王艷華 徐國華 李劍梅 韓 冰 楊澤濤 修翠娟

（1 遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧朝陽122000）

蛹蟲草（Cordyceps militaris），又名北冬蟲夏草，蛹草，北蟲草，蛹草菌。隸屬子囊菌門、核菌綱、肉座菌目、麥角菌科、蟲草屬，是蟲草屬的模式種[1]。蛹蟲草含有豐富的蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖，微量元素硒等，具有增強(qiáng)動物機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗輻射、抗菌、抗氧化等多種生理功效，是一種能同時平衡和調(diào)節(jié)陰陽的食藥用真菌[2～4]。

蛹蟲草菌株非常容易變異和退化，保存期短，生產(chǎn)菌種需要不斷的進(jìn)行重新篩選，菌種篩選工作繁重艱巨，所以有效科學(xué)的蛹蟲草優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)栽培菌株的篩選方法的建立顯得非常重要。筆者進(jìn)行了圓頭及尖頭蛹蟲草菌株分離選育鑒定方法探索，現(xiàn)將試驗結(jié)果總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料新鮮蛹蟲草子實體（圖1、圖2），來自內(nèi)蒙古敖漢北蟲草農(nóng)民專業(yè)社。

圖1 圓頭蛹蟲草子實體

圖2 尖頭蛹蟲草子實體

1.2 培養(yǎng)基①斜面培養(yǎng)基配方:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀0.1 g，硫酸鎂0.1 g，瓊脂20 g，加水1000 mL。②栽培培養(yǎng)基配方:麥粒35 g，營養(yǎng)液60 mL。

1.3 試驗方法蛹蟲草菌株分離包括組織分離和孢子分離兩種。兩種方法可結(jié)合使用，最后對篩選出的菌株進(jìn)行鑒定比較，篩選出優(yōu)良菌株進(jìn)行下一步栽培生產(chǎn)。

1.3.1 組織分離 用無菌刀將蟲草子實體切成長度1～2 mm 的小段，接種于PDA 試管或平板固體培養(yǎng)基上，放置在18～20℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

培養(yǎng)48～72 h，菌絲開始萌發(fā)，在組織塊周圍長出白色放射狀的菌絲，及時選擇無污染的菌絲體，接種于新的培養(yǎng)基上進(jìn)一步培養(yǎng)，最終得到純化的蛹蟲草菌株。

組織分離消毒與否對比試驗:取新鮮、生長正常的蛹蟲草子實體，先用清水沖洗，再置于75% 酒精浸泡消毒2～3 min，取出以無菌水反復(fù)沖洗2～3次，放在無菌器皿內(nèi)備用。

按照組織分離方法進(jìn)行分離培養(yǎng)，最終得到純化的蛹蟲草菌株。

不消毒:采用無菌操作直接用鮮蛹蟲草子實體培養(yǎng)菌絲體。

1.3.2 孢子分離 孢子分離方法更多地適合圓頭蛹蟲草菌株的篩選，尖頭蛹蟲草依品種的不同而有所差異，有的尖頭蛹蟲草品種可以采集到孢子，有的子實體很難產(chǎn)生大量孢子。

孢子分離篩選優(yōu)良菌株比組織分離得到的優(yōu)良菌株的比例小，工作量較大。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同部位組織分離效果試驗結(jié)果，組織塊截取部位越靠下，菌絲體（尖頭蛹蟲草）生長越差，轉(zhuǎn)色變差，生物學(xué)轉(zhuǎn)化率降低或不出草。試驗結(jié)果表明上部1.5 cm以內(nèi)組織塊分離出的菌種相對能保證轉(zhuǎn)色出草。但在試驗中也發(fā)現(xiàn)不同批次的子實體即使生長周期相同，有的上部1.5 cm 以內(nèi)的組織分離出的菌種可轉(zhuǎn)色出草，有的3～4 cm 的組織部位分離出的菌種仍可較好地轉(zhuǎn)色出草，說明不同批次不同株型的子實體具有不同的生長遺傳特性。

圓頭草的組織分離要選取孢子頭膨大部位組織體，頭柄相接處及柄部的組織體處分離出的菌株出草性狀不好，不宜采用。試驗結(jié)果表明，圓頭蛹草子實體組織用酒精消毒后，培養(yǎng)生長出的菌絲體相比未經(jīng)酒精消毒的菌絲體轉(zhuǎn)色差（圖3），出草也差。而尖頭蛹蟲草未出現(xiàn)上述情況。

2.2 組織是否消毒對分離效果的影響結(jié)果表明不管是尖頭蛹蟲草還是圓頭草蛹蟲草，只要子實體新鮮無感染，草齡適宜，組織不消毒分離培養(yǎng)出的菌絲體生長旺盛，轉(zhuǎn)色及出草均正常。但由于蛹蟲草子實體組織體小，在分離過程中要嚴(yán)格無菌操作，避免二次人為污染。

2.3 分離蛹蟲草菌株鑒定分離得到的蛹蟲草菌株必須要進(jìn)行菌株鑒定，以確定得到的菌株是否是優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)北蟲草菌株，只有經(jīng)過鑒定的優(yōu)良菌株才可以應(yīng)用到生產(chǎn)中。菌株鑒定包括直接觀察法、鏡檢法、出草試驗等（分子DNA鑒定省略）。

2.3.1 直觀法 直觀法就是靠人的肉眼進(jìn)行直接觀察，對蛹蟲草菌絲生長情況、見光轉(zhuǎn)色情況、出草情況等進(jìn)行觀察比較，并定期記錄。

蛹蟲草菌絲體在PDA 固體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)觀察。一般來說，蛹蟲草菌絲體在第2、3 天可觀察到，第4、5天生長較好，優(yōu)良的蛹蟲草菌株在培養(yǎng)初期菌絲為白色，粗壯濃密，呈絨毛狀，邊緣整齊，匍匐狀緊貼培養(yǎng)基生長，菌落生長旺盛。受光線刺激的管壁與基質(zhì)結(jié)合處呈現(xiàn)黃色（圖4）。

圖3 消毒與否圓頭蛹蟲草組織分離菌絲體轉(zhuǎn)色情況

圖4 蛹蟲草菌體在PDA固體培養(yǎng)基上的生長情況

2.3.2 斜面菌株見光轉(zhuǎn)色及出草試驗 見光轉(zhuǎn)色試驗是非常重要且簡單的一步。優(yōu)良的蛹蟲草菌株菌絲體培養(yǎng)后期見光后，受光線刺激與基質(zhì)結(jié)合處呈現(xiàn)黃色。隨著時間的延長，由黃色逐漸變成橘黃色（圖5）。見光后轉(zhuǎn)色不好或完全不轉(zhuǎn)色，這樣的菌株完全不能用于生產(chǎn)，生物學(xué)轉(zhuǎn)化率非常低或完全不出草，通過這一步可直接淘汰掉性狀差的菌株。優(yōu)良的菌株可在斜面觀察到出草現(xiàn)象，轉(zhuǎn)色越快，顏色越深的菌株，出草越早，生物學(xué)轉(zhuǎn)化率也越高。

優(yōu)良的尖頭蛹蟲草菌株轉(zhuǎn)色很快，2 d以后就可以變?yōu)樯铋冱S色，5～7 d在斜面上可觀察到有針刺狀的高0.5～1 cm的子實體冒出（圖6）。

優(yōu)良的圓頭蛹蟲草菌株則轉(zhuǎn)色后為淺橘黃色，約10 d后培養(yǎng)基表面可見有針刺狀子實體冒出（圖7）。

2.3.3 鏡檢結(jié)果 用顯微鏡檢查菌絲生長情況及菌種純度，有無雜菌。通過鏡檢法還可以進(jìn)行分生孢子產(chǎn)孢特性與其可育性關(guān)系觀察。

蛹蟲草菌絲光滑，有隔及分枝，后期形成分生孢子。在人工培養(yǎng)基上產(chǎn)生擬青霉型（Paecilomycestype）和輪枝孢型（Vertillium-type）2種產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)（圖8、圖9）。一些實驗證實同時具有這2種產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的菌株，其子實體形成能力可以保持許多代，性狀不再變異，遺傳性狀相對穩(wěn)定，可結(jié)合觀察分生孢子產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)進(jìn)行菌株復(fù)篩[5]。

圖5 分離的不同菌株見光轉(zhuǎn)色情況

圖7 優(yōu)良圓頭蛹蟲草菌株斜面轉(zhuǎn)色

圖8 蛹蟲草菌絲體細(xì)胞

圖9 輪枝孢和擬青霉混合型

2.4 選擇性培養(yǎng)馴化對菌株進(jìn)行選擇性馴化培養(yǎng)，如選擇不同的培養(yǎng)基，高、低溫刺激等。觀察菌株的生長性狀及其抗逆能力，選擇保留抗逆性強(qiáng)的菌株，這樣的菌株生產(chǎn)性能更加優(yōu)良。

2.5 栽培出草試驗在進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)前，對初篩的性狀優(yōu)良的菌株必須要進(jìn)行小規(guī)模栽培出草試驗，在玻璃瓶中進(jìn)行即可，小規(guī)模出草試驗成功后才可進(jìn)行真正的規(guī)模生產(chǎn)。

接種后生長速度快，出草整齊，草形好，生物學(xué)轉(zhuǎn)化率高的菌株可作為優(yōu)良的生產(chǎn)用菌株。

3 小結(jié)與討論

蛹蟲草菌株非常容易退化，保藏期很短，菌種篩選工作非常繁重。試驗對尖頭及圓頭蛹蟲草優(yōu)良菌株分離選育，通過直接觀察法簡單且直觀初步去掉劣勢菌株，篩選出初級優(yōu)良菌株，減少了后續(xù)試驗時間及工作量；鏡檢法、出草試驗結(jié)合進(jìn)一步確認(rèn)篩選出菌株優(yōu)良性。試驗建立了一套蛹蟲草優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)栽培菌株的篩選方法，對蛹蟲草菌株的選育工作具有一定的指導(dǎo)作用。

蛹蟲草高產(chǎn)菌株的篩選有許多關(guān)鍵因素，篩選出優(yōu)良菌株后，菌株的保藏條件、保藏時間，傳代復(fù)壯次數(shù)等都對蛹蟲草的生長有至關(guān)重要的影響[5，6]。

由于蛹蟲草的種類多、分布廣，其生長條件存在著一定的差異，菌絲體的分化也有一定的差異，菌株篩選方法也會有所不同。