楊文聰, 莫婷婷, 林澤檀, 曾淑瑩,方玉琦, 江 濤, 史 蕾

(廣東第二師范學(xué)院 化學(xué)系，廣東 廣州 510303)

·快遞論文·

單羥基咔咯錳(III)配合物的合成及其與DNA的相互作用

楊文聰, 莫婷婷, 林澤檀, 曾淑瑩,方玉琦, 江 濤, 史 蕾*

(廣東第二師范學(xué)院 化學(xué)系，廣東 廣州 510303)

以五氟苯基二吡咯烷烴為原料，與對(duì)羥基苯甲醛經(jīng)縮合反應(yīng)合成了單羥基自由咔咯(1)； 1與醋酸錳反應(yīng)合成了一種單羥基咔咯錳配合物——10-(4-羥基苯基)-5,15-二(2,3,4,5,6-五氟苯基)咔咯錳(III)配合物，其結(jié)構(gòu)經(jīng)UV-Vis和HR-MS(ESI)表征。通過(guò)紫外滴定、熒光滴定、圓二色譜和瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)探討了其催化氧化DNA的活性。

五氟苯基二吡咯烷烴； 咔咯; 錳; DNA; 氧化斷裂; 合成

咔咯是具有18-π電子結(jié)構(gòu)的卟啉類大環(huán)化合物，咔咯典型的配位化學(xué)特征使其可與多種金屬結(jié)合形成高價(jià)態(tài)金屬配合物[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，咔咯及其金屬配合物在人工核酸酶及抗腫瘤方面有巨大的應(yīng)用前景[3-5]。咔咯錳配合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、中心金屬錳具有良好的氧化還原特性，預(yù)示著其在催化氧化DNA方面可能具有優(yōu)良的活性[1]。

2007年，Gross課題組[6]合成了水溶性陽(yáng)離子型金屬咔咯錳配合物，利用圓二色光譜研究了其與DNA的相互作用模式。隨后，一系列陰離子型磺化、羧基型咔咯及陽(yáng)離子吡啶基咔咯錳配合物被合成，其催化氧化DNA活性及與DNA的結(jié)合模式被系統(tǒng)研究[7-10]。單羥基咔咯在抗腫瘤方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[11-12]，劉海洋等[13]發(fā)現(xiàn)，單

Scheme 1

羥基錳配合物和高濃度過(guò)氧化氫反應(yīng)8 h，可以引起DNA發(fā)生有效斷裂，但未對(duì)配合物和DNA的結(jié)合模式進(jìn)行深入研究。

本文以五氟苯基二吡咯烷烴為原料，與對(duì)羥基苯甲醛經(jīng)縮合反應(yīng)合成了單羥基自由咔咯(1)； 1與醋酸錳反應(yīng)合成了一種單羥基咔咯錳配合物——10-(4-羥基苯基)-5,15-二(2,3,4,5,6-五氟苯基)咔咯錳(III)配合物(2， Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)UV-Vis和HR-MS(ESI)表征。由于2顯順磁性，因此無(wú)法獲得核磁信號(hào)，通過(guò)紫外滴定、熒光滴定、圓二色譜推測(cè)2與ct-DNA的結(jié)合模式為外部結(jié)合，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)探討了其催化氧化DNA活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UV-Vis 2450型紫外-可見分光光度計(jì)；RF-5301PC型熒光分光光度計(jì)；Agilent1290/maXis impact型超高壓液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀；J-810型圓二色光譜儀；31-CN型凝膠電泳儀；BIO-RAD Gel Dox XR+凝膠自動(dòng)成像分析系統(tǒng)。

小牛胸腺DNA(ct-DNA)，Sigma公司；pBR322 DNA，大連寶生物工程有限公司；三羥甲基甲胺(Tris)、氯化鈉(NaCl)、硼酸(H3BO3)、瓊脂糖、溴酚藍(lán)、溴化乙錠(EB)，生物純，上海生工生物工程公司；其余所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 合成

(1) 1的合成[13]

在100 mL圓底燒瓶中加入五氟苯基二吡咯烷烴499.2 mg(0.80 mmol)和二氯甲烷 50 mL，攪拌均勻；加入4-羥基苯甲醛48.8 mg(0.40 mmol)和三氟乙酸 20 μL(0.26 mmol)，于室溫反應(yīng)7 h。注入三乙胺40 μL(0.30 mmol)中和三氟乙酸，加入二氯二氰基苯醌(DDQ) 182.0 mg(0.80 mmol)，于室溫反應(yīng)2 h。用二氯甲烷淋洗，經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：二氯甲烷)純化得粗產(chǎn)品。粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠柱層析[梯度洗脫劑：A=V(正己烷)∶V(二氯甲烷)=3 ∶1～2 ∶1]純化，收集紫色條帶蒸干得紫色粉末1，產(chǎn)率20.0%。

(2) 2的合成[13]

在50 mL圓底燒瓶中加入1 28.8 mg(0.04 mmol)，甲醇20 mL和醋酸錳120.0 mg，于60 ℃反應(yīng)2 h。旋干溶劑，殘余物用混合溶劑[V(二氯甲烷)/V(水)=1/1]萃取，有機(jī)相經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑A=1 ∶2)純化，收集綠色條帶，蒸干得綠色粉末2，產(chǎn)率90%； UV-Visλmax(relative intensity): 403(1.63), 416(1.71), 488(0.78) nm; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C37H13N4OF10Mn[M+]774.680 5, found 774.037 1。

1.3 2與ct-DNA的相互作用測(cè)試

在Tris-HCl緩沖溶液I(5 mmol·L-1Tris-HCl, 50 mmol·L-1NaCl, 2%DMF, pH 7.2)中測(cè)試2與ct-DNA的相互作用。其中，ct-DNA濃度通過(guò)測(cè)定其紫外-吸收光譜確定(ct-DNA在260 nm 處的摩爾消光系數(shù)為6 600 L·mol-1·cm-1)[14]。

1.4 氧化斷裂DNA性能測(cè)定

向含有0.1 μg pBR322 DNA中加入不同濃度的2，同時(shí)加入過(guò)氧化氫(使得H2O2最終濃度為200 mmol·L-1)作為氧化劑，再加入Tris-HCl緩沖溶液Ⅱ(5 mmol·L-1Tris-HCl, 18 mmol·L-1NaCl, 2%DMF, pH 7.2)，總體積為10 μL。避光反應(yīng)2 h，瓊脂糖凝膠電泳2 h(77 V, 30 mA)，放入EB溶液中染色15 min，水沖洗后放入凝膠成像系統(tǒng)中成像。

2 結(jié)果與討論

2.1 性質(zhì)

(1) UV-Vis

2和ct-DNA有各自的UV-Vis譜圖，但由于兩者能夠特異性結(jié)合，使得UV-Vis譜圖也會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的變化。因此UV-Vis譜圖被認(rèn)為是用于探索小分子物質(zhì)與DNA相互結(jié)合模式最常用的方法。對(duì)于卟啉類分子，通常插入結(jié)合會(huì)導(dǎo)致其Soret帶發(fā)生較大幅度減色效應(yīng)(>35%)，并伴隨明顯紅移現(xiàn)象(>15 nm)，而當(dāng)發(fā)生外部結(jié)合模式時(shí)常伴隨較小程度紅移和減色效應(yīng)[15]。如圖1和圖2所示，隨著ct-DNA的加入，2的Soret帶發(fā)生了較小程度減色效應(yīng)，減色率為12.21%，并伴有微弱的紅移(3 nm)。使用公式(1)計(jì)算其與DNA的結(jié)合常數(shù)為0.9659×105L·mol-1。據(jù)此，我們初步推測(cè)2與DNA的結(jié)合模式可能為外部結(jié)合。

(1)

λ/nm

(2) 熒光光譜

2自身沒有熒光，本文采用溴化乙錠(EB)競(jìng)爭(zhēng)的方法間接探索其與DNA的相互作用。EB自身熒光很弱，但與DNA結(jié)合后形成的EB-DNA體系在610 nm會(huì)有很強(qiáng)的熒光[16]。如圖3和圖4所示，隨著2的加入，EB-DNA的熒光強(qiáng)度不斷降低。通過(guò)Stern-Volmer方程[17][公式(2)]計(jì)算其對(duì)EB-DNA體系熒光猝滅常數(shù)(KSV)為2.648×104L·mol-1，較低的淬滅常數(shù)表明2與DNA之間作用較弱，不是通過(guò)插入結(jié)合方式作用的，這與前面紫外-可見光譜的結(jié)果是一致的。

F0/F=1+KSV[Q]=1+Kqτ0[Q]

(2)

[DNA]/(μmol·L-1)

λ/nm

(3) 圓二色光譜

圓二色光譜是反映分子二級(jí)結(jié)構(gòu)的一種光譜，許多體內(nèi)大分子物質(zhì)都有其特征CD光譜。通常小分子物質(zhì)加入到DNA溶液中，會(huì)引起DNA的CD光譜強(qiáng)度發(fā)生變化，從而可以判定小分子物質(zhì)與ct-DNA的結(jié)合模式。ct-DNA在246 nm處有一個(gè)B型DNA螺旋引起的負(fù)CD吸收峰，在275 nm處有一個(gè)DNA堿基對(duì)堆積引起的正CD吸收峰。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)小分子與DNA相互作用的時(shí)候還會(huì)在Soret帶產(chǎn)生ICD峰：外部結(jié)合(正ICD或無(wú)ICD)，插入模式(負(fù)ICD)，自堆積模式(同時(shí)出現(xiàn)正負(fù)ICD)[17]。由圖5可以看出，隨著2的加入，在Soret帶均未看到有ICD峰的出現(xiàn)，因此可進(jìn)一步確定2與ct-DNA發(fā)生的是外部結(jié)合。

[2]/(μmol·L-1)

λ/nm

(4) 2氧化斷裂pBR322 DNA

圖6是2催化氧化DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。由圖6可以看出，在只有DNA或2而沒H2O2存在下，均未看到明顯的DNA斷裂(Lane 1， Lane 3)。而在H2O2存在下，有10%的Form II(缺刻型)DNA形成，這是因?yàn)镠2O2自身具有一定的氧化能力，與文獻(xiàn)結(jié)果類似[13]。而當(dāng)2的濃度為10 μmol·L-1時(shí)(Lane 4)，可以觀察到有15%的FormⅡ型DNA形成，2的濃度越大，F(xiàn)ormⅡ型DNA所占百分比則越大。當(dāng)2的濃度達(dá)到60 μmol·L-1時(shí)(Lane 7)，其氧化斷裂DNA的活性最強(qiáng)，達(dá)到31%。

圖6 pBR322 DNA與不同濃度的2的瓊脂糖凝膠電泳圖*

以五氟苯基二吡咯烷烴為原料，制得一種單羥基咔咯錳配合物——10-(4-羥基苯基)-5,15-二(2,3,4,5,6-五氟苯基)咔咯錳(III)配合物(2)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)UV-Vis和HR-MS(ESI)表征。由于2顯順磁性，因此無(wú)法獲得核磁信號(hào)，通過(guò)紫外滴定、熒光滴定、圓二色譜推測(cè)2與ct-DNA的結(jié)合模式為外部結(jié)合，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)探討了其催化氧化DNA活性。結(jié)果表明，2以外部結(jié)合模式與ct-DNA相結(jié)合，且在H2O2存在下，其能有效催化氧化pBR322 DNA斷裂。此發(fā)現(xiàn)對(duì)于開拓新型的人工核酸酶試劑及發(fā)展新型的抗癌試劑具有相應(yīng)的理論和臨床應(yīng)用價(jià)值。

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Synthesis of Mono-hydroxyl Corrole Manganese(III) Complex and Its Interaction with DNA

YANG Wen-cong, MO Ting-ting, LIN Ze-tan, ZENG Shu-ying, FANG Yu-qi, JIANG Tao, SHI Lei*

(Department of Chemistry, Guangdong University of Education, Guangzhou 510303, China)

Mono-hydroxyl corrole (1) was synthesized by condensation reaction of penta-fluorophenyl dipyrrolidine withp-hydroxybenzaldehyde. 10-(4-Hydroxylphenyl)-5,15-bis(2,3,4,5,6-pentafluorophenyl)corrol manganese was synthesized by reaction of 1 with manganese acetate. The structure was characterized by UV-Vis and HR-MS(ESI). The catalytic activity for the oxidation of DNA was tested by UV-Vis, fluorescence spectroscopic studies, circular dichroism spectra and agarose gel electrophoresis.

penta-fluorophenyl dipyrrolidine; corrole; manganese; DNA; oxidative cleavage; synthesis

2016-08-10；

2017-01-10

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(S2012040006270)； 廣東省本科高校教學(xué)質(zhì)量與教學(xué)改革工程專業(yè)綜合改革項(xiàng)目； 廣東大學(xué)生科技創(chuàng)新培育專項(xiàng)資金(攀登計(jì)劃專項(xiàng)資金)； 大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目

楊文聰(1993-)，男，漢族，廣東廣州人，本科生，主要從事配位化學(xué)的研究。 E-mail: 446107160@qq.com

史蕾，博士，講師， E-mail: shil@gdei.edu.cn

O614.81

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2017.03.16204