5過表達(dá)能夠顯著抑制細(xì)胞增殖和克隆形成，同時(shí)，首次發(fā)現(xiàn)其能夠抑制細(xì)胞LDH活性和LD分泌抑制糖酵解。提示ING5能夠逆轉(zhuǎn)Warburg效應(yīng)并為肺癌代謝治療提供新的依據(jù)。

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（收稿日期：2016-11-10 本文編輯：程 銘）