王紅梅,屠焰,張乃鋒,司丙文,馬濤,薩茹拉,那亞,刁其玉*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010011)

飼用酶制劑在反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中的應(yīng)用進(jìn)展

王紅梅1,屠焰1,張乃鋒1,司丙文1,馬濤1,薩茹拉2,那亞3,刁其玉1*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010011)

一般情況下，在瘤胃中粗飼料細(xì)胞壁組分的消化利用率較低，由于其復(fù)雜緊密的結(jié)構(gòu)限制了動(dòng)物對(duì)粗飼料的利用。因此，在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中提高粗飼料利用率的應(yīng)用研究是非常必要的，不僅改善飼料利用率、提高動(dòng)物生產(chǎn)性能，還為飼料資源的開發(fā)與利用乃至為畜牧業(yè)發(fā)展提供有效途徑。而飼用酶制劑以其綠色、環(huán)保、安全等特點(diǎn)成為了該研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。通常采用體外和半體內(nèi)法評(píng)定酶制劑處理對(duì)粗飼料體外發(fā)酵和瘤胃降解特性的影響，并采用體內(nèi)法評(píng)價(jià)酶制劑在反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中的應(yīng)用效果。研究表明，外源酶制劑的應(yīng)用能夠有效提高飼料消化率、奶牛產(chǎn)量、肉牛增重和肉羊增重，但其效果不一致，其效果受很多因素的影響，包括酶種類、酶活性、飼糧組成、添加水平、添加方式、動(dòng)物種類及生長(zhǎng)性能等。另外，由于人們對(duì)所用酶產(chǎn)品的生化特性掌握不足，導(dǎo)致了對(duì)其作用機(jī)理、優(yōu)化條件及影響其作用效果因子的了解不夠充分。如酶活性作為酶制劑最主要的生化特性，在使用前往往被忽略檢測(cè)，并且目前國(guó)內(nèi)外對(duì)酶活性的檢測(cè)及質(zhì)量評(píng)定還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。然而研究結(jié)果間直接進(jìn)行比較也是不科學(xué)不合理的。本研究主要從飼用酶制劑的發(fā)展歷程，反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中纖維降解酶的作用機(jī)理、應(yīng)用效果和影響其作用效果的因素以及存在問題等方面進(jìn)行了綜述，旨在為飼用酶制劑在反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中的應(yīng)用提供系統(tǒng)的科學(xué)知識(shí)。

纖維降解酶；作用機(jī)理；纖維消化；反芻動(dòng)物；應(yīng)用

飼用酶制劑以其綠色、環(huán)保、安全等特點(diǎn)成為飼料添加劑領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，飼用酶制劑的研發(fā)和應(yīng)用是生物技術(shù)在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)和飼料工業(yè)中應(yīng)用最為成功的例子[1]。飼用酶制劑的應(yīng)用對(duì)于改善飼料利用率、提高動(dòng)物生產(chǎn)性能、開發(fā)新的飼料資源、減少環(huán)境污染發(fā)揮了巨大作用，在實(shí)現(xiàn)我國(guó)畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略中有著極為廣闊的應(yīng)用前景。

近年來，很多研究表明通過反芻動(dòng)物飼糧中添加外源酶制劑可提高肉牛[2-3]、肉羊增重[4-5]和奶牛產(chǎn)奶量[6-7]，這些動(dòng)物生產(chǎn)性能的提高主要?dú)w因于飼料消化率的提高[3,8]。不論在體外[9-10]、半體內(nèi)[11-12]，還是在體內(nèi)[13-14]，纖維降解酶處理均能夠提高飼料的干物質(zhì)采食量和纖維降解率。然而，也有研究認(rèn)為，添加外源酶對(duì)動(dòng)物采食量和生產(chǎn)性能并沒有影響[15-16]。目前，國(guó)內(nèi)外飼用酶制劑產(chǎn)品很多，但其效果不一致，而且對(duì)酶制劑產(chǎn)品的生化特性及質(zhì)量還尚未形成統(tǒng)一的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)。這反映出人們對(duì)所用酶制劑產(chǎn)品的生化特性了解不足，從而導(dǎo)致了對(duì)其作用機(jī)理、優(yōu)化條件及影響其作用效果因子的了解不夠深入。因此，本研究主要從飼用酶制劑的發(fā)展歷程，反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中纖維降解酶的作用機(jī)理與應(yīng)用效果及影響其作用效果的因素等方面進(jìn)行綜述，旨在為飼用酶制劑在反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中的應(yīng)用提供系統(tǒng)的科學(xué)知識(shí)。

1 飼用酶制劑的發(fā)展歷程

酶制劑作為動(dòng)物飼料添加劑應(yīng)用比較晚，直到1975年，美國(guó)將酶制劑首次應(yīng)用于配合飼料中，并取得顯著效果[17]，從此才出現(xiàn)了商品飼用酶制劑，并日益受到世界養(yǎng)殖業(yè)的重視。20世紀(jì)90年代初，我國(guó)開始飼用酶制劑的研究與應(yīng)用，產(chǎn)品不斷增加，質(zhì)量不斷提高，在短短十幾年的時(shí)間里，就有了上百種酶制劑產(chǎn)品，并逐步應(yīng)用到豬、禽、水產(chǎn)及反芻動(dòng)物等各個(gè)養(yǎng)殖領(lǐng)域[18]，但我國(guó)飼用酶制劑的開發(fā)與應(yīng)用較發(fā)達(dá)國(guó)家還有很大差距，作為世界上的養(yǎng)殖大國(guó)，我國(guó)市場(chǎng)發(fā)展?jié)摿薮蟆?/p>

過去，盡管通過育種和農(nóng)藝學(xué)研究手段能夠明顯提高粗飼料細(xì)胞壁降解率，但粗飼料消化率仍然是限制反芻動(dòng)物有效能攝入的主要原因之一，同時(shí)有過量的養(yǎng)分排泄于體外[19]。外源酶被認(rèn)為是提高反芻動(dòng)物粗飼料利用率和生產(chǎn)效率的有效方法，采用酶技術(shù)提高家畜飼料利用效率已不再是新技術(shù)手段。起初，此技術(shù)在豬和家禽飼料應(yīng)用還是比較公認(rèn)的，但在反芻動(dòng)物飼糧中使用是有爭(zhēng)議的，因?yàn)槠毡檎J(rèn)為飼用酶制劑很有可能被瘤胃微生物蛋白酶水解或被小腸內(nèi)蛋白酶失活[8]。然而后來很多研究證實(shí)，外源多糖降解酶在瘤胃中具有足夠的穩(wěn)定性，并在十二指腸仍保持了其大部分活性[20]，同時(shí)大量生產(chǎn)研究也表明，外源酶的添加不僅不會(huì)破壞抑制內(nèi)源酶，而且能幫助和促進(jìn)動(dòng)物的消化吸收，從而進(jìn)一步肯定了飼用酶制劑在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用。

2 反芻動(dòng)物飼用酶制劑——纖維降解酶

粗飼料是反芻動(dòng)物飼糧的基礎(chǔ)，即使在高精料飼糧中也要有一定量粗飼料來刺激瘤胃的健康發(fā)育與生理蠕動(dòng)。反芻動(dòng)物主要依賴于其瘤胃中大量的細(xì)菌、纖毛蟲、真菌等微生物消化粗纖維，需要微生物所分泌的酶來水解植物細(xì)胞壁。然而，在理想的飼喂條件下，植物細(xì)胞壁的消化道降解率仍低于65%，且粗飼料干物質(zhì)中通常含有40%～70%的細(xì)胞壁成分[21]。因此，添加外源酶制劑，能夠補(bǔ)充動(dòng)物內(nèi)源酶，提高內(nèi)源酶的活性，促進(jìn)飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收，進(jìn)而提高動(dòng)物對(duì)粗飼料的利用率，并可消除抗?fàn)I養(yǎng)因子，還能減少腸道微生物的數(shù)量，減少疾病，有利于家畜健康。反芻動(dòng)物飼用酶制劑產(chǎn)品是真菌(主要為木霉屬、黑曲霉屬和米曲霉屬)和細(xì)菌(主要為芽孢桿菌屬)的發(fā)酵產(chǎn)物[22]。其中，纖維素酶和木聚糖酶的使用最為廣泛[23]，能夠降解植物細(xì)胞壁，從而具備了水解粗飼料中纖維的能力。Beauchemin等[17]指出，外源纖維降解酶在反芻動(dòng)物中應(yīng)用始于20世紀(jì)60年代。早期飼用酶制劑產(chǎn)品性能較差，其效果不穩(wěn)定，更沒有反芻動(dòng)物的專用酶制劑。但不斷地研究證明，外源酶的應(yīng)用不僅降低飼養(yǎng)成本，而且還產(chǎn)生積極效果，因此進(jìn)一步定義了它在反芻動(dòng)物中的可用性。最初是作為青貯飼料添加劑應(yīng)用于反芻動(dòng)物飼糧并對(duì)其作用效果進(jìn)行評(píng)價(jià)[11]。有研究表明，在牧草或苜蓿(Medicagosativa)青貯原料中添加這些酶制劑能夠降低青貯飼料植物結(jié)構(gòu)性碳水化合物的濃度[24-25]，進(jìn)而改善肉羊體內(nèi)干物質(zhì)消化率，提高肉牛增重[26]和奶牛產(chǎn)奶量[27]。近年來，越來越多的研究者通過反芻動(dòng)物飼糧中添加外源酶制劑取得了較好的飼喂效果[2-7,13-14]。

3 纖維降解酶在植物細(xì)胞壁降解中的作用機(jī)理

目前，反芻動(dòng)物飼用酶制劑的研究重點(diǎn)主要是植物細(xì)胞壁降解酶。纖維素和半纖維素，是植物主要的結(jié)構(gòu)性多糖[21]，將其轉(zhuǎn)化為可溶性糖的酶統(tǒng)稱為纖維素酶和半纖維素酶。很多商業(yè)纖維素復(fù)合酶產(chǎn)品中纖維素酶和半纖維素酶是并存的，而且它們各自在復(fù)合酶產(chǎn)品中所占比例及其活性直接影響細(xì)胞壁降解效果。一般纖維降解酶產(chǎn)品中除了纖維素酶和木聚糖酶，還包含一些消化酶作為副酶，如淀粉酶、蛋白酶、果膠酶。

纖維素水解是一個(gè)復(fù)雜的過程，由多種水解酶組成的纖維素酶完成，纖維素酶是指能降解纖維素的一類酶的總稱，屬于復(fù)雜復(fù)合酶系，其中主要包括內(nèi)切纖維素酶(內(nèi)切葡聚糖酶、內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶、羧甲基纖維素酶)、外切纖維素酶(外切葡聚糖酶、外切β-1,4-葡聚糖酶)和β-葡萄糖苷酶(纖維二糖酶)等功能酶。還有分解纖維素的其他酶類，如木聚糖酶和果膠酶。在一般情況下，內(nèi)切葡聚糖酶能在纖維素鏈內(nèi)部任意斷裂β-1,4-糖苷鍵產(chǎn)生低分子纖維糊精；外切葡聚糖酶能從纖維素鏈的非還原端依次裂解β-1,4糖苷鍵釋放出纖維二糖分子，而β-葡萄糖苷酶能將纖維二糖及其他低分子纖維糊精分解為葡萄糖。實(shí)際上在分解晶體纖維素時(shí)任何一種酶都不能單獨(dú)裂解晶體纖維素，只有這3種酶共同存在并協(xié)同作用下方能完成水解過程。

木聚糖是植物半纖維素的主要成分，約占植物細(xì)胞干重的15%～35%。將木聚糖聚合物轉(zhuǎn)化為可溶性糖的水解酶主要有木聚糖酶和β-1,4-木糖苷酶，木聚糖酶包括內(nèi)切β-1,4-木聚糖酶(水解產(chǎn)物為小寡糖和木二糖等低聚木糖)和β-木糖苷酶(水解產(chǎn)物為木糖)。木聚糖的生物降解也需要一個(gè)復(fù)雜的酶系統(tǒng)，通過其中各種組分的相互協(xié)同作用來降解木聚糖。其他半纖維素酶主要為側(cè)鏈水解酶，包括β-甘露糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-D-葡糖苷酸酶、α-D-半乳糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶和阿魏酸酯酶[23]。

纖維降解酶的活性通常取決于轉(zhuǎn)化底物中還原糖的釋放率，其單位以酶促反應(yīng)中單位時(shí)間內(nèi)作用物的消耗量或產(chǎn)物的生成量表示。一般采用DNS(3,5-二硝基水楊酸)比色法測(cè)定還原糖的生成量，從而獲得酶的活力。測(cè)定纖維素酶活性最常用的底物為羧甲基纖維素，主要用來測(cè)定內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶的活性。外切葡聚糖酶活測(cè)定是以結(jié)晶纖維素為底物，如微晶纖維素。而β-葡萄糖苷酶活性測(cè)定方法常以纖維二糖和對(duì)硝基苯-β-D-葡萄糖苷(pNPG)為反應(yīng)底物[23]。木聚糖酶活性測(cè)定也同樣采用DNS法。

酶活的測(cè)定對(duì)環(huán)境條件，如溫度、pH、離子強(qiáng)度、底物濃度和類型的要求比較嚴(yán)格，因?yàn)檫@些因素都會(huì)影響酶的活性。一般情況下，商業(yè)酶制劑的最佳溫度為60 ℃和pH 4.0～5.0[28]，但這與反芻動(dòng)物瘤胃實(shí)際條件(39 ℃，pH 6.0～6.7)[21]相差甚遠(yuǎn)，因此商業(yè)理論酶活往往高于實(shí)際應(yīng)用，能否在瘤胃及腸道仍然發(fā)揮其酶解功效，還需要大量的試驗(yàn)驗(yàn)證。由于生產(chǎn)條件和方法的差異，對(duì)不同廠家酶產(chǎn)品及其在反芻動(dòng)物飼糧中的應(yīng)用效果很難進(jìn)行比較。

近年來，酯酶(阿魏酸酯酶、肉桂酸酯酶)作為消除飼料細(xì)胞壁中木質(zhì)素交聯(lián)結(jié)構(gòu)的側(cè)鏈酶被認(rèn)為是解決和提高細(xì)胞壁最終降解率的新型酶源[29]，然而其相關(guān)研究還很少，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 纖維降解酶在反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中應(yīng)用效果

大多數(shù)研究結(jié)果表明，添加飼用酶制劑對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)性能起到改善作用，而針對(duì)不同畜種動(dòng)物中的應(yīng)用效果也有所差異。

4.1 奶牛

近年來，有關(guān)纖維降解酶處理飼糧對(duì)奶牛飼喂效果的研究報(bào)道很多[6-7,30-39]，其中大多是評(píng)價(jià)酶制劑對(duì)奶牛采食量、消化率和產(chǎn)奶量方面的影響，并且能夠產(chǎn)生積極有效的作用?？偨Y(jié)以上近15個(gè)試驗(yàn)30余個(gè)處理結(jié)果可知，酶制劑處理平均提高干物質(zhì)采食量(DMI)(1.0±1.3) kg/d，干物質(zhì)(DM)消化率(4.2±3.5)%，中性洗滌纖維(NDF)消化率(6.8±7.3)%和產(chǎn)奶量 (1.1±1.5) kg/d [提高(3.4±4.7) %]。由此可見，添加纖維降解酶對(duì)奶牛的飼喂效果會(huì)產(chǎn)生積極作用，但在不同試驗(yàn)條件下其作用程度不完全相同。

很多研究表明，在高質(zhì)量粗飼料[如苜蓿、玉米(Zeamays)青貯飼料等]基礎(chǔ)飼糧中添加纖維降解酶對(duì)奶牛生產(chǎn)性能和飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率具有促進(jìn)作用。Yang等[6]報(bào)道，在泌乳早期奶牛精料補(bǔ)充料中添加復(fù)合酶制劑(高活性木聚糖酶和低活性纖維素酶)顯著提高產(chǎn)奶量2.1 kg/d(提高5.9%)，并顯著提高DM和粗蛋白質(zhì)(CP)消化率分別為4.2%和6.9%(P<0.05)，但將酶制劑添加到全混合日糧(TMR)中時(shí)沒有產(chǎn)生效果(表1)。Gado等[40]研究表明，與對(duì)照組相比，酶(ZADO?)處理組DMI、產(chǎn)奶量和乳蛋白質(zhì)產(chǎn)量分別顯著提高13%、23%和27%(P<0.05)，NDF和ADF消化率也分別顯著提高40%和33%(P<0.05)(表1)。Arriola等[35]以高或低精料TMR為對(duì)照，分別添加復(fù)合酶制劑(3.4 mg/g TMR，DM基礎(chǔ))，研究結(jié)果顯示，TMR中添加外源酶能夠提高DM、CP、NDF、ADF消化率和產(chǎn)奶量，且低精料飼糧加酶組飼料轉(zhuǎn)化率高于高精料飼糧對(duì)照組(表1)。

另有研究報(bào)道，在泌乳早期[41]或中期[42]奶牛飼糧中添加纖維降解酶會(huì)降低血漿β-羥基丁酸濃度，這表明減少了脂肪組織中的脂肪調(diào)動(dòng)，從而提高奶牛能量水平。然而，Peter等[37]研究結(jié)果表明，無論是泌乳早期還是泌乳中期添加外源酶對(duì)奶牛血漿β-羥基丁酸的濃度都沒有影響。相比之下，也有研究證明，外源酶的應(yīng)用能夠促進(jìn)微生物蛋白質(zhì)的合成，也就是說，提高瘤胃微生物菌群數(shù)量[16,43]。但也有一些研究表示，對(duì)瘤胃微生物區(qū)系沒有影響[34]。

4.2 肉牛

關(guān)于纖維降解酶在肉牛中的應(yīng)用研究也很多，包括體外[44-45]、半體內(nèi)[11,13,46]和體內(nèi)研究[16,47-49]，但效果不一致。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在外源酶對(duì)肉牛的飼喂效果方面進(jìn)行了大量的研究，主要分為兩個(gè)方面：一是在高纖維飼糧中添加纖維降解酶的研究[2,15,50-52]，其中，一些研究表明，飼糧中添加纖維降解酶能夠提高纖維消化率[50,52]，但是纖維消化率的改善能否提高肉牛生產(chǎn)性能還依賴于肉牛生理狀態(tài)和試驗(yàn)條件；二是在高精料飼糧中添加纖維降解酶的研究[8,53]，其效果與其在高纖維飼糧中的相比，更為一致。如表2所示，在95%的大麥(Hordeumvulgare)基礎(chǔ)飼糧中添加不同水平的木聚糖酶可提高飼料轉(zhuǎn)化率6%～12%，這歸因于飼糧消化率的提高[54]。Balci等[44]也報(bào)道，高精料飼糧中添加纖維降解酶可顯著提高平均日增重(ADG) 28%和飼料轉(zhuǎn)化率22%(P<0.05)，并顯著提高DM和NDF消化率(P<0.05)。Salem等[3]報(bào)道，添加復(fù)合酶[40 g/(頭·d)]顯著提高肉牛ADG 16%(P<0.05)，顯著提高DM和NDF消化率(P<0.05)。而Mcallister等[2]和Zobell等[15]前后分別采用相同的酶制劑(木聚糖酶+β-葡聚糖酶)應(yīng)用于高精料飼糧(分別為30%和17%粗飼料占TMR DM基礎(chǔ))，前面研究結(jié)果顯示，添加3.5 L/t TMR DM水平的酶制劑顯著提高ADG 10%(P<0.05)，而后面研究表示，酶制劑處理對(duì)肉牛的飼喂效果沒有影響。另外，外源酶也能夠提高肉牛屠宰性能，如Eun等[48]報(bào)道，纖維降解酶處理組肉牛第12根肋骨脂肪厚度降低8.8%，而Vargas等[55]表示，添加酶制劑能夠顯著提高胴體重和肌肉嫩度(P<0.05)，然而其經(jīng)濟(jì)效益還有待進(jìn)一步研究。

表1 外源酶制劑對(duì)泌乳早期奶牛飼喂效果的影響

Con為對(duì)照組，Conc為精料補(bǔ)充料，TMR為全混合飼糧。Con: Control; Conc: Concentrate; TMR: Total mixed ration.

1)酶制劑：木聚糖酶+纖維素酶；添加水平為50 mg/kg TMR(干物質(zhì)基礎(chǔ))；TMR：玉米青貯24%，苜蓿草14%和精料補(bǔ)充料62%(干物質(zhì)基礎(chǔ))。Enzyme: xylanase and cellulase; Addition level: 50 mg/kg TMR on DM basis; TMR: 24% corn silage, 14% alfalfa hay, and 62% concentrate on DM basis.

2)酶制劑：纖維素酶+木聚糖酶+α-淀粉酶+蛋白酶；添加水平：40 g/(頭·d)；TMR：玉米青貯0.7和精料補(bǔ)充料0.3 (DM基礎(chǔ))。Enzyme: cellulase, xylanase, α-amylase and protease; Addition level: 40 g/(head·d) TMR on DM basis; TMR: 0.7 corn silage and 0.3 concentrate on DM basis.3)酶制劑：纖維素酶+酯酶+木聚糖酶；添加水平：3.4 mg/g TMR (DM基礎(chǔ))；對(duì)照A為低精料TMR，玉米青貯49%，苜蓿草13%，棉籽殼5%，精料補(bǔ)充料33%；對(duì)照B為高精料TMR：玉米青貯37%，苜蓿草10%，棉籽殼5%，精料補(bǔ)充料48% (DM基礎(chǔ))。Enzyme: cellulase, esterase and xylanase; Addition level: 3.4 mg/g TMR on DM basis; Control A was the low-concentrate diet, which contain 49% corn silage, 13% alfalfa hay, 5% cottonseed hulls and 33% concentrate on DM basis; Control B was the high-concentrate diet, which contain 37% corn silage, 10% alfalfa hay, 5% cottonseed hulls and 48% concentrate on DM basis.

‘a(chǎn)，b’表示差異顯著(P<0.05)。‘a(chǎn), b’ mean significant differences (P<0.05). 下同。The same below.

4.3 育肥羊

早在1987年，Baran等[56]以成年綿羊和斷奶羔羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物，評(píng)價(jià)了酶制劑(果膠酶+纖維素酶)處理對(duì)瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響，結(jié)果顯示，與成年綿羊相比，酶制劑對(duì)羔羊的效果更為顯著，有效改善了瘤胃發(fā)酵功能，但對(duì)成年動(dòng)物的作用效率低。并認(rèn)為反芻動(dòng)物瘤胃自身的微生態(tài)系統(tǒng)對(duì)酶制劑降解具有重要作用，一旦瘤胃發(fā)育完全，那么其自身就能夠抵抗生物技術(shù)等外來干擾。Mcallister等[2]分別在成年綿羊[(56±0.8) kg]的飼糧粗飼料成分(大麥青貯)和瘤胃中添加酶制劑進(jìn)行飼喂試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)采食量沒有影響，但瘤胃加酶組反而顯著降低DM和NDF消化率(P<0.05)，而大麥青貯加酶組的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率與對(duì)照組沒有差異。然而，Giraldo等[57]研究纖維降解酶處理高纖維飼糧對(duì)成年綿羊[(60.0±4.4) kg]營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率和瘤胃發(fā)育的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，在飼料與酶的相互作用之前，外源酶制劑能夠直接提高瘤胃液纖維降解酶活性和其刺激作用增加纖維降解菌數(shù)量。通過在育肥羊中的應(yīng)用實(shí)例證明，添加纖維降解酶能夠提高肉羊增重[4-5]，但也有研究認(rèn)為，沒有影響[58]。另外，還有研究認(rèn)為外源酶能夠改善羔羊飼糧(90%苜蓿草+10%玉米，DM基礎(chǔ))纖維降解率，但將玉米的比例提高至25%時(shí)效果不佳，這表明在高纖維飼糧中添加酶制劑對(duì)羔羊的飼喂效果更為明顯[59]。同樣，李曉東等[60]研究認(rèn)為，肉羊飼糧能量水平對(duì)酶制劑效果的影響大于蛋白水平，低能量水平下添加酶制劑能夠顯著提高粗脂肪消化率和鈣的吸收率(P<0.05)，但不能提高粗纖維的消化率和磷的吸收率。

表2 高精料飼糧中添加酶制劑對(duì)育肥牛的影響

1)TMR(DM基礎(chǔ))由95%大麥和5%大麥青貯組成；添加酶：木聚糖酶B；設(shè)2個(gè)添加水平：1和2 L/t TMR(DM基礎(chǔ))。TMR was composed of 95% barley and 5% barley silage; Enzyme: xylanase B; Addition levels: 1, 2 L/t TMR on DM basis.

2)TMR由精料補(bǔ)充料和小麥秸稈組成；添加酶：纖維素酶+木聚糖酶；添加量為7.5 g/(頭·d)。TMR was composed of concentrate and wheat straw; Enzyme: cellulase and xylanase; Addition level: 7.5 g/(head·d).

3)TMR由85.3%精料補(bǔ)充料，14.7%水稻草組成，酶制劑為內(nèi)切葡聚糖酶，木聚糖酶，α-淀粉酶和蛋白酶的粉狀混合物；添加量為40 g/(頭·d)。TMR was composed of 85.3% concentrate and 14.7% rice grass; Enzyme: endoglucanase, xylanase, α-amylase and protease; Addition levels: 40 g/(head·d).

‘c，d’表示P<0.10。 ‘c, d’ meanP<0.10.

一些研究表明，同一種酶在不同試驗(yàn)條件下產(chǎn)生的飼喂效果也有所差異。如Pinos等[61-62]前后使用同樣的復(fù)合酶制劑(Fibrozyme，Alltech Inc.，Nicholasville，KY)進(jìn)行了兩次肉羊飼喂試驗(yàn)，首先是以苜?；蚝邴湶?Loliumperenne)為粗飼料的飼糧為2個(gè)對(duì)照，加或不加酶設(shè)計(jì)4個(gè)處理組，酶添加量為5 g/(只·d)，通過17 d的飼喂試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，酶處理能夠顯著提高DM、有機(jī)物(OM)和CP采食量、N沉積量和總揮發(fā)性脂肪酸含量(3和6 h)(P<0.05)，苜蓿加酶處理組能夠提高CP和半纖維素消化率(P<0.05)和NDF消化率(P<0.10)，并表明外源酶可能會(huì)改變不同營(yíng)養(yǎng)水平粗飼料的瘤胃發(fā)酵、采食量和消化率。其次是設(shè)計(jì)3種(4∶6；5∶5；6∶4)精粗比飼糧和2種(0、2 g/kg TMR DM)添加水平共6個(gè)處理組，并評(píng)價(jià)了酶制劑對(duì)飼糧的消化率和瘤胃發(fā)酵的影響，研究結(jié)果表明，外源纖維降解酶能夠提高DM和NDF的瘤胃降解速率，但對(duì)羔羊生長(zhǎng)性能和瘤胃發(fā)酵沒有影響。還有Cruywagen等[63-64]分別針對(duì)真菌(菌株ABO 374)酶產(chǎn)品的不同添加水平和不同添加方式進(jìn)行了羔羊飼喂試驗(yàn)(表3)，結(jié)果表明，酶的不同添加水平對(duì)DMI沒有影響，但能夠顯著提高羔羊增重和飼料轉(zhuǎn)化率；類似地，酶的不同添加方式對(duì)羔羊DMI沒有影響，但液態(tài)酶的效果優(yōu)于粉狀酶，且液態(tài)酶在高纖維飼糧中效果更佳，而粉狀酶在低纖維飼糧中效果不明顯，并認(rèn)為羔羊增重可能是由于瘤胃水解功能的改善從而促進(jìn)瘤胃內(nèi)纖維的消化率所致，這也是人們普遍認(rèn)為的酶制劑作用方式。

飼用酶在育肥山羊和孕期、泌乳期羊飼糧中應(yīng)用并不常見，然而Titi[65]針對(duì)葵花籽粕代替育肥山羊蛋白飼料豆粕進(jìn)行了營(yíng)養(yǎng)水平評(píng)價(jià)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)處理組豆粕組，葵花籽粕組和葵花籽粕+酶組，試驗(yàn)期為12周，結(jié)果表明，酶處理組顯著提高山羊增重、采食量和飼料轉(zhuǎn)化率(P<0.05)，其ADG比豆粕組、葵花籽粕分別提高42%和56%。次年，Titi等[66]使用同樣的纖維素酶處理孕期和泌乳期綿羊和山羊飼糧，并評(píng)價(jià)了對(duì)母羊和羔羊生產(chǎn)性能的影響(表4)，結(jié)果表明，纖維素酶處理能夠顯著提高產(chǎn)奶量10%～12%(P<0.05)，山羊的產(chǎn)奶量顯著高于綿羊(P<0.05)，而綿羊奶中脂肪和蛋白質(zhì)含量顯著高于山羊(P<0.05)；從羔羊初生體重和斷奶體重來看，酶制劑處理顯著提高小綿羊的斷奶體重(P<0.05)，但對(duì)小山羊的斷奶體重和不同種、不同性別及不同胎數(shù)羔羊的初生體重沒有影響(P>0.05)。

表3 同一種酶在不同試驗(yàn)條件下對(duì)羔羊生長(zhǎng)性能的影響

1)真菌(菌株ABO 374)酶: TMR由39.2%小麥秸稈, 27.6%苜蓿草, 19.7%玉米粉, 6.5%棉籽餅粕和5.7%糖蜜組成; 添加水平為1, 5, 10 mL/kg 小麥秸稈。Fungal enzyme (strain ABO 374): TMR was composed of 39.2% wheat straw, 27.6% lucerne hay, 19.7% maize meal, 6.5% cottonseed oil cake and 5.7% molasses; Addition levels: 1, 5, 10 mL/kg wheat straw on an air basis.

2)高纖維飼糧由46%小麥秸稈, 27.3%燕麥草, 18.4%苜蓿草, 3.2%玉米粉, 2%豆粕和2%糖蜜組成; 低纖維飼糧由30%小麥秸稈, 18%燕麥草, 12%苜蓿草, 23.9%玉米粉, 10%豆粕和5%糖蜜組成; 酶添加量為7.5 mL/kg TMR(風(fēng)干基礎(chǔ))。High forage diet was composed of 46% wheat straw, 27.3% oat hay, 18.4% lucerne hay, 3.2% maize meal, 2% cottonseed meal and 2% molasses; Low forage diet was composed of 30% wheat straw, 18% oat hay, 12% lucerne hay, 23.9% maize meal, 10% cottonseed meal and 5% molasses; Addition level: 7.5 mL/kg TMR on an air basis.

表4 添加纖維素酶飼糧對(duì)綿羊和山羊的采食量、產(chǎn)奶量和奶成分及其產(chǎn)羔初生重和斷奶時(shí)體重的影響[66]

飼喂期為孕期后兩個(gè)月至產(chǎn)后泌乳期60 d；精料補(bǔ)充料投料量為1.35 kg/(只·d)，苜蓿草自由采食；纖維素酶添加量為150 g/t 苜蓿草，與精料補(bǔ)充料混合使用。精料由大麥，豆粕和麥麩組成；羔羊60 d斷奶。Treatment started from the beginning of the third month of pregnancy through the first 60 days of lactation; Animals were fed a concentrate mixture at a level of 1.35 kg/(head·day) dry matter and alfalfa hay ad lib; A cellulase enzyme was offered at the level of 150 g enzyme/t of alfalfa hay consumed, and added to the concentrate mixture, which was composed of barley, soybean meal and wheat bran; The weaning date at 60 days old for lambs and kids.n為樣本量。n is sample size.

‘a(chǎn)，b’表示同行同種動(dòng)物不同處理間差異(P<0.05)，‘x，y’表示同行不同種動(dòng)物同處理間差異(P<0.05)。 Means with different letters (a, b) in the same line within the same species were different (P<0.05). Means with different letters (x, y) in the same line within the same treatment were different (P<0.05).

綜上所述，顯然外源酶在反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中的應(yīng)用是有效的，如對(duì)DM采食量，飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率，產(chǎn)奶量，增重，屠宰性能及瘤胃發(fā)酵特性會(huì)起到提高或改善作用。一般認(rèn)為，外源纖維降解酶是通過降解飼料中的纖維結(jié)構(gòu)，提高飼料纖維消化率和飼料轉(zhuǎn)化率，進(jìn)而提高動(dòng)物生產(chǎn)性能。還有認(rèn)為，酶制劑是通過提高飼料降解率進(jìn)而可能會(huì)促進(jìn)瘤胃內(nèi)的水解活性，并能降低腸道內(nèi)容物飽和度，從而提高動(dòng)物采食量和生產(chǎn)性能[40]。也有認(rèn)為，外源酶會(huì)通過促進(jìn)瘤胃內(nèi)纖維降解菌的繁殖，增加瘤胃內(nèi)微生物數(shù)量[67-68]，從而產(chǎn)生更多的酶來提高飼料中纖維的降解[12,57]和瘤胃微生物蛋白合成[32,43]。也有認(rèn)為，在反芻動(dòng)物飼糧中添加外源酶會(huì)促進(jìn)碳源轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性脂肪酸和微生物蛋白合成的流程，但有必要探明微生物蛋白合成的適宜條件[16]。但還有一些研究表明，添加外源酶對(duì)反芻動(dòng)物的飼喂效果沒有改善或不明顯，這反映出外源酶在反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中的應(yīng)用效果不穩(wěn)定且不一致。其主要原因歸為以下幾個(gè)方面：1)酶制劑作為活性物質(zhì)，對(duì)環(huán)境要求嚴(yán)格，容易失活，使用前應(yīng)檢測(cè)其活性；2)對(duì)作用條件的控制不夠嚴(yán)格，如環(huán)境、動(dòng)物、劑量、添加方式等諸多影響因素；3)由于人們對(duì)酶制劑產(chǎn)品本身特有的生化特性掌握不足，導(dǎo)致對(duì)其作用機(jī)理和作用條件優(yōu)化方面的了解不夠全面；4)目前市場(chǎng)上相關(guān)酶制劑產(chǎn)品種類甚多，但真正適用于反芻動(dòng)物實(shí)際生產(chǎn)中的優(yōu)質(zhì)酶制劑數(shù)量還很少，而且沒有統(tǒng)一的質(zhì)量評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，因此無法進(jìn)行系統(tǒng)地評(píng)價(jià)；5)由于其作用效果受很多因素的影響，在不同作用條件下，對(duì)其效果進(jìn)行直接對(duì)比是不合理、不科學(xué)的。由此可見，通過實(shí)際生產(chǎn)中廣泛的驗(yàn)證和評(píng)價(jià)，明確酶制劑產(chǎn)品的最佳作用條件，并研發(fā)出適應(yīng)性廣，效果穩(wěn)定性強(qiáng)的酶制劑產(chǎn)品至關(guān)重要，也是今后酶技術(shù)發(fā)展的必然趨勢(shì)。

5 影響外源酶制劑作用效果的重要因素

外源酶對(duì)肉牛、奶牛、育肥羊及泌乳羊的生產(chǎn)性能會(huì)產(chǎn)生有效的作用，但其效果不穩(wěn)定，這反映出人們對(duì)外源酶與瘤胃微生物、內(nèi)源酶間相互復(fù)雜的協(xié)同作用和瘤胃降解纖維優(yōu)化條件的了解還不夠深入，而不應(yīng)該誤認(rèn)為飼用酶制劑的應(yīng)用技術(shù)不適用于反芻動(dòng)物生產(chǎn)。影響外源酶制劑作用效果的因素很多，其中主要因素包括活性酶(包括種類及其活性)、專一性、添加水平、添加方式、動(dòng)物種類及生長(zhǎng)性能等。

5.1 活性酶

越來越多的研究結(jié)果證明，植物細(xì)胞壁降解酶能夠促進(jìn)瘤胃纖維消化[11,32,57,69]，效果取決于其活性酶[70]，但所使用酶制劑大多為復(fù)合酶，富含多種活性酶，導(dǎo)致關(guān)鍵活性酶難以被鑒定。關(guān)鍵活性酶的鑒定為設(shè)計(jì)反芻動(dòng)物更有效的飼用酶產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)。

Colombatto等[71]利用23種商業(yè)酶制劑評(píng)價(jià)了活性酶對(duì)飼草DM體外降解的影響。這些酶產(chǎn)品由17種活性酶的不同配比組成的復(fù)合酶，作用溫度和pH值接近于瘤胃實(shí)際條件(pH 6.0和39 ℃)，添加水平也類似于活體用量(1.5 μL/g DM)，分為對(duì)照或酶處理組進(jìn)行體外發(fā)酵，通過逐步回歸進(jìn)行分析。其中，5種酶制劑產(chǎn)品能夠顯著提高苜蓿草18 h DM降解(P<0.05)，9種酶制劑產(chǎn)品顯著提高玉米青貯飼料降解(P<0.05)。木聚糖酶與飼料降解呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與苜蓿降解的相關(guān)性較強(qiáng)，而其他活性酶與飼料降解之間沒有顯著相關(guān)性(P>0.05)。

Eun等[72]通過兩次體外發(fā)酵試驗(yàn)確定能夠降解苜蓿草和玉米青貯飼料的有效酶制劑產(chǎn)品及其適宜添加比例。試驗(yàn)一：使用了5種商業(yè)酶制劑主要由內(nèi)切葡聚糖酶、木聚糖酶和外切葡聚糖酶組成，主要區(qū)別在于內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶的比例不同，共設(shè)計(jì)3個(gè)添加比例(0.7、1.4、2.1 mg/g DM飼草)。結(jié)果表明，2種組合酶制劑能夠明顯提高苜蓿草和玉米青貯飼料24 h產(chǎn)氣量和降解率。適宜添加比例為1.4 mg/g，將苜蓿草和玉米青貯飼料的NDF降解率分別提高至20.6%和60.3%。雖然酶制劑產(chǎn)品與兩種飼草的NDF降解率均呈正相關(guān)，但木聚糖酶與NDF降解率之間沒有顯著相關(guān)性。為了進(jìn)一步確定木聚糖酶的作用效果，試驗(yàn)二：對(duì)試驗(yàn)一中產(chǎn)生的2種有效酶產(chǎn)品再次進(jìn)行了評(píng)價(jià)，設(shè)計(jì)4個(gè)處理組，分別為2種酶單獨(dú)添加組和各添加高活性木聚糖酶組。同樣，2種酶產(chǎn)品能夠提高產(chǎn)氣量和降解率，但與高活性木聚糖酶混合組沒有產(chǎn)生更有效作用。外源酶能夠有效提高飼草利用率，但其添加比例和活性酶組成是關(guān)鍵。

在動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)中也獲得了以上類似的結(jié)論。如Kung等[31]以苜蓿干草和玉米青貯(1∶9)為粗飼料(占50% TMR DM)，進(jìn)行了兩期奶牛飼喂試驗(yàn)，分別設(shè)計(jì)1個(gè)對(duì)照和2個(gè)加酶組，4種酶制劑由類似的纖維素酶和木聚糖酶組成，不同在于第一期試驗(yàn)使用了相同比例不同活性的酶，第二期試驗(yàn)中使用了不同比例類似活性的酶，在兩期試驗(yàn)結(jié)果中，分別只有一種酶制劑提高產(chǎn)奶量。表明，飼喂前直接噴灑一定劑量和適宜比例組成的活性酶會(huì)提高產(chǎn)奶量，但活性酶的組成及添加水平至關(guān)重要。

以上研究結(jié)果足以表明，對(duì)于反芻動(dòng)物粗飼料而言，活性酶組成中纖維素酶和木聚糖酶是必不可少的，而且應(yīng)具備適宜的比例，且只根據(jù)外源酶的生化特性很難預(yù)測(cè)它們?cè)诹鑫钢薪到庵参锛?xì)胞壁的潛能。酶制劑能否在反芻動(dòng)物胃腸消化道仍然發(fā)揮其功效，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

5.2 酶專一性

酶專一性指的是酶-底物特異性或酶-飼料特異性，是影響酶活性的決定因素之一[19]。酶專一性也可被解釋為“鑰匙理論”，即活性酶作用位點(diǎn)要與底物結(jié)構(gòu)相互吻合才能產(chǎn)生催化作用[69]。Colombatto等[73]分別添加25種商業(yè)酶制劑對(duì)苜蓿干草和青貯飼料底物體外降解的影響研究表明，苜蓿干草和青貯飼料18 h DM降解率居于前3位的酶產(chǎn)品依次分別為RT1201(23)、RT1184(12)、Promote N.E.T.(17)和Promote Dairy(未檢測(cè))、RT1183(10)、RT1187(14)，每個(gè)酶產(chǎn)品名稱后面括弧內(nèi)數(shù)字代表此酶在另一種底物DM降解率的排列次序，這表明同一種酶產(chǎn)品對(duì)不同底物的降解效率也有所不同，反之亦然。再?gòu)腄M、纖維降解速率和程度可知，對(duì)苜蓿草而言酶產(chǎn)品的發(fā)揮有效作用可能在于預(yù)處理階段，而對(duì)青貯飼料，酶的有效作用始于添加瘤胃液之后。這表明，酶的作用方式與發(fā)酵底物有關(guān)，也就是說酶-飼料特異性。同樣，Díaz等[74]以6個(gè)熱帶牧草樣品(4個(gè)禾本科和2個(gè)豆科)為發(fā)酵底物，評(píng)價(jià)了3種酶制劑(纖維素酶、木聚糖酶及它們的1∶1混合酶)對(duì)牧草體外NDF降解和瘤胃發(fā)酵功能的影響，纖維素酶能夠顯著降低禾本科牧草NDF含量(P<0.05)，混合酶顯著降低2種禾本科牧草NDF含量(P<0.05)，而木聚糖酶沒有影響(P>0.05)。另外，纖維素酶能夠促進(jìn)體外瘤胃發(fā)酵，但木聚糖酶不產(chǎn)生任何有效作用。

目前，還有研究認(rèn)為，在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中，飼糧營(yíng)養(yǎng)水平(蛋白水平和能量水平)也會(huì)對(duì)外源酶的作用效果產(chǎn)生一定的影響[75]。Cruywagen等[64]用相同液態(tài)纖維降解酶處理的兩種飼糧飼喂羔羊，在高、低粗飼料飼糧飼喂條件下，肉羊增重和飼料轉(zhuǎn)化率分別提高33%、23%和30%、19%，表明纖維降解酶在高粗飼料飼糧條件下更為有效。Arriola等[35]在奶牛高(48%)、低(33%)精料飼糧中添加復(fù)合酶(纖維素酶、木聚糖酶和酯酶的混合物)飼喂63 d，酶處理能夠提高奶牛營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率和產(chǎn)乳效率，在高精料飼糧水平下，提高NDF消化率8%和產(chǎn)奶量6.5%，分別高于低精料飼糧水平(NDF消化率6%和產(chǎn)奶量2%)。但低精料酶處理組產(chǎn)奶量類似于高精料對(duì)照組，從生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益考慮，酶制劑應(yīng)用于低精料飼糧更能降低成本。

酶-飼料特異性是目前制約反芻動(dòng)物新型飼用酶生產(chǎn)的主要因素之一，因?yàn)榇蠖鄶?shù)的反芻動(dòng)物飼糧都由各種各樣的粗飼料和精料組成。因此，通過多種酶源組合使用來達(dá)到最佳效果。但這種做法的缺點(diǎn)是適用于多數(shù)飼料，不能夠適合于全部飼料。因此，研發(fā)適用于各種類型飼料的酶產(chǎn)品是很必要的，雖然這對(duì)反芻動(dòng)物飼用酶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展帶來了很大的挑戰(zhàn)，但這也是未來發(fā)展的必要趨勢(shì)。

5.3 添加水平

一般酶制劑的添加水平影響其功效，而且很多體外法[71-73]和體內(nèi)法[48,50,58]研究表明，外源酶的添加水平與其作用效果呈非線性關(guān)系，然而Holtshausen等[41]和He等[49]研究報(bào)道，外源酶的添加水平與其作用效果呈線性關(guān)系，這可能是因?yàn)樗麄冎辉O(shè)計(jì)了兩種添加水平，而且劑量相差不大均為有效添加水平。添加量的不足往往引起效果不明顯，但添加量的過剩反而產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)，這可能是由于過多的酶制劑反而增加食糜濃度[76]，也有可能是過量的酶制劑阻止酶與底物的結(jié)合，從而降低了底物降解[77]，但其具體原因還尚未明確。Togtokhbayar等[78]提出了不同添加水平(0、0.5、1.0、1.5、2.0 μL/g 底物)木聚糖酶處理對(duì)小麥(Triticumaestivum)秸稈體外產(chǎn)氣和半體內(nèi)降解的影響。其中，中間添加量(1.0、1.5 μL/g)能夠顯著提高總產(chǎn)氣量、瘤胃發(fā)酵功能和降解率(P<0.05)。在實(shí)際生產(chǎn)研究中也出現(xiàn)了類似的結(jié)果，如Cruywagen等[63]對(duì)羔羊飼糧進(jìn)行梯度(0、1、5、10 mL/kg小麥秸稈)酶制劑添加處理結(jié)果表明，中間添加水平(5 mL/kg)增重和飼料轉(zhuǎn)化率(7.13 kg，16%)顯著高于對(duì)照組(5.41 kg，12%)和低添加水平(5.50 kg，13%)(P<0.05)，且比高添加組(6.75 kg，15%)在數(shù)量上占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)(P<0.10)。

由于酶制劑的高成本，選擇適宜的添加水平是非常必要的。添加量的不足或過量都會(huì)降低粗飼料利用率和動(dòng)物生產(chǎn)性能。一般情況下，在實(shí)際生產(chǎn)中酶制劑最佳劑量篩選步驟如下[69]：1)以已知或廠家推薦量為基礎(chǔ)(1倍)，評(píng)價(jià)不同劑量(0、0.5、1.0、2.0、3.0倍)對(duì)NDF消化率的影響；2)應(yīng)設(shè)計(jì)多個(gè)對(duì)照組進(jìn)行效率評(píng)價(jià)，如果出現(xiàn)非線性效果時(shí)要采用平均分離法篩選最佳劑量；3)選擇作用效果較好的最低劑量，并且其效果要顯著高于低劑量效果(P<0.05)，也不能顯著低于高劑量(P<0.05)；4)確保所篩選劑量的經(jīng)濟(jì)效益。

5.4 添加方式

目前，酶制劑的添加方式有很多種，如添加對(duì)象為TMR[3,6,40]、干草[31-32,63]、精料補(bǔ)充料[6,44,79]、青貯飼料[41,50,80]、補(bǔ)飼料[34]、預(yù)混料[34]、瘤胃灌注[38,51]等；添加時(shí)間為體外發(fā)酵前后[74,81]、活體飼喂前后[51]；添加形態(tài)為液態(tài)與固態(tài)酶[64]；飼草水分處理為鮮草、萎蔫、飼喂前或干草[11,13]；作用時(shí)間[82]等，但其作用效果不盡一致。在大多情況下，無論是液態(tài)酶還是固體粉狀酶都經(jīng)過清水稀釋一定倍數(shù)后使用，以便充分混勻。酶與飼料間的密切性能夠促進(jìn)酶對(duì)植物纖維的攻擊和酶與飼料的結(jié)合，從而提高酶在瘤胃中被蛋白水解的抗性[19]。

通常認(rèn)為，外源酶對(duì)高水分飼料(如青貯飼料)的作用更為有效，因?yàn)樗兄诿傅膫鞑?，同時(shí)它也是纖維聚合物水解為可溶性糖時(shí)必不可少的基質(zhì)。另外，青貯飼料pH值通常很接近大多數(shù)真菌酶的最適宜pH條件。如Krueger等[13]通過分別在狗牙根(Cynodondactylon)鮮草(刈割0 h后)、萎蔫草(刈割后72 h打捆前)、干草(飼喂前0 h)時(shí)進(jìn)行酶處理研究表明，酶制劑處理能夠提高肉牛飼糧DM、NDF、CP消化率，其中，鮮草處理組效果最佳，其次是萎蔫草。但也有研究表明，在相同酶處理?xiàng)l件下，苜蓿干草的體外營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)降解率顯著提高(P<0.01)，而苜蓿青貯和大麥青貯沒有顯著差異[41]。這也有可能是由于青貯飼料中的抑菌化合物引起的降低酶功效所致，發(fā)酵飼料中β-1,4-木聚糖酶的活性降低50%，但對(duì)纖維素酶沒有影響[68]。酶制劑溶液在干草中的應(yīng)用效果好于青貯牧草。Feng等[11]認(rèn)為，將酶制劑溶液直接噴灑于干草表面能夠提高DM和纖維降解率，而對(duì)鮮草或萎蔫草沒有影響，并表示酶處理干草表面更適合于瘤胃微生物的定植。

Thakur等[83]在體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵前24 h酶制劑處理能夠有效提高飼糧DM、NDF體外降解率，其中精料加酶組效果最佳，其次是TMR加酶組和粗飼料加酶組。同樣，Díaz等[74]也報(bào)道，發(fā)酵前24 h酶制劑預(yù)處理能夠提高體外產(chǎn)氣率。在體外發(fā)酵是個(gè)封閉系統(tǒng),其中不存在過瘤胃現(xiàn)象，因此通過體外法預(yù)測(cè)酶降解效果可能不能準(zhǔn)確放映酶的不同添加方式對(duì)動(dòng)物活體所產(chǎn)生的影響。

從活體研究可知，Bowman等[34]在奶牛飼糧的不同成分(精料45%、補(bǔ)飼料4%、預(yù)混料0.2%占TMR)中添加木聚糖酶和纖維素酶復(fù)合酶進(jìn)行飼喂研究，與對(duì)照相比，精料加酶組OM、NDF和ADF消化率顯著提高(P<0.05)，而其他兩加酶組只有數(shù)量上的提高(P<0.10)。這可能是由于在飼糧相對(duì)大范圍內(nèi)添加酶制劑能夠提高飼料在瘤胃內(nèi)停留時(shí)間，而在飼糧小范圍內(nèi)添加酶制劑加快了過瘤胃速度，以致減弱了酶制劑在瘤胃中的作用效果[8]。Sutton等[38]在泌乳早期奶牛TMR、精料和瘤胃中添加或灌注酶制劑研究表明，酶處理對(duì)瘤胃降解沒有影響，但提高腸道DM、OM、淀粉消化率，但對(duì)NDF消化率沒有影響。表明通過纖維水解程度的變化，可判斷出酶制劑在瘤胃內(nèi)的保留時(shí)間降低的趨勢(shì)，這至少在一定程度上解釋酶處理所產(chǎn)生的效果。

5.5 動(dòng)物生產(chǎn)性能

動(dòng)物生產(chǎn)性能包含了兩層意義：不同種動(dòng)物生產(chǎn)性能和同種動(dòng)物不同生長(zhǎng)階段的生產(chǎn)性能。一般來講，在反芻動(dòng)物實(shí)際生產(chǎn)中，當(dāng)飼糧纖維消化被限制或能量成為首要限制營(yíng)養(yǎng)因素時(shí)飼用酶制劑的應(yīng)用能夠產(chǎn)生有效作用[19]。在高產(chǎn)奶牛和肉牛生產(chǎn)中，需要高水平可利用能量來滿足產(chǎn)奶和產(chǎn)肉需要。一般高產(chǎn)奶牛的采食量要比維持量高出4倍。在這種飼喂條件下，使瘤胃pH值降低，且加快了飼料過瘤胃時(shí)間，從而降低了飼料纖維成分的消化降解。因此，飼料實(shí)際消化率往往低于可消化率，而外源酶的添加能夠有效補(bǔ)充此差值。Yang等[6]研究同一種酶對(duì)奶牛和肉羊飼喂效果時(shí)也得出類似的結(jié)論，肉羊?qū)φ战M飼糧DM和ADF消化率分別為77.1%和49.8%，而相對(duì)高采食量的奶牛對(duì)照組飼糧DM和ADF消化率分別為63.9%和31.8%，添加酶制劑能夠提高奶牛營(yíng)養(yǎng)消化率，但對(duì)肉羊沒有影響。這表明當(dāng)飼糧實(shí)際消化率沒有達(dá)到可消化率時(shí)添加酶制劑會(huì)提高消化率，即填補(bǔ)了相應(yīng)缺少的消化能。同樣，酶制劑(ZADO)在奶牛[40]、肉牛[3]和肉羊[5]生產(chǎn)中的應(yīng)用表明，肉羊飼糧DM消化率(73%)明顯高于奶牛(66%)和肉牛(61%)，ZADO能夠分別顯著提高奶牛產(chǎn)奶量22.7%和ADF消化率32.7%，肉牛增重16%和ADF消化率32.2%，肉羊增重10%和ADF消化率16.5%(P<0.05)。同時(shí)表明，肉羊的消化能力高于奶牛和肉牛。從目前研究結(jié)果來看，飼用酶制劑在奶牛中的應(yīng)用較肉牛和肉羊更為普遍且其效果也相對(duì)穩(wěn)定，這不僅與酶制劑本身生化特性有關(guān)，也與不同種動(dòng)物生理特性緊密相關(guān)。

現(xiàn)有酶技術(shù)在反芻動(dòng)物飼喂維持水平下的應(yīng)用是不太受益，相反，在高生產(chǎn)力水平下使用會(huì)具有較高的效益。如Zheng等[84]研究發(fā)現(xiàn)，添加酶制劑能夠提高奶牛產(chǎn)奶量和改善乳成分，從添加時(shí)間來看，產(chǎn)后添加比產(chǎn)前4周添加更為有效，每天能夠多產(chǎn)2.6 kg牛奶。Peters等[85]研究泌乳早期和中期奶牛酶飼喂效果認(rèn)為，添加酶對(duì)泌乳早期和中期沒有顯著影響，但對(duì)泌乳中期奶牛產(chǎn)奶量有數(shù)值的提高。同樣，也有研究表明，外源酶對(duì)泌乳早期奶牛作用效果高于泌乳后期[86]。

綜上所述，在反芻動(dòng)物消化系統(tǒng)中，飼用酶制劑的作用過程非常復(fù)雜，并且其作用效果受很多因素的影響。通常情況下，對(duì)于反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中飼用酶制劑的應(yīng)用來說：1)是針對(duì)粗飼料而言，其活性成分中纖維素酶和木聚糖酶是必不可少的，至于其添加劑量和其他酶成分需考慮酶制劑本身酶活性和其作用底物(粗飼料)的組成；2)在青貯飼料中應(yīng)用效果要好于干草，因?yàn)樗兄诿傅膫鞑?，同時(shí)它也是纖維聚合物水解為可溶性糖時(shí)必不可少的基質(zhì)；3)將酶制劑溶液直接噴灑于干草表面的應(yīng)用效果要好于鮮草或萎蔫草，因?yàn)楦刹荼砻娓m合于瘤胃微生物的定植；4)與精料、補(bǔ)飼料和預(yù)混料相比，添加于TMR或粗飼料中的作用效果會(huì)更好，這可能是由于酶制劑和作用底物的結(jié)合面積得到提高，并延長(zhǎng)了飼料過瘤胃時(shí)間，進(jìn)而提高了酶制劑在瘤胃中的作用效果；5)在奶牛和肉牛中的應(yīng)用效果要好于肉羊，因?yàn)槿庋蝻暳舷矢哂谀膛：腿馀?，也就是說，在肉羊消化系統(tǒng)中飼料潛在可消化率要低于奶牛和肉牛，通過添加外源酶可降解飼料中潛在的可消化部分，進(jìn)而提高飼料消化率，填補(bǔ)了相應(yīng)缺少的消化能；6)在高生產(chǎn)力水平下的應(yīng)用效果要好于維持水平。

6 存在的問題與未來展望

雖然酶技術(shù)在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用已取得了一定進(jìn)展，但在目前飼用酶制劑的推廣應(yīng)用中仍存在很多問題：

1)穩(wěn)定性差：酶制劑作為活性物質(zhì)，對(duì)環(huán)境條件(溫度、濕度及pH值)敏感，容易失活，且其最佳作用條件往往與實(shí)際應(yīng)用條件相差甚遠(yuǎn)，導(dǎo)致其效果不穩(wěn)定，可預(yù)測(cè)性差；

2)成本高：從生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效益考慮，酶的高成本抵消了其在生產(chǎn)上的功效。由于酶制劑產(chǎn)品的高成本(相對(duì)于離子載體、抗生素和灌注)，限制了酶制劑在肉牛生產(chǎn)中的應(yīng)用；

3)作用機(jī)制尚未明確：動(dòng)物采食前后，外源酶對(duì)飼料的作用方式不夠了解，如外源酶與瘤胃微生物及內(nèi)源酶之間的協(xié)同作用，酶的最佳添加水平、時(shí)間及方式等。關(guān)于這些國(guó)內(nèi)外研究很多，但根據(jù)酶產(chǎn)品、作用動(dòng)物種類及生長(zhǎng)階段的不同所得出結(jié)論也不一致，具體原因不明確；

4)酶活標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)方法沒有統(tǒng)一：目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于酶質(zhì)量及其活性檢測(cè)方法沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范。因此，對(duì)現(xiàn)有的商業(yè)酶產(chǎn)品很難準(zhǔn)確判斷其優(yōu)劣等級(jí)。

5)缺乏針對(duì)性：酶與飼料的特異性；不同種動(dòng)物間其胃腸消化道生理特性及飼糧成分均存在很大差異。目前市場(chǎng)上的酶產(chǎn)品種類很多，但針對(duì)不同生產(chǎn)條件(不同動(dòng)物、不同生產(chǎn)階段)卻沒有明確的專用酶產(chǎn)品。

隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，未來飼用酶產(chǎn)業(yè)發(fā)展前景越來越廣，但同時(shí)也帶來了巨大的挑戰(zhàn)性。新型酶制劑產(chǎn)品應(yīng)朝著高效，低成本，無害的方向發(fā)展。其中，高效包含了高活性、高穩(wěn)定性和高針對(duì)性，但前提是必須明確其在體內(nèi)作用機(jī)制，才能使其發(fā)揮最大化效果。通過利用基因組學(xué)技術(shù)可選育高活性菌株，既能克服普通菌株產(chǎn)酶量低的問題，也能提高產(chǎn)酶活性，同時(shí)也大大降低了生產(chǎn)成本。也就是說，結(jié)合微生物學(xué)、生態(tài)學(xué)和基因組學(xué)等方面的研究，達(dá)到可預(yù)測(cè)酶產(chǎn)品在動(dòng)物生產(chǎn)中應(yīng)用效果的目的。

7 小結(jié)

隨著人們對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)中激素和抗生素應(yīng)用問題的關(guān)注，飼用酶制劑作為綠色、有效飼料添加劑，毫無疑問，在未來發(fā)展中酶技術(shù)將發(fā)揮越來越重要的作用。雖然，飼用酶制劑在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用是可取有效的，但成本高、效果不穩(wěn)定，受很多條件因素的影響。因此，研發(fā)低成本、適用于各種反芻動(dòng)物生產(chǎn)系統(tǒng)的高效新型酶制劑產(chǎn)品是非常必要的，這將會(huì)是保證飼料酶技術(shù)在養(yǎng)殖生產(chǎn)中有效利用的最佳途徑。

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Application of exogenous enzymes in ruminant nutrition

WANG Hong-Mei1, TU Yan1, ZHANG Nai-Feng1, SI Bing-Wen1, MA Tao1, SA Ru-La2, NA Ya3,DIAO Qi-Yu1*

1.FeedResearchInstitute,KeyLaboratoryofFeedBiotechnology,theMinistryofAgricultureofthePeople’sRepublicofChina,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China; 2.GrasslandResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Hohhot010010,China; 3.CollegeofEcologyandEnvironmentalScience,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Hohhot010011,China

Digestion of cell wall fractions of fiber in the rumen is incomplete due to its resistance to microbial degradation. The ability to effectively utilise forage with high fiber content is important for the development of efficient animal husbandry systems. Exogenous enzymes able to modify forages before feeding are of considerable interest to researchers; important potential benefits include improved environmental outcomes.Insituassessment andinvitrogas production were used to evaluate rumen degradation characteristics andinvitrofermentation characteristics of forage. Aninvivostudy was used to evaluate the effects of exogenous enzyme application to ruminant forage. Recent studies have shown that adding exogenous enzymes to ruminant diets can increase animal production as a result of enhanced digestion of feed, although results have been inconsistent. This inconsistency is due to range of factors including enzyme properties, diet composition, enzyme addition rates, animal species and animal growth performance. One of the main problems for researchers is the lack of adequate biochemical characterization of different enzymes which leads to a poor understanding of their mode of action and effectiveness. The biochemical characteristics of enzymes are very important but enzymes are not always evaluated prior to use and there are no global standards for assessing the activity and quality of enzymes. This paper reviews the research on the development of exogenous fibrolytic enzyme use in animal production, mechanisms of activity on plant cell walls, animal responses, the factors influencing the use of exogenous enzymes in ruminant nutrition and problems associated with their use. The aim of the review is to help the development of improved, safer and more consistent enzyme additives for use in ruminant nutrition.

exogenous fibrolytic enzymes; mechanism; fiber digestion; ruminant; application

2016-06-27；改回日期：2016-10-19

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(20120304202)和內(nèi)蒙古自治區(qū)科技重大專項(xiàng)資助。

王紅梅(1983-)，女，蒙古族，內(nèi)蒙古通遼人，助理研究員，博士。E-mail: chasu927@163.com*通信作者Corresponding author. E-mail: diaoqiyu@caas.cn

10.11686/cyxb2016262 http://cyxb.lzu.edu.cn

王紅梅, 屠焰, 張乃鋒, 司丙文, 馬濤, 薩茹拉, 那亞, 刁其玉. 飼用酶制劑在反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中的應(yīng)用進(jìn)展. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 26(3): 199-213.

WANG Hong-Mei, TU Yan, ZHANG Nai-Feng, SI Bing-Wen, MA Tao, SA Ru-La, NA Ya, DIAO Qi-Yu. Application of exogenous enzymes in ruminant nutrition. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(3): 199-213.