程秀麗，張志紅，劉風(fēng)英，馬云亭，華 冰，周翔魚

·論 著·

一種新型融合免疫球蛋白-mGE對(duì)慢性小鼠EAE治療作用的分析評(píng)估

程秀麗，張志紅，劉風(fēng)英，馬云亭，華 冰，周翔魚

目的 利用一種新型融合免疫球蛋白-mGE對(duì)實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)進(jìn)行治療并評(píng)估療效，以期能夠?yàn)閱为?dú)或聯(lián)合其他藥物治療此病提供新的思路和方法。方法 MOG35-55肽段誘導(dǎo)C57BL/6小鼠制作慢性非緩解型EAE模型成功后，隨機(jī)抽取部分模型小鼠，利用一種新型IgG-IGE的Fc段融合免疫球蛋白進(jìn)行治療，觀察臨床體征及組織病理變化情況，同時(shí)檢測一些重要的免疫相關(guān)指標(biāo)并加以比對(duì)分析。結(jié)果 mGE可以通過降低抗原提呈細(xì)胞(APC)的主要組織相容性復(fù)合物(MHC)類分子，上調(diào)抑制性Fc受體CD32的表達(dá)從而阻斷APC抗原提呈及淋巴細(xì)胞激活，明顯緩解慢性EAE的神經(jīng)功能損害癥狀。結(jié)論 mGE可以通過減少APC抗原提呈而緩解慢性EAE的神經(jīng)功能損傷癥狀。mGE治療慢性非緩解型EAE的作用確切，可作為單獨(dú)或聯(lián)合其他藥物治療EAE的備選方法之一。

實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎；抗原提呈細(xì)胞；主要組織相容性復(fù)合物；髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白；融合免疫球蛋白

多發(fā)性硬化(MS)是一類臨床表現(xiàn)和病理改變復(fù)雜多樣，病程及預(yù)后千差萬別，至今仍無法治愈的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。目前治療的一線藥物為糖皮質(zhì)激素、β干擾素(IFN-β)等，糖皮質(zhì)激素由于諸多毒副作用和反彈現(xiàn)象使治療效果不佳，IFN-β則因價(jià)格昂貴限制其廣泛使用。近年來的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究都顯示，B淋巴細(xì)胞可能參與MS/EAE發(fā)生和發(fā)展的諸多環(huán)節(jié)。多個(gè)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)[2-4]應(yīng)用這種融合免疫球蛋白能夠使CD32b和FcεRI發(fā)生聚集，激活FcεRI相關(guān)Lyn的抑制信號(hào)，從而導(dǎo)致CD32b的ITIM的酪氨酸迅速磷酸化而抑制肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的脫顆粒反應(yīng)及B細(xì)胞分泌抗體向IgE的類別轉(zhuǎn)換。這些實(shí)驗(yàn)同時(shí)也證實(shí)mGE是一種具有劑量依賴效應(yīng)，無明顯不良反應(yīng)的融合免疫球蛋白。本實(shí)驗(yàn)通評(píng)估新型融合免疫球蛋白-mGE對(duì)EAE治療作用，以期能夠?yàn)閱为?dú)或聯(lián)合其他藥物治療本病提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑：融合蛋白mGE由祝道成教授惠贈(zèng)，髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白，百日咳毒素 (PTX)，弗氏完全佐劑，小牛血清白蛋白。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組：72只健康8～10周齡雌性野生型C57BL/6小鼠，體重18～22 g，由武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，在室溫18～25 ℃、相對(duì)濕度50%～60%，分小籠全價(jià)營養(yǎng)飼料飼養(yǎng)。人工24 h晝/夜循環(huán)照明環(huán)境中，適應(yīng)性飼養(yǎng)1～2周后予以編號(hào)分組。隨機(jī)分為EAE自然病程組、糖皮質(zhì)激素治療組和融合蛋白治療組，在造模成功后發(fā)病高峰期分別腹腔注射給予生理鹽水、甲潑尼龍5 mg/kg和mGE2 mg/kg，每日1次，連續(xù)治療7 d并繼續(xù)觀察1周評(píng)價(jià)療效。于免疫后第42天處死動(dòng)物進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.2.2 EAE模型的制作：采用M0G35-55肽段及免疫佐劑制作慢性EAE動(dòng)物模型。每只小鼠分2點(diǎn)腹股溝皮下共注射0.2 mL混合乳劑，其中含人工合成的MOG35-55肽段250 μg，完全弗氏佐劑2 mg，免疫0 d和2 d時(shí)經(jīng)腹腔各注射百日咳毒素200 ng。1周后重復(fù)免疫注射1次。分別在動(dòng)物發(fā)病高峰期(免疫后24～28 d)和慢性維持期(免疫后第42天)以每組12只處死動(dòng)物，取組織進(jìn)行相關(guān)檢測。由于小鼠存在個(gè)體差異，出現(xiàn)未發(fā)病或死亡的樣本則自動(dòng)剔除。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)小鼠不同階段的臨床評(píng)分：從初次免疫第0天起至第42天實(shí)驗(yàn)終止前，采用盲法，每天2人至少一次在同一時(shí)間進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，對(duì)EAE嚴(yán)重性進(jìn)行臨床評(píng)估。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，正常無癥狀；1分，尾部無力或跳踞步態(tài)伴尾部有力；2分，跳踞步態(tài)伴尾部無力(共濟(jì)失調(diào))；2.5分，共濟(jì)失調(diào)伴部分單肢麻痹；3分，單肢完全麻痹；3.5分，單肢完全麻痹伴另一肢體部分麻痹；4分，雙肢完全麻痹；4.5分，四肢麻痹；5分，死亡。

1.2.4 免疫熒光組化檢測小鼠脾臟內(nèi)IFN-γ的表達(dá)：取小鼠脾臟進(jìn)行石蠟包埋切片，進(jìn)行熒光免疫組化，檢測小鼠脾臟內(nèi)IFN-γ的表達(dá)。

1.2.5 Western blot檢測小鼠腦內(nèi)CD32b、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表達(dá)：在造模第42天結(jié)束后，取小鼠腦組織，加入蛋白裂解緩沖液，提取待測腦組織總蛋白，經(jīng) 10 % 變性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，采用濕法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉后加入抗CD32b、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ及GAPDH一抗，4 ℃過夜后加二抗孵育 2 h，Chemi Doc XPS發(fā)光系統(tǒng)顯影。以 Image J圖像分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，以目的條帶與GAPDH光密度的比值作為蛋白表達(dá)相對(duì)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)小鼠不同階段的臨床評(píng)分：在經(jīng)過激素和融合蛋白治療后，2組小鼠臨床功能評(píng)分均有明顯下降，相對(duì)于EAE自然病程組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明治療能夠緩解神經(jīng)功能的損傷程度。為剔除EAE組癥狀自然緩解的因素影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的評(píng)分對(duì)比表明，2治療組較EAE組慢性緩解期仍有好轉(zhuǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但2治療組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 3組實(shí)驗(yàn)小鼠不同階段臨床評(píng)分(分，±s)

表1 3組實(shí)驗(yàn)小鼠不同階段臨床評(píng)分(分，±s)

組別n發(fā)病高峰期慢性維持期EAE自然病程組243．5±0．71．6±0．3糖皮質(zhì)激素治療組243．2±0．30．7±0．2?#融合蛋白治療組243．6±0．20．9±0．4?#

注：*與EAE自然病程組發(fā)病高峰期比較，P<0.05；#與EAE自然病程組慢性維持期比較，P<0.05。

2.2 小鼠脾臟內(nèi)IFN-γ的表達(dá)：見圖1-圖4(目錄后)。經(jīng)過甲潑尼龍治療后，小鼠脾臟內(nèi)IFN-γ的熒光顯色較EAE組發(fā)病高峰期和慢性維持期有顯著減少，經(jīng)mGE治療后顯色差異不及甲潑尼龍治療組顯著。

2.3 CD32b、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ在小鼠腦內(nèi)的表達(dá)

2.3.1 CD32b在腦內(nèi)的表達(dá):經(jīng)治療后，甲潑尼龍組表達(dá)較發(fā)病高峰期無明顯變化，但較慢性維持期降低且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而融合蛋白治療組變化明顯，較發(fā)病高峰期和慢性維持期均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5(目錄后)。

2.3.2 MHC-Ⅰ分子在小鼠腦內(nèi)表達(dá):見圖6(目錄后)。腦內(nèi)MHC-Ⅰ類分子在慢性維持期仍處于高水平表達(dá)，經(jīng)過甲潑尼龍和融合蛋白治療后表達(dá)下降，與慢性緩解期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明甲潑尼龍和融合蛋白均可以降低腦內(nèi)MHC-Ⅰ類分子的表達(dá)。

2.3.3 MHC-Ⅱ分子在小鼠腦內(nèi)表達(dá):見圖7(目錄后)。腦內(nèi)MHC-Ⅱ類分子同樣在慢性維持期仍處于高位，表明MHC-Ⅱ類分子在EAE中存在持續(xù)高表達(dá)，這與病程遷延不愈相一致。經(jīng)過干預(yù)治療后，甲潑尼龍組和融合蛋白組均較慢性維持期含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示甲潑尼龍和融合蛋白都有抑制MHC-Ⅱ類分子表達(dá)的作用。

3 討論

APC是調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)方向和產(chǎn)生免疫耐受所必需的調(diào)節(jié)器，在維持免疫耐受中起到關(guān)鍵作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，EAE動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)MHC-Ⅱ類分子，且應(yīng)用INF-γ誘導(dǎo)MHC-Ⅱ類分子表達(dá)能加重EAE病情，而應(yīng)用IL-4、IL-10及TGF-β可抑制MHC-Ⅱ類分子表達(dá)并有助于EAE恢復(fù)[6]，這與本實(shí)驗(yàn)前期所得出的APC抗原提呈及炎性細(xì)胞因子分泌是參與EAE的重要機(jī)制這個(gè)結(jié)論一致?；趯?duì)MS/EAE發(fā)病機(jī)制多樣化觀點(diǎn)的認(rèn)同，即多種類型免疫應(yīng)答、多種免疫細(xì)胞參與和不同作用機(jī)制共同導(dǎo)致疾病發(fā)生，因此我們把治療的靶點(diǎn)設(shè)為免疫細(xì)胞的CD32b，通過增強(qiáng)其表達(dá)或功能而緩解MS/EAE的損傷癥狀。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)通過這一途徑，mGE具有明確的緩解慢性EAE小鼠臨床功能損害的作用，治療過程中沒有出現(xiàn)激素樣停藥反彈現(xiàn)象。

甲潑尼龍是目前治療MS急性期的首選藥物，療效較為確切，但是甲潑尼龍具有廣泛而嚴(yán)重的毒副作用，患者的耐受性差異較大，難以長期使用，停藥后的反彈現(xiàn)象也經(jīng)常出現(xiàn)，這些限制促使研究者一直努力尋找一種更加有效、特異性更高并且毒副作用低的藥物替代或聯(lián)合治療MS。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，甲潑尼龍能夠減少M(fèi)HC-Ⅰ、MHC-Ⅱ類分子，但沒有發(fā)現(xiàn)對(duì)CD32b表達(dá)有影響作用。

雖然mGE與甲潑尼龍的作用機(jī)制存在差異，臨床功能評(píng)分改善并不優(yōu)于甲潑尼龍組，但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示mGE可以顯著降低MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ類分子和抗原提呈功能相關(guān)免疫分子水平；說明mGE可以通過促進(jìn)CD32b表達(dá)上調(diào)，阻斷APC誘導(dǎo)的T、B淋巴細(xì)胞激活來實(shí)現(xiàn)其治療作用。

綜上所述，融合蛋白mGE可以降低慢性EAE小鼠腦內(nèi)MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ類分子和脾臟INF-γ的表達(dá)，增加CD32b的表達(dá)；甲潑尼龍則能夠減少M(fèi)HC-Ⅰ、MHC-Ⅱ類分子，下調(diào)脾臟INF-γ的表達(dá)，即融合蛋白和甲潑尼龍都具有下調(diào)腦內(nèi)APC提呈相關(guān)主要因子MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ類分子。融合蛋白對(duì)能夠上調(diào)抑制性受體CD32b的表達(dá)，表現(xiàn)出對(duì)APC活化的多重阻遏作用，但未見對(duì)T淋巴細(xì)胞相關(guān)免疫應(yīng)答有顯著作用。而甲潑尼龍除了能夠抑制APC相關(guān)作用外，還表現(xiàn)出對(duì)T細(xì)胞免疫應(yīng)答很強(qiáng)的負(fù)向抑制性調(diào)節(jié)作用，這是二者之間治療作用機(jī)制上的主要區(qū)別。

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Assessment the treatment of chronic EAE mice in a new fusion immunoglobulin-mGE

CHENGXiuli,ZHANGZhihong,LIUFengying,MAYunting,HUABing，ZHOUXiangyu.

DepartmentofNeurology,TheFirstHospitalofShizuishanAffiliatedofNingxiaMedicalUniversity,Shizuishan753200,ChinaCorrespondingauther：ZHOUXiangyu,Email：zxy839698@163.com

Objective To treat EAE and evaluate its efficacy,in order to provide new ideas and methods to treat the disease in alone or combinated with other drugs.Methods After C57BL/6 mice had been produced the chronic non-remitting EAE model induced by MOG35-55 peptide successfully,randomly selected portion of some mice when they were in the peak of onset,a novel fusion immunoglobulin which structre is combined with Fc portion of IgG and IgE and acid methyl prednisolone were used to treatment,then we observed the changes in clinical signs,simultaneous detection of a number of important immune-related indicators and made the relative analysis and the evaluated treatment efficacy of this fusion immunoglobulin to EAE mice.Results mGE playsed a therapeutic role by decreaseing the activity of the complement system generates fragments,inhibiting APC antigen presentation,reduceing the expression of MHC,and raiseding the expression of inhibitory Fc receptor- Fc gamma RII,blocking the APC antigen presenting and lymphocyte activation.Conclusion The treatment effect of mGE is exactly in the chronic non-remitting EAE,as one of alternative methods alone or in combination with other drugs for the treatment of EAE.mGE can inhibit MHC molecules expression of APC, and decrease the inflammatory cytokine release to ease chronic neurologic injury symptoms of EAE.

Experimentalallergicencephalomyelitis;Antigen-presentingcells;Majorhistocompatibilitycomplex;Myelinoligodendrocyteglycoprotein;Fusionimmunoglobulin

10.13621/j.1001-5949.2017.02.0104

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目(81660212)

寧夏石嘴山市第一人民醫(yī)院神經(jīng)疾病研究中心,寧夏 石嘴山 753200

程秀麗(1991-)，女，碩士學(xué)位，初級(jí)藥師，主要從事神經(jīng)疾病研究方向。

周翔魚，Email:zxy839698@163.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170215.1139.004.html

R744.51

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2016-06-15 [責(zé)任編輯]王凱榮