姜霽珊，方志紅，陳敏，王運(yùn)琦，吳欣明，賈慧麗，武語迪，高洪文，王學(xué)敏*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原030032)

紫花苜蓿尿黑酸植基轉(zhuǎn)移酶的克隆、表達(dá)分析以及遺傳轉(zhuǎn)化研究

姜霽珊1，方志紅2，陳敏1，王運(yùn)琦2，吳欣明2，賈慧麗2，武語迪1，高洪文1，王學(xué)敏1*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原030032)

維生素E是一種人體必需，卻不能自主合成的脂溶性維生素。尿黑酸植基轉(zhuǎn)移酶(HPT)是維生素E生物合成途徑的關(guān)鍵限速酶，直接影響植物體內(nèi)維生素E的總量。本實(shí)驗(yàn)利用同源克隆的方法，根據(jù)截形苜蓿的序列從紫花苜蓿中克隆得到HPT基因的完整開放閱讀框(ORF)。NCBI Blast分析結(jié)果表明，該基因編碼412個(gè)氨基酸，屬于異戊烯轉(zhuǎn)移酶UbiA超家族。多序列比對(duì)結(jié)果表明，該序列與其他物種的HPT蛋白序列相似度高達(dá)80%，將其命名為MsHPT。進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，MsHPT與截型苜蓿MtHPT親緣關(guān)系最近，蛋白序列相似度為96.84%。通過染色體步移技術(shù)得到該基因的啟動(dòng)子序列，分析結(jié)果顯示，該基因的啟動(dòng)子區(qū)域含有脅迫響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件(脫落酸、赤霉素和乙烯)以及大量的光響應(yīng)元件。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，MsHPT基因在紫花苜蓿各組織中均有表達(dá)，葉片中的表達(dá)量最高，根次之。經(jīng)低溫、NaCl、PEG、GA3和ABA誘導(dǎo)后該基因表達(dá)均上調(diào)，表明其可能參與了植物的抗逆性調(diào)控。擴(kuò)增MsHPT基因的開放閱讀框，對(duì)其進(jìn)行雙酶切后轉(zhuǎn)入雙元表達(dá)載體pBI121中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方式將該基因轉(zhuǎn)入擬南芥。通過PCR鑒定，得到7株陽性苗。本研究為進(jìn)一步探索MsHPT在紫花苜蓿維生素E的合成以及紫花苜?？鼓嬲{(diào)控中的作用奠定了基礎(chǔ)。

紫花苜蓿；尿黑酸植基轉(zhuǎn)移酶；維生素E；抗逆性；遺傳轉(zhuǎn)化

維生素E是一類脂溶性抗氧化劑，由暴露在膜外的親水性頭部和與質(zhì)膜結(jié)合的疏水性尾部組成[1]。根據(jù)疏水性尾部的飽和度，分為生育酚和生育三烯酚兩大類，前者含有完全飽和的20碳尾部，而后者在碳鏈的3"、7"、11"處存在雙鍵[2]。根據(jù)甲基取代位置和數(shù)目的不同，天然維生素E可分為α-、β-、γ-、δ-生育酚和α-、β-、γ-、δ-生育三烯酚8種類型[3]。在動(dòng)物中，α-生育酚可以被優(yōu)先吸收和運(yùn)輸，所以其活性最高[4]。所有的高等植物、藍(lán)細(xì)菌以及一些藻類都可以合成維生素E，其含量、組分和活性在不同物種、植物組織及發(fā)育時(shí)期差異顯著。α-生育酚主要存在于高等植物的葉片中，而生育三烯酚和γ-生育酚在種子中含量較高[5-6]。

維生素E是人和動(dòng)物必須從食物中攝取的一種脂溶性維生素。有研究表明，維生素E不僅可以預(yù)防糖尿病、腎病的發(fā)生，還可降低某些癌癥的發(fā)病幾率[7-10]。在飼料中添加生育酚可以提高肉的品質(zhì)，防止肉類腐敗、變味和變色[11-12]。對(duì)于植物而言，維生素E參與清理植物體內(nèi)由于逆境脅迫產(chǎn)生的自由基，從而提高植物對(duì)逆境的耐受力[6,13-15]。

紫花苜蓿(Medicagosativa)是目前在全國(guó)乃至世界上種植面積最廣的豆科牧草，素有“牧草之王”之稱。青飼、放牧或調(diào)制干草適口性均好[16-17]。研究紫花苜蓿維生素E的合成途徑、克隆參與維生素E合成的關(guān)鍵基因，并通過生物技術(shù)方法提高維生素E的含量對(duì)于改善紫花苜蓿品質(zhì)和提高其抗逆性具有十分重要的意義。本研究從紫花苜蓿中克隆了MsHPT的全長(zhǎng)cDNA序列，并對(duì)其蛋白序列及結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。通過染色體步移技術(shù)克隆了該基因的啟動(dòng)子，啟動(dòng)子序列分析結(jié)果表明，該基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在大量與脅迫和激素信號(hào)相關(guān)的響應(yīng)元件，通過模擬不同逆境(低溫、NaCl、PEG)和激素(GA3、ABA)處理對(duì)MsHPT基因在抗逆性調(diào)控中的可能作用進(jìn)行了探討。為進(jìn)一步研究該基因在維生素E合成和抗逆性調(diào)控中的作用，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方式將該基因轉(zhuǎn)入擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，共獲得7株轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性苗，可用于后續(xù)基因功能的研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)于2014年7月-2015年7月進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)所用紫花苜蓿中苜1號(hào)(M.sativacv. Zhongmu No.1)種子由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所楊青川研究員惠贈(zèng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取及cDNA的合成 用Trizol法[18]提取總RNA，參照RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司，立陶宛)將1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2 處理 將中苜1號(hào)種子平鋪于有濾紙的培養(yǎng)皿中，在光照培養(yǎng)箱(溫度為25 ℃，光照時(shí)間為16 h 光照/8 h黑暗)中培養(yǎng)至發(fā)芽，將長(zhǎng)出真葉的幼苗移至營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)3周后，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗各進(jìn)行處理。在鹽、干旱、赤霉素(GA3)和脫落酸(ABA)處理時(shí)，將植株根部分別浸泡于300 mmol/L NaCl、15% PEG、0.1 mmol/L GA3和0.1 mmol/L ABA中處理0、2、4、8、12和24 h，每個(gè)處理重復(fù)3次。低溫處理時(shí)，將植株放于4 ℃，在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣，每個(gè)處理重復(fù)3次。用Trizol法[18]提取經(jīng)處理的植株葉片RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將cDNA稀釋至5 ng/μL用于實(shí)時(shí)定量PCR，所得結(jié)果采用2-△△Ct分析方法[19]分析基因在不同處理?xiàng)l件下的表達(dá)量，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)2個(gè)技術(shù)重復(fù)。取未做處理的同一植株的根、莖、葉組織，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后用于組織表達(dá)特異性分析。

1.2.3 紫花苜蓿HPT基因克隆 將GenBank登記注冊(cè)的已有物種的HPT基因的cDNA序列Blast分析后得到其相對(duì)保守序列。再以截形苜蓿(Medicagotruncatula)HPT基因cDNA序列為參照，結(jié)合NCBI(National Center for Biotechnology Information，美國(guó)生物技術(shù)信息中心)上的Blast結(jié)果，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物HPT-ORF-F和HPT-ORF-R(表1)。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，共35個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后72 ℃延伸10 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物后，用DNA Gel Extract Kit(Fermentas公司，立陶宛)進(jìn)行膠回收，將回收的片段連接PMD-18T載體(TaKaRa公司，日本)，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞(天根生化科技有限公司)，挑選陽性克隆送上海英濰捷基有限公司測(cè)序。

1.2.4 紫花苜蓿HPT基因的分析 利用NCBI BlastP對(duì)獲得的HPT序列進(jìn)行分析，采用DNAMAN進(jìn)行多序列比對(duì)分析，利用MEGA 6.0采用鄰接法(Neighbor-Joining method)進(jìn)行蛋白的進(jìn)化樹分析，bootstrap值設(shè)定為500[20]。

表1 試驗(yàn)中所用到的引物序列

1.2.5 紫花苜蓿HPT基因啟動(dòng)子的克隆和分析 為深入分析MsHPT基因的表達(dá)，設(shè)計(jì)了特異性引物HPT-GSP1、HPT-GSP2、HPT-GSP3(表1)，采用染色體步移技術(shù)[18]得到該基因的啟動(dòng)子序列。利用PlantCARE啟動(dòng)子分析軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對(duì)克隆得到的MsHPT啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)紫花苜蓿MsHPT基因在不同組織和處理?xiàng)l件下的表達(dá)模式 參照SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa公司，日本)的引物設(shè)計(jì)原則，根據(jù)得到的紫花苜蓿MsHPTORF序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性引物(表1)。選擇Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，采用20 μL體系，用熒光定量PCR儀ABI 7500(ABI公司，美國(guó))進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。采取2步法，條件如下：第1步，95 ℃預(yù)變性2 min。第2步，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，采用2-△△Ct分析方法[19]分別計(jì)算紫花苜蓿MsHPT基因在根、莖、葉以及各處理?xiàng)l件下的表達(dá)量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)2個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.2.7 雙元表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化擬南芥 采用特異性引物HPT-PBI-F和HPT-PBI-R (表1) PCR擴(kuò)增得到MsHPT基因的開放閱讀框，片段兩側(cè)分別添加XbaI/SmaI限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(下劃線)，克隆至pBI121植物雙元表達(dá)載體中，挑選陽性克隆送上海英濰捷基有限公司測(cè)序，將測(cè)序正確且?guī)в心康幕虻妮d體和pBI121空載體分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，采用花序侵染法[21]轉(zhuǎn)化擬南芥。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫花苜蓿HPT基因的克隆與生物信息學(xué)分析

圖1 紫花苜蓿MsHPT開放閱讀框擴(kuò)增Fig.1 Electroporesis result of MsHPT ORFM:DL2000;1:ORF fragment.

根據(jù)NCBI上的Blast結(jié)果，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)HPT基因特異性引物，以紫花苜蓿cDNA為模板，擴(kuò)增得到1249 bp的目的片段。

利用DNAStar軟件對(duì)該cDNA序列進(jìn)行分析，該基因有一個(gè)1236 bp的完整開放閱讀框(圖1)，編碼411個(gè)氨基酸。氨基酸序列分析結(jié)果表明，該序列編碼的蛋白分子質(zhì)量約為45 kDa。在組成該酶的20種氨基酸中，堿性氨基酸(K、R)39個(gè)，酸性氨基酸(D、E)26個(gè)，疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V)189個(gè)，極性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)107個(gè)。

利用NCBI的Blast P對(duì)該蛋白進(jìn)行蛋白保守區(qū)預(yù)測(cè)及結(jié)構(gòu)功能域分析，結(jié)果顯示MsHPT屬于異戊烯轉(zhuǎn)移酶UbiA家族，有異戊烯轉(zhuǎn)移酶HPT1保守結(jié)構(gòu)域，在第178、182、311和315位有4個(gè)保守的活性位點(diǎn)。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，在組成該蛋白的411個(gè)氨基酸中包含171個(gè)α螺旋，占41.61%；93個(gè)延伸鏈，占22.63%；29個(gè)β轉(zhuǎn)角，占7.06%；118個(gè)隨機(jī)卷曲，占28.71%。

從GenBank中下載其他物種的HPT蛋白序列，采用DNAMAN軟件對(duì)所得序列與截形苜蓿(AES92284.2)、大豆(ABB70126.1)、油菜(AFB74212.1)和擬南芥(ADA57641.1)進(jìn)行多序列比對(duì)分析，結(jié)果顯示，該蛋白與其他物種的HPT高度同源，蛋白序列相似度達(dá)80%(圖2)。以上分析結(jié)果證明該基因是一個(gè)尿黑酸植基轉(zhuǎn)移酶基因，將其命名為MsHPT。

用MEGA 6.0軟件構(gòu)建HPT蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析結(jié)果顯示，在擬南芥、大豆、截形苜蓿中均存在兩個(gè)HPT，且HPT1和HPT2分別被聚為一類。紫花苜蓿MsHPT被聚在第一類中，表明本研究獲得的是I類HPT基因。從相似度(HPT1)來說，該蛋白與截形苜蓿親緣關(guān)系最近，相似度為96.84%；大豆GmHPT1次之，相似度為78.1%；與蘋果MdHPT和木薯MeHPT的相似度分別為67.80%和66.99 %，與擬南芥、油菜、小麥、玉米等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)。

2.2 紫花苜蓿MsHPT基因啟動(dòng)子的克隆與生物信息學(xué)分析

通過染色體步移技術(shù)[18]獲得3段MsHPT啟動(dòng)子序列，用DNAMAN軟件將所得序列拼接得到1.9 kb啟動(dòng)子序列。采用PlantCARE啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)MsHPT啟動(dòng)子區(qū)域存在的順式作用元件，結(jié)果表明，紫花苜蓿MsHPT啟動(dòng)子區(qū)域除含有大量的核心啟動(dòng)子元件TATA和CAAT之外，還有脫落酸、乙烯、赤霉素、茉莉酸甲酯等激素反應(yīng)元件以及大量的與光反應(yīng)有關(guān)的作用元件(表2)。

2.3MsHPT基因在不同組織的表達(dá)特異性

在同一株紫花苜蓿上分別取根、莖、葉組織，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析MsHPT在各組織中的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明，MsHPT基因在根、莖、葉中均有表達(dá)，葉片中表達(dá)量最高，為根和莖的350倍(圖4A)。

圖2 不同物種HPT蛋白序列多重比對(duì)Fig.2 Multiple sequence alignment of HPT from different species MsHPT: 紫花苜蓿 M. sativa；GmHPT1: 大豆 Glycine max ABB70126.1；AtHPT1: 擬南芥 Arabidopsis thaliana ADA57641.1；MtHPT1: 截形苜蓿 M. truncatula AES92284.2。下同 The same below.

圖 3 MsHPT 蛋白與其他物種HPT 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 The phylogenetic tree of MsHPT protein and other HPT proteins MdHPT: 蘋果 Malus domestica ACT75571.1; MeHPT: 木薯 Manihot esculenta ACC77744.1; BnHPT: 油菜 Brassica napus AFB74212.1; StHPT: 馬鈴薯 Solanum tuberosum ADJ21814.1; SpHPT: 潘那利番茄 Solanum pennellii ADZ24707.1; ZmHPT: 玉米 Zea mays ABB70122.1; TaHPT: 小麥 Triticum aestivum ABB70123.1;AtHPT2: 擬南芥 A. thaliana ABB70127.1; GmHPT2: 大豆 G. max NP_001237900.1;MtHPT2: 截形苜蓿 M. truncatula KEH41730.1.

順式作用元件Cis?elements序列Sequence作用FunctionABREGCCGCGTGGC脫落酸響應(yīng)元件AbscisicacidresponsivenesselementGARE?motifAAACAGA赤霉素響應(yīng)元件Gibberellin?responsiveelementP?boxCCTTTTG赤霉素響應(yīng)元件Gibberellin?responsiveelementTC?richrepeatsATTCTCTAAC脅迫響應(yīng)元件InvolvedindefenseandstressresponsivenessACEAAAACGTTTA光響應(yīng)元件InvolvedinlightresponsivenessATCT?motifAATCTAATCT光響應(yīng)元件InvolvedinlightresponsivenessBoxITTTCAAA光響應(yīng)元件InvolvedinlightresponsivenessBoxⅡGTGGATATTATAT光響應(yīng)元件InvolvedinlightresponsivenessCATT?motifGCATTC光響應(yīng)元件InvolvedinlightresponsivenessCGTCA?motifCGTCA茉莉酸甲酯響應(yīng)元件InvolvedintheMeJA?responsivenessEREATTTCAAA乙烯響應(yīng)元件Ethylene?responsiveelement

圖4 MsHPT在不同組織和處理?xiàng)l件下的表達(dá)模式Fig.4 Expression pattern of MsHPT in different tissues and in response to different treatments

2.4 不同處理?xiàng)l件下MsHPT基因的表達(dá)分析

之前的分析結(jié)果已經(jīng)顯示，MsHPT啟動(dòng)子區(qū)域存在大量的順式作用元件。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)不同處理?xiàng)l件下MsHPT的表達(dá)量進(jìn)行了分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MsHPT對(duì)于低溫響應(yīng)最為強(qiáng)烈且迅速，表達(dá)量在受誘導(dǎo)2 h達(dá)到對(duì)照的700倍，隨后回落到對(duì)照水平(圖4B)。鹽處理對(duì)于MsHPT的誘導(dǎo)作用最強(qiáng)。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，MsHPT的表達(dá)量逐漸上升并在8 h達(dá)到對(duì)照的2000倍以上，隨后急劇下降到對(duì)照水平并保持穩(wěn)定(圖4C)。模擬干旱處理?xiàng)l件下，MsHPT1轉(zhuǎn)錄水平在受誘導(dǎo)2 h達(dá)到對(duì)照的500倍，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低并維持在較低的表達(dá)水平(圖 4D)。赤霉素處理同樣誘導(dǎo)該基因的表達(dá)，并且表達(dá)量隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而緩慢上升，4 h時(shí)達(dá)到最大，隨后又緩慢降低到初始水平并保持穩(wěn)定(圖4E)。脫落酸處理2 h后MsHPT表達(dá)量就發(fā)生顯著上調(diào)，隨后表達(dá)量迅速回落并相對(duì)于對(duì)照顯著降低(圖4F)。

2.5MsHPT基因的遺傳轉(zhuǎn)化

圖 5 轉(zhuǎn)基因擬南芥分子檢測(cè)Fig. 5 PCR detection of transgenic A. thaliana M: DL2000 marker；WT: 野生型對(duì)照Wild type；L1～L9：轉(zhuǎn)基因株系 Transgenic lines.

采用帶有XbaI和SmaI酶切位點(diǎn)的特異性引物HPT-PBI-F和HPT-PBI-R(表1)PCR擴(kuò)增MsHPT基因的開放閱讀框，采用XbaI和SmaI對(duì)MsHPT和pBI121分別進(jìn)行酶切，通過T4連接酶將MsHPT連接到pBI121雙元表達(dá)載體中。將測(cè)序正確的陽性克隆轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，通過花序侵染法[21]轉(zhuǎn)化擬南芥。將侵染所得種子種在含有相應(yīng)抗性的培養(yǎng)基上篩選，選取T2代分離比為3∶1且T3代不分離的植株，用引物35S-PBI-F和GUS-PBI-R在分子水平上進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果表明，在7株苗中擴(kuò)增得到與目的片段大小相符的PCR產(chǎn)物(圖5)。

3 討論

維生素E合成途徑中主要有5個(gè)關(guān)鍵基因，根據(jù)功能的不同可將他們分為兩類，第一類包含對(duì)羥基丙酮酸雙加酶基因(HPPD)、尿黑酸植基轉(zhuǎn)移酶基因(HPT)、生育酚環(huán)化酶基因(TC)，主要決定維生素E的含量。另一類包含2-甲基-6-葉綠基-1，4-苯醌甲基轉(zhuǎn)移酶基因(MPBQMT)和γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因(γ-TMT)，主要決定維生素E的組分。研究表明，在擬南芥中反義表達(dá)HPT，顯著降低了維生素E的含量，利用種子特異性啟動(dòng)子過量表達(dá)HPT，可以顯著增加種子中維生素E的含量，由此說明HPT對(duì)于調(diào)節(jié)維生素E的積累具有重要作用[22-23]。本實(shí)驗(yàn)通過同源克隆得到了一個(gè)紫花苜蓿尿黑酸植基轉(zhuǎn)移酶基因，蛋白序列分析結(jié)果顯示，該基因編碼的蛋白屬于異戊烯轉(zhuǎn)移酶UbiA家族，有異戊烯轉(zhuǎn)移酶HPT1保守結(jié)構(gòu)域，可能具有調(diào)節(jié)生育酚合成的功能。此外，該基因編碼的蛋白與截形苜蓿親緣關(guān)系最近，與大豆次之，與擬南芥、油菜親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，但同源性也均高于80%，說明該基因在進(jìn)化過程中高度保守，具有重要作用。

我們通過染色體步移技術(shù)克隆得到MsHPT啟動(dòng)子，序列分析結(jié)果顯示，在MsHPT啟動(dòng)子區(qū)域含有大量與抗逆相關(guān)的反應(yīng)元件。此前一些研究發(fā)現(xiàn)HPT的確參與了逆境脅迫。Abbasi等[13]通過沉默HPT和γ-TMT研究發(fā)現(xiàn)，維生素E的不同組分在植物抵抗逆境脅迫時(shí)具有不同的作用。HPT基因被沉默后，轉(zhuǎn)基因植物的維生素E含量下降了98%，對(duì)于鹽、山梨醇脅迫的敏感性增強(qiáng)。Maeda等[24-25]通過對(duì)維生素E合成途徑中不同突變體的研究發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下，vte2-2(擬南芥尿黑酸植基轉(zhuǎn)移酶基因突變體)花青素的積累增加，生長(zhǎng)受阻，種子產(chǎn)量降低，從而證明維生素E對(duì)植物抵御低溫脅迫具有重要作用。進(jìn)一步研究表明，在低溫處理的早期，質(zhì)體中合成的維生素E參與調(diào)節(jié)多不飽和脂肪酸的代謝[26]。對(duì)紫花苜蓿幼苗進(jìn)行了低溫處理、鹽處理和PEG模擬干旱處理，結(jié)果顯示，鹽脅迫可顯著上調(diào)MsHPT的表達(dá)，鹽處理8 h，MsHPT表達(dá)量迅速上升隨后急劇下降到正常水平。MsHPT對(duì)于PEG模擬干旱處理響應(yīng)迅速，PEG處理2 h，表達(dá)量即迅速上升到對(duì)照的500倍，表明該基因?qū)τ诟珊得{迫的響應(yīng)極為敏感。在本實(shí)驗(yàn)中，MsHPT對(duì)低溫脅迫響應(yīng)同樣迅速，而且豐度更高：低溫處理2 h，表達(dá)量上升到處理的700倍，由此可見，Ⅰ類和Ⅱ類HPT基因可能都參與低溫脅迫調(diào)控，在植物抵御低溫逆境過程中發(fā)揮重要作用。Molina-Torres等[27]研究發(fā)現(xiàn)植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中生育酚的積累隨著環(huán)境脅迫壓力以及植物對(duì)于脅迫的敏感度不同而不斷變化，進(jìn)而響應(yīng)各種生物脅迫反應(yīng)，推測(cè)紫花苜蓿在逆境脅迫情況下可能通過調(diào)節(jié)MsHPT的表達(dá)量從而促進(jìn)維生素E的積累以抵御逆境脅迫，鑒于MsHPT基因?qū)δ婢车难杆夙憫?yīng)，推測(cè)生育酚可能在植物體內(nèi)作為一種信號(hào)物質(zhì)存在。MsHPT啟動(dòng)子區(qū)域存在赤霉素，脫落酸以及乙烯等與抗逆相關(guān)的植物生長(zhǎng)激素響應(yīng)元件[28-29]。赤霉素和脫落酸處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脫落酸和赤霉素均可以誘導(dǎo)MsHPT的表達(dá)。說明MsHPT受到多種激素信號(hào)機(jī)制的調(diào)控，但這些信號(hào)分子在MsHPT基因抗逆性調(diào)控過程中的作用還需做進(jìn)一步的研究。

如前所述，MsHPT對(duì)于低溫、鹽、干旱和激素處理都具有一定程度的響應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)為了深入研究該基因的功能，通過花序侵染法轉(zhuǎn)化了擬南芥，經(jīng)鑒定獲得7株陽性苗，后續(xù)我們將利用轉(zhuǎn)基因植株對(duì)MsHPT的功能進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證和研究，以揭示該基因在紫花苜蓿維生素E合成以及逆境脅迫調(diào)控中的作用。

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Cloning and expression analysis of homogentisate phytyltransferase fromMedicagosativaand its genetic transformation inArabidopsisthaliana

JIANG Ji-Shan1, FANG Zhi-Hong2, CHEN Min1, WANG Yun-Qi2, WU Xin-Ming2, JIA Hui-Li2, WU Yu-Di1, GAO Hong-Wen1, WANG Xue-Min1*

1.InstituteofAnimalScience,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China； 2.AnimalHusbandryandVeterinaryInstitute,ShanxiAcademyofAgriculturalSciences,Taiyuan030032,China

Vitamin E is an essential nutrient for humans, but we cannot synthesize it by ourselves. Homogentisate phytyltransferase (HPT) is a key enzyme that determines vitamin E content. In this study, according to the sequence ofMtHPTfromMedicagotruncatula, we cloned the Opening Reading Frame (ORF) ofHPTfromMedicagosativaby homology cloning strategy and termedMsHPT. NCBI blast results showed that it encoded a protein of 412 amino acid and belonged to the PT_UbiA superfamily. Multiple sequence alignment results showed that the similarity between the MsHPT protein and other HPT was 80%. In order to further study the gene, promoter sequences were cloned using genome walking technology. Analysis of theMsHPTpromoter showed that defense and stress responsiveness cis elements, hormone (MeJA, ABA, GA and ethylene) responsiveness cis elements and light responsiveness elements presented in the promoter. Quantitative Real-time PCR results revealed thatMsHPTwas expressed throughout the plant, mainly in the leaves. Expression levels ofMsHPTincreased significantly in response to cold, NaCl, PEG, GA3and ABA treatments. The ORF ofMsHPTwas amplified with restriction enzyme recognition sites added, inserted into vector pBI121 and transformed intoArabidopsisthalianabyAgrobacteriumtumefaciens-mediated transformation. According to the PCR results, seven positive lines were obtained. This study provides the basic information for further studies of the function ofMsHPTin vitamin E biosynthesis and stress tolerance ofM.sativa.

Medicagosativa; homogentisate phytyltransferase; vitamin E; stress tolerance; genetic transformation

2016-01-06；改回日期：2016-02-16

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973)(2014CB138703)， 物種資源保護(hù)項(xiàng)目(2130135)和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程(ASTIP-IAS10)資助。

姜霽珊(1987-)，女，遼寧大連人，在讀博士。E-mail：coral-jiang@hotmail.com*通信作者Corresponding author. E-mail：wangxuemin@caas.cn

10.11686/cyxb2016007 http://cyxb.lzu.edu.cn

姜霽珊， 方志紅， 陳敏， 王運(yùn)琦， 吳欣明， 賈慧麗， 武語迪， 高洪文， 王學(xué)敏. 紫花苜蓿尿黑酸植基轉(zhuǎn)移酶的克隆、表達(dá)分析以及遺傳轉(zhuǎn)化研究. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 26(3): 82-90.

JIANG Ji-Shan, FANG Zhi-Hong, CHEN Min, WANG Yun-Qi, WU Xin-Ming, JIA Hui-Li, WU Yu-Di, GAO Hong-Wen, WANG Xue-Min. Cloning and expression analysis of homogentisate phytyltransferase fromMedicagosativaand its genetic transformation inArabidopsisthaliana. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(3): 82-90.