王 瑩，趙 倩，莊曉青，李 娟

·論 著·

131I-Herceptin對高表達(dá)HER-2/neu肺癌細(xì)胞增殖的影響

王 瑩，趙 倩，莊曉青，李 娟

目的 探討131I-Herceptin對高表達(dá)HER-2/neu肺癌細(xì)胞增殖的影響。方法 應(yīng)用Iodogen法制備131I-Herceptin，用TLC測定標(biāo)記率及放化純。實驗設(shè)131I-Herceptin組、Herceptin組、131I組和生理鹽水對照組。根據(jù)藥物濃度及131I 的放射性活度分為三組：低劑量組：5 kBq131I-Herceptin、5 μg/μl Herceptin、5 kBq131I和生理鹽水；中劑量組：10 kBq131I-Herceptin、10 μg/μl Herceptin、10 kBq131I和生理鹽水；高劑量組：20 kBq131I-Herceptin、20 μg/μl Herceptin、20 kBq131I和生理鹽水。MTT法檢測各組對人肺腺癌Calu-3細(xì)胞的生長抑制作用。結(jié)果131I-Herceptin的標(biāo)記率為(78.3±3.2)%，分離純化后放化純?yōu)?93.8±3.4)%。131I-Herceptin對人肺腺癌Calu-3細(xì)胞的免疫結(jié)合率為(61.8±2.8)%。5、10、20 kBq131I-Herceptin人肺腺癌Calu-3細(xì)胞抑制率，分別為(36.7±2.5)%、(40.3±3.2)%、(43.6±3.5)%；質(zhì)量濃度為5 μg/μl、10 μg/μl、20 μg/μl的未標(biāo)記Herceptin抑制率，分別為(28.3±3.0)%、(30.5±2.6)%、(32.4±2.4)%；5、10、20 kBq131I抑制率，分別為(8.3±1.8)%、(9.8±1.0)%、(11.2±2.3)%；生理鹽水對照組自然凋亡率為(3.5±0.6)%。131I-Herceptin、Herceptin、131I不同濃度間的細(xì)胞抑制率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。131I-Herceptin高劑量組的細(xì)胞抑制率高于低劑量組、中劑量組(P<0.05)。高劑量組：131I-Herceptin組的細(xì)胞抑制率最高，與Herceptin組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與131I組、對照組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論131I-Herceptin能與人肺腺癌Calu-3細(xì)胞特異性結(jié)合，并對人肺腺癌Calu-3細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用。

肺癌；131I-Herceptin；HER-2/neu；抑制率

肺癌的發(fā)病率和死亡率迅速上升，其中約80%是非小細(xì)胞肺癌[1]。近年來有文獻(xiàn)報道，非小細(xì)胞肺癌存在HER-2/neu的過量表達(dá)[2]。曲妥株單抗(Herceptin)是一種針對癌基因HER-2/neu的表達(dá)蛋白p185設(shè)計的人化鼠嵌合型抗體[3]。131I標(biāo)記的Herceptin對HER2/neu的表達(dá)有一定的抑制作用，在對乳腺癌及卵巢癌等細(xì)胞增殖影響[4-5]的研究中得以證實，但是131I-Herceptin對高表達(dá)HER2/neu肺癌細(xì)胞增殖影響的研究卻很少見。本研究旨在觀察131I-Herceptin對高表達(dá)HER-2/neu的人肺腺癌Calu-3細(xì)胞增殖能力的影響，為肺癌放射免疫治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般材料：人肺腺癌Calu-3細(xì)胞、人肺腺癌A549細(xì)胞購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫。Herceptin、四甲基偶氮唑藍(lán)液(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)均購于Sigma公司。無載體Na131I放射性濃度為555 MBq/mL，為北京原子高科股份有限公司產(chǎn)品。HERA cell 150 CO2培養(yǎng)箱為美國THERMO公司產(chǎn)品。SN-697型γ放射免疫計數(shù)器購于上海核所日環(huán)光電儀器有限公司。BIOSCAN TLC薄層放射性掃描儀購自于美國BIOSCAN公司。

1.2 方法

1.2.1131I-Herceptin的制備[6]：應(yīng)用Iodogen法進(jìn)行131I-Herceptin標(biāo)記。取50 μl Herceptin (20 mg/mL)置于提前制備好的Iodogen涂管中，并將涂管置于冰上。依次加入100 μl PBS(0.01 mol/L)、100 μl Na131I (555 MBq/mL)混勻，震蕩反應(yīng)30 min。吸出反應(yīng)液來終止反應(yīng)，并應(yīng)用TLC測定標(biāo)記率。采用Sephadex G50柱凝膠過濾法對131I-Herceptin分離純化，再用TLC測定標(biāo)記率及放化純。

1.2.2131I-Herceptin與人肺腺癌Calu-3細(xì)胞的免疫結(jié)合率測定：將培養(yǎng)好的人肺腺癌Calu-3細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，取適量置于微量離心管中，1×105個細(xì)胞/管，加入20 kBq131I-Herceptin，混勻后，在溫度為37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，測定總放射性計數(shù)T。然后進(jìn)行離心，以1 000 r/min離心5 min，用磷酸鹽緩沖液沖洗3遍，測定沉淀細(xì)胞的放射性計數(shù)B。免疫結(jié)合率=B/T×100%，重復(fù)測定4次。對照組為人肺腺癌A549細(xì)胞，方法同上。

1.2.3 人肺腺癌Calu-3細(xì)胞抑制率的檢測[5]：采用MTT法。取上述細(xì)胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱中24 h，次日取出。實驗分為4組，每組設(shè)3個復(fù)孔，131I-Herceptin組，分別加入5、10、20 kBq的131I-Herceptin；Herceptin組，分別加入質(zhì)量濃度5 μg/μl、10 μg/μl、20 μg/μl的Herceptin 100 μl；131I組，分別加入5、10、20 kBq的131I；另設(shè)置空白對照組，加入0.9%生理鹽水100 μl。將5 kBq131I-Herceptin、5 μg/μl Herceptin、5 kBq131I歸為低劑量組；10 kBq131I-Herceptin、10 μg/μl Herceptin、10 kBq131I歸為中劑量組；20 kBq131I-Herceptin、20 μg/μl Herceptin、20 kBq131I歸為高劑量組。將以上各亞組分別再次放置于培養(yǎng)箱中，48 h后取出，再加入20 μl /孔MTT培養(yǎng)4 h，吸棄上清液，加入DMSO 150 μl/孔，避光充分振蕩10 min后，采用酶標(biāo)儀在波長490 nm處檢測各組的吸光度(A)值。重復(fù)上述實驗3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法：資料使用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件，計量資料用±s表示，多組間參數(shù)采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1131I-Herceptin的標(biāo)記率、放射化學(xué)純度：131I-Herceptin的標(biāo)記率為(78.3±3.2)%。經(jīng)過Sephadex G50柱分離純化后，測得131I-Herceptin放化純?yōu)?93.8±3.4)%。

2.2131I-Herceptin免疫結(jié)合率：131I-Herceptin對人肺腺癌Calu-3細(xì)胞的免疫結(jié)合率為(61.8±2.8)%；131I-Herceptin對人肺腺癌A549細(xì)胞的免疫結(jié)合率為(8.9±1.2)%。

2.3 對人肺腺癌Calu-3細(xì)胞抑制作用的比較：MTT法具體檢測結(jié)果，隨著藥物濃度和131I放射性活度的增加，細(xì)胞抑制率也逐漸增加。131I-Herceptin、Herceptin、131I不同濃度間的細(xì)胞抑制率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=65.84、92.68、73.56，P<0.05)。131I-Herceptin高劑量組的細(xì)胞抑制率高于低、中劑量組(t=8.20、6.70，P<0.05)。高劑量組：131I-Herceptin組的細(xì)胞抑制率最高，與Herceptin組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.29，P<0.05)；與131I組、對照組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.65、21.16，P<0.05)，見表1。

表1 不同藥物及濃度對人肺腺癌Calu-3細(xì)胞抑制率的比較(%，±s)

表1 不同藥物及濃度對人肺腺癌Calu-3細(xì)胞抑制率的比較(%，±s)

組別n131I-Herceptin組Herceptin組131I組對照組低劑量組336．7±2．528．3±3．08．3±1．83．5±0．6中劑量組340．3±3．230．5±2．69．8±1．03．5±0．6高劑量組343．6±3．532．4±2．411．2±2．33．5±0．6F值65．8492．6873．56P值<0．05<0．05<0．05

3 討論

目前肺癌的治療方法仍以手術(shù)、化療和放療為主，但其總體治療效果卻并不理想。近年來，分子靶向治療成為腫瘤治療的熱點，而放射免疫治療則是在分子靶向治療基礎(chǔ)上發(fā)展起來的又一新型腫瘤治療模式。Herceptin主要適用于HER-2/neu過度表達(dá)的乳腺癌患者，并且已證實131I標(biāo)記的Herceptin對高表達(dá)HER-2/neu的乳腺癌、胃癌及卵巢癌均有較好的效果，其效果優(yōu)于未標(biāo)記的Herceptin[4-5,7]。

鱗癌、腺癌和大細(xì)胞癌均存在HER-2/neu蛋白的過量表達(dá)。有文獻(xiàn)報道，人肺腺癌Calu-3細(xì)胞存在HER2/neu的過度表達(dá)，與乳腺癌SKBr3細(xì)胞相似，而人肺腺癌A549細(xì)胞HER2/neu表達(dá)較弱[8]。故本研究中選用人肺腺癌Calu-3細(xì)胞，重點分析131I-Herceptin對高表達(dá)HER2/neu的人肺腺癌Calu-3細(xì)胞增殖的影響。

131I標(biāo)記蛋白質(zhì)的技術(shù)比較成熟，成功標(biāo)記后在體外能夠取得較好的穩(wěn)定性。有文獻(xiàn)證實，經(jīng)131I標(biāo)記后，Herceptin的免疫反應(yīng)活性未發(fā)生明顯變化[5]。本研究中，采用Iodogen法將放射性核素131I標(biāo)記于Herceptin上，能獲得較穩(wěn)定的標(biāo)記率(78.3±3.2)%，分離純化后能夠應(yīng)用于腫瘤的顯像和治療。本研究中成功標(biāo)記131I-Herceptin后，進(jìn)行了與人肺腺癌Calu-3細(xì)胞結(jié)合能力的檢測，結(jié)果顯示，其免疫結(jié)合率為(61.8±2.8)%；而對于低表達(dá)HER-2/neu的人肺腺癌A549細(xì)胞，其免疫結(jié)合率只有(8.9±1.2)%，說明人肺腺癌Calu-3細(xì)胞對131I-Herceptin的攝取良好。結(jié)果與張龍杰等[6]的研究報道相似。

本研究用MTT法對人肺腺癌Calu-3細(xì)胞抑制率進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，131I-Herceptin高劑量組的細(xì)胞抑制率高于低劑量組、中劑量組(P<0.05)；高劑量組中131I-Herceptin的細(xì)胞抑制率最高，與Herceptin組、131I組、對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。131I-Herceptin和Herceptin都對人肺腺癌Calu-3細(xì)胞的增殖有一定抑制作用，主要是基于Herceptin的分子靶向治療機(jī)制，但是131I-Herceptin的細(xì)胞抑制作用明顯高于Herceptin，且細(xì)胞抑制率隨著靶向藥物的濃度及放射性活度的增加而增高；分析結(jié)果可能為131I衰變產(chǎn)生的β射線會對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生輻射生物效應(yīng)，而Herceptin能選擇性地作用于人表皮生長因子受體-2(HER2)的細(xì)胞外部位，發(fā)揮放射性免疫治療效果，將131I核素標(biāo)記于Herceptin，131I會伴隨Herceptin濃聚于腫瘤組織并殺傷腫瘤細(xì)胞，將131I核素的輻射生物效應(yīng)與Herceptin的放射性免疫治療相結(jié)合，可達(dá)到增益治療的效果。而單純131I組由于無Herceptin分子靶向作用的引領(lǐng)，其輻射生物效應(yīng)也未能達(dá)到預(yù)期的效果。

綜上所述，131I-Herceptin能與人肺腺癌Calu-3細(xì)胞特異性結(jié)合，對其細(xì)胞增殖有一定抑制作用，為后期的動物實驗與臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

[1] 李貴平，黃寶丹，杜麗，等.新型肺癌小分子多膚的131I標(biāo)記及其在小鼠體內(nèi)的生物分布[J].同位素，2014，27(2)：104-108.

[2] Cheurle D，Jahanzeb M，Aronsohn RS，et al.HER-2/neuexpression in archival non-small cell lung carcinomas using FDA-approved Hercep test[J].Anticancer Research，2000，20(3B):2091-2096.

[3] Martin Castillo B，Oliveras Ferraros CA，Cufi S，et al.Basal/HER2 breast carcinomas integrating molecular taxonomy with cancer stem cell dynamics to predict primary resistance to trastuzumab (Herceptin)[J].Cell Cycle，2013，12(2):225-245.

[4] 楊志學(xué)，危少華，蔣國勤，等.131I-Herceptin在乳腺癌裸鼠模型中的顯像及體內(nèi)分布研究[J].中華普通外科雜志，2012，27(5)：402-405.

[5] 董瀟，胡建銘，石怡珍.131I標(biāo)記曲妥珠單抗對高表達(dá)HER-2 /neu人卵巢癌的體內(nèi)外實驗研究[J].腫瘤，2010，30(5)：363-369.

[6] 張龍杰，袁勝利，韓真真，等.131I-Herceptin對HER2過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞Bcl-xL表達(dá)的影響[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015，15(22)：4248-4251.

[7] 韓真真，袁勝利，丁明翠，等.曲妥珠單抗對HER2高表達(dá)胃癌細(xì)胞珠抑制作用觀察[J].中華腫瘤防治雜志，2013，20(8)：593-595.

[8] 任新玲，錢桂生，鮑煒，等.針對HER2/neu的siRNA對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長的抑制作用[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2006，27(9)：828-831.

Inhibitory effects of 131I-Herceptin on overexpressedHER-2/neu overexpressed in lung cancer cell

WANGYing,ZHAOQian,ZHUANGXiaoqing,LIJuan.

DepartmentofNuclearMedicine,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China

Objective To explore the inhibitory effects of131I-Herceptin on overexpressed HER-2/neu overexpressed in lung cancer cell.Methods Herceptin was labeled with131I using the Iodogen method.The radiolabeling efficiency and radiochemical purity were characterized by TLC in vitro.There were four groups including131I-Herceptin,Herceptin,131I and 0.9% sodium chloride solution group.It was divided into three groups according to the drug concentration and131I radioactive activity.5kBq131I-Herceptin,5μg/μl Herceptin,5kBq131I and physiological saline was classified as low dose group.10kBq131I-Herceptin,10μg/μl Herceptin,10kBq131I and physiological saline was classified as medium dose group.20kBq131I-Herceptin,20μg/μl Herceptin,20kBq131I and physiological saline was classified as high dose group.The inhibitory effects of different treatments on the proliferation of human lung adenocarcinoma cell line Calu-3 were measured by MTT assay.Results The labeled rate of131I-Herceptin was (78.3±3.2)%.The radiochemical purity of131I-Herceptin was (93.8±3.4)% after purification.The immune combination rate of131I-Herceptin was (61.8±2.8)% for lung adenocarcinoma cell line Calu-3.Cell inhibition rates of 5,10,20kBq131I-Herceptin to human lung adenocarcinoma Calu-3 were (36.7±2.5)%，(40.3±3.2)%，(43.6±3.5)% respectively.Cell inhibition rates of 5,10,20μg/μl Herceptin were (28.3±3.0)%,(30.5±2.6)%,(32.4±2.4)% respectively.Cell inhibition rates of 5,10,20kBq131I were (8.3±1.8)%,(9.8±1.0)%,(11.2±2.3)% respectively.Natural apoptosis rate of physiological saline was (3.5±0.6)%.The cell inhibition rate between different concentrations of131I-Herceptin,Herceptin,131I haved significant difference (P<0.05).Cell inhibition rate of high dose group of131I -Herceptin was higher than low and medium dose group(P<0.05).Cell inhibition rate of131I-Herceptin group was the highest in high dose group.It was statistically significant between131I-Herceptin and Herceptin (P<0.05).It was obviously statistically significant among131I-Herceptin,131I and physiological saline (P<0.05).Conclusion131I-Herceptin can bind to human lung adenocarcinoma Calu-3 with highly affinity and has significant inhibitory effect on the lung cancer cell line.

Lungcancer;131I-Herceptin;HER-2/neu;Inhibitionrate

10.13621/j.1001-5949.2017.02.0107

寧夏醫(yī)科大學(xué)校級項目(XM201461)

寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，寧夏 銀川 750004

王瑩(1983-)，女，河北籍，碩士研究生，主治醫(yī)師，主要從事臨床核醫(yī)學(xué)診斷及治療。

http://www.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170215.1139.006.html

R734.2

A

2016-04-26 [責(zé)任編輯]馬興忠