曹羿堃，劉風英，華 冰，周翔魚

·論 著·

慢性實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎小鼠模型不同階段抗原提呈細胞免疫應(yīng)答作用分析

曹羿堃，劉風英，華 冰，周翔魚

目的 對MOG35-55肽段誘導的實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)小鼠不同時期病理變化特點進行觀察分析，探討在EAE的發(fā)生、發(fā)展和遷延過程中抗原提呈細胞(APC)所起的作用及其作用機制。方法 利用MOG35-55肽段作為免疫原誘導C57BL/6小鼠制作慢性非緩解型EAE模型，在不同時期觀察實驗動物神經(jīng)功能變化，進行組織病理學檢查，通過WB、 RT-PCR等方法檢測部分免疫指標。結(jié)果 研究發(fā)現(xiàn)MOG35-55肽段可以成功誘導出慢性非緩解型EAE動物模型。與對照組比較，EAE組小鼠在發(fā)病過程中，腦組織出現(xiàn)以單核巨噬細胞、淋巴細胞為主的浸潤；腦組織中C3表達降低(P<0.05)，MHCⅠ、MHCⅡ和IL-12蛋白表達增加(P<0.05)；IL-27和B7 mRNA表達增加(P<0.05)。結(jié)論 中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)APC的活化、MHC分子、IL-12表達增加是EAE發(fā)生的早期事件并貫穿整個病理變化過程，由APC免疫應(yīng)答引發(fā)的下游伴隨事件可以造成EAE動物模型髓鞘直接損傷，APC可能是慢性EAE最終發(fā)生的最重要啟動和致病因素之一。

實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎；髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白；抗原提呈細胞

多發(fā)性硬化(MS)是以神經(jīng)退行性變及白質(zhì)散在/多灶性髓鞘脫失為主要病理變化，可伴有不同程度軸索損傷的炎性自身免疫性疾病。MS發(fā)生的確切原因和病理機制迄今不明，對于MS/EAE的大量研究結(jié)果表明，似乎所有已知類型免疫細胞都與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥和脫髓鞘病變存在關(guān)聯(lián)[1]。實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)，是發(fā)生于各種敏感實驗動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎性變態(tài)反應(yīng)性疾病。EAE模型在臨床、生化、免疫及病理等諸多方面與MS具有更相似的特征，是當前公認的研究MS的發(fā)病機制和治療策略的理想動物模型[2-3]。近年來MOG作為EAE模型的誘導抗原已被廣泛應(yīng)用于動物實驗研究中，文獻報道 MOG誘導C57BL/6小鼠的EAE模型在病理和臨床表現(xiàn)上最接近于人類MS[4-5]。因此，本實驗采用MOG35-55肽段主動免疫建立小鼠慢性-非緩解型EAE模型，觀察模型動物在免疫應(yīng)答不同階段，尤其是疾病發(fā)生過程中重要時間點的變化，對抗原提呈細胞(APC)在EAE發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及機制進行分析研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器：人工合成的鼠源性髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白(MOG35-55)多肽肽段，H-Met-Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Arg-Ser-Pro-Phe-Ser-Aig-Val-Val-His-Leu-Tyr-Aig-Asn-Gly-Lys-OH，MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK(Sigma)；百日咳毒素Pertussis Toxin，PTX(Sigma)；完全福氏佐劑Complete Freund’s Adjuvant(Sigma)；全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白含量測定試劑盒(凱基生物)；Ecl化學發(fā)光試劑盒(Thermo)；mRNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(Thermo)；蛋白電泳裝置、凝膠成像系統(tǒng)(Bio Rad)；熒光定量PCR儀(ABI)。

1.2 實驗動物及分組：114只健康8～10周齡雌性野生型C57BL/6小鼠，體重18～22 g，由武漢大學實驗動物中心提供。在室溫(25±2)℃、相對濕度50%～60%的環(huán)境中分籠飼養(yǎng)，人工晝夜循環(huán)照明環(huán)境中，適應(yīng)性飼養(yǎng)1～2周后予以編號分組。將小鼠隨機分為3組：對照組，佐劑組，自然病程組(EAE組)。

1.3 模型制作：EAE模型組小鼠分2點腹股溝皮下注射0.2 mL混合乳劑，其中含人工合成的MOG35-55肽段250 μg，完全弗氏佐劑2 mg；注射當天和2 d時經(jīng)腹腔注射百日咳毒素200 ng，1周后重復免疫注射1次。對照組小鼠正常飼養(yǎng)，不給予任何干預。佐劑組小鼠給予同劑量完全弗氏佐劑和百日咳毒素，但不進行M0G35-55肽段免疫誘導。

1.4 臨床評分：從免疫當天計第0天起，至第42天實驗終止前，每天觀察小鼠行為活動，采用盲法，每天2人至少1次在同1時間依據(jù)Benson評分標準做EAE臨床癥狀嚴重程度評估。評分標準：0分，正常無癥狀；1分，尾部無力或跳踞步態(tài)伴尾部有力；2分，跳踞步態(tài)伴尾部無力；2.5分，共濟失調(diào)伴部分單肢麻痹；3分，單肢完全麻痹；3.5分，單肢完全麻痹伴另一肢體部分麻痹；4分，雙肢完全麻痹；4.5分，四肢麻痹；5分，死亡。未發(fā)病或死亡標本自動剔除。

1.5 標本制備：分別在動物固有免疫期(免疫后3 d)、發(fā)病前期(免疫后10～12 d)、發(fā)病初期(免疫后15～20 d)、發(fā)病高峰期(免疫后24～28 d)和慢性維持期(免疫后第42天)處死動物，取組織進行相關(guān)檢測。

1.6 HE染色觀察小鼠腦組織病理變化：將石蠟包埋的組織切片，片厚4 μm，進行HE染色，鏡下觀察腦組織炎癥病灶范圍和細胞浸潤的情況。

1.7 Werstern blot檢測小鼠腦組織APC相關(guān)蛋白表達：將各組小鼠腦組織勻漿行BCA法測定濃度后，等濃度稀釋，上樣，SDS-PAGE凝膠電泳。采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉抗原1 h后，分別孵育兔抗GAPDH抗體1∶10 000，兔抗C3抗體1∶1 000，MHC-Ⅰ抗體1∶3 000，MHC-Ⅱ抗體1∶1 000，IL-12抗體1∶500，4 ℃搖床過夜。HRP標記的山羊抗兔二抗(1∶5 000)室溫孵育60 min，ECL發(fā)光，暗室膠片曝光并進行掃描分析。

1.8 熒光定量PCR檢測小鼠腦組織IL-27、B7-1 mRNA的表達：分別取100 mg腦組織，按RNA提取試劑盒說明書提取各組織總mRNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行2 μg總mRNA 20 μl體系逆轉(zhuǎn)錄。通過引物設(shè)計軟件Primer 5設(shè)計小鼠目的基因(IL-27、B7-1)和內(nèi)參基因(β-actin)引物序列，引物由Invitrogen中國公司合成，見表 1。熒光定量PCR擴增體系(25 μl)：2×Master Mix 12.5 μl，上游引物(10 μM) 0.5 μl，下游引物(10 μM)0.5 μl，cDNA模板500 ng，加RNase-Free water至25 μl。反應(yīng)條件:95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s→58 ℃退火30 s→72 ℃延伸30 s(40個循環(huán))。目的基因表達的定量分析采用樣本的CT值，以小鼠的β-actin基因作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算小鼠腦組織IL-27、B7-1基因mRNA的相對表達量。

1.9 統(tǒng)計學方法：采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 目的基因及內(nèi)參基因引物序列及產(chǎn)物片段長度

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況比較：對照組和佐劑組小鼠無體重下降，反應(yīng)活躍，食欲佳。EAE組小鼠免疫誘導后至發(fā)病前期體重一過性下降，活動減少，反應(yīng)遲緩，食欲差；臨床癥狀表現(xiàn)多樣、較嚴重，發(fā)病小鼠的臨床癥狀持續(xù)直至實驗結(jié)束。臨床評分隨著時間逐漸增高，EAE組自發(fā)病初期至慢性維持期平均臨床評分與對照組和佐劑組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 病理組織學觀察：對照組和佐劑組小鼠腦HE染色未發(fā)現(xiàn)異常改變。EAE組小鼠隨著病情的進展，炎癥病灶范圍和細胞浸潤的程度也相應(yīng)增加，在發(fā)病高峰期可見血管周圍炎性細胞浸潤，浸潤的炎性細胞主要是單核細胞和淋巴細胞，但炎性細胞浸潤程度并不十分嚴重，在慢性維持期病理改變上有所減輕，見圖1-圖6(目錄后)。

2.3 Western blot檢測小鼠腦組織中C3、MHC Ⅰ、MHC Ⅱ、IL-12蛋白的表達：補體C3在腦組織中的含量在固有免疫期有所升高，之后呈逐漸下降趨勢，固有免疫期和發(fā)病前期與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，發(fā)病初期、高峰期和慢性維持期較對照組降低(P<0.05)；MHC Ⅰ類分子在EAE模型組小鼠腦組織內(nèi)的含量隨病程發(fā)展明顯增多，發(fā)病初期、發(fā)病高峰期、慢性維持期與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；慢性維持期較發(fā)病高峰期表達增加，二者間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；EAE 組小鼠從發(fā)病前期開始MHC Ⅱ類分子表達增加，至發(fā)病初期含量達到高峰，在發(fā)病高峰期有所下降，至慢性維持期再度升高，發(fā)病前期、發(fā)病初期、發(fā)病高峰期和慢性維持期較對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；慢性維持期較發(fā)病高峰期MHC Ⅱ類分子表達增加，二者間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。IL-12在腦內(nèi)的分泌自發(fā)病前期開始增加，至發(fā)病高峰期達到最大值，至慢性維持期仍處于較高水平，發(fā)病前期、發(fā)病初期、發(fā)病高峰期和慢性維持期IL-12的含量較對照組升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4 PCR檢測小鼠腦組織IL-27、B7-1 mRNA的表達：與對照組比較，EAE組小鼠腦內(nèi)IL-27 mRNA的表達在固有免疫期和發(fā)病前期下調(diào)(P<0.05)，發(fā)病初期表達明顯增加，至發(fā)病高峰期仍維持較高水平(P<0.05)，在慢性維持期表達顯著減少(P<0.05)；B7-1 mRNA的表達隨病程發(fā)展呈逐漸升高趨勢，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

有研究表明，MS/EAE發(fā)生、發(fā)展可能涉及過度且持續(xù)異常激活的固有免疫應(yīng)答、適應(yīng)性免疫應(yīng)答狀態(tài)和機體免疫耐受機制被動終止等多個因素?？乖M入體內(nèi)首先在局部產(chǎn)生固有免疫應(yīng)答反應(yīng)，絕大多數(shù)抗原不能直接激活特異性的效應(yīng)淋巴細胞，而是必須由APC將抗原降解加工成可與MHC分子牢固結(jié)合的多肽片段，同時還表達協(xié)同刺激分子如B7分子，再以抗原肽-MHC復合物的形式提呈給T淋巴細胞供其充分活化。APC可能是EAE小鼠免疫應(yīng)答由外周免疫系統(tǒng)輾轉(zhuǎn)至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要載體，正常組織或靜息狀態(tài)的APC不表達或低表達共刺激分子，專職APC活化后通過表達共刺激分子來提示機體受到侵害，這時誘發(fā)的抗原特異性免疫應(yīng)答才具有針對性。許多研究顯示，固有免疫系統(tǒng)里許多細胞如DC、巨噬細胞、NKT等都可以通過下調(diào)共刺激分子表達誘導免疫耐受[6]，可見APC在MS/EAE免疫病理中的重要作用[7]。

補體系統(tǒng)是機體重要的免疫應(yīng)答和免疫效應(yīng)聯(lián)絡(luò)、放大系統(tǒng)，不僅是固有免疫的重要效應(yīng)機制，同時也是適應(yīng)性免疫的重要效應(yīng)機制之一。補體活化過程中產(chǎn)生的活性片段，可介導多種生物學效應(yīng)。補體C3可直接參與免疫應(yīng)答過程，主要促進APC的抗原攝取、加工。Western結(jié)果顯示，EAE模型組小鼠腦內(nèi)補體C3的含量在固有免疫期未見明顯變化，至發(fā)病初期C3含量顯著降低，表明這時補體系統(tǒng)激活反應(yīng)已不明顯，固有免疫不再占主導地位。

其他實驗結(jié)果顯示，在慢性EAE發(fā)病前期，與APC活化、抗原提呈有關(guān)的MHC Ⅱ類分子、B7-1分子、IL-12表達增加，至發(fā)病初期幾乎所有APC功能相關(guān)因子的表達變化已非常顯著；可見中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)APC激活是慢性EAE免疫應(yīng)答的早期事件，這時中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織損傷已經(jīng)開始產(chǎn)生，其作用可能早于T淋巴細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍免疫系統(tǒng)分化、增殖及激活后產(chǎn)生的細胞免疫反應(yīng)。在隨后的過程中，腦組織內(nèi)MHC Ⅰ、MHC Ⅱ類分子、B7-1、IL-12的表達均保持較高的水平，提示腦內(nèi)APC處于較高的活化狀態(tài)，且這種活化狀態(tài)一直持續(xù)到實驗結(jié)束，其原因除了需要提呈的抗原始終大量存在外，或許還與APC的負反饋調(diào)節(jié)機制不能發(fā)揮有效作用有關(guān)。EAE組小鼠腦內(nèi)IL-27在發(fā)病初期分泌達到高峰，且在發(fā)病高峰期維持較高水平，但在慢性維持期明顯下降，推測慢性維持期時IL-27與IL-12的協(xié)同效應(yīng)已經(jīng)減弱，IL-12卻仍在維持其功能效應(yīng)。以上實驗結(jié)果均說明，APC顯著增強的活化效應(yīng)一直貫穿于慢性EAE發(fā)展的全過程。

總結(jié)以上分析，慢性EAE的最終發(fā)生與多種細胞反應(yīng)以及它們分泌的細胞因子均存在關(guān)聯(lián)性。補體系統(tǒng)激活、APC活化后持續(xù)提呈抗原和分泌促炎細胞因子在病程早期發(fā)生，這些以APC為核心的固有免疫應(yīng)答效應(yīng)一直持續(xù)影響疾病的發(fā)生。APC可以影響免疫應(yīng)答的強度并決定應(yīng)答的方向，因此APC活化可能是最終造成髓鞘損傷最早啟動因子之一和直接、必須的參與因素。

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The study of immune response of APC in different stage of Chronic EAE

CAOYikun,LIUFengying,HUABing,ZHOUXiangyu.

DepartmentofNeurology,TheFirstHospitalofShizuishanAffiliatedofNingxiaMedicalUniversity,Shizuishan753600,ChinaCorrespondingouthor:ZHOUXiangyu,Email:zxy839698@163.com

Objective To analyze the pathological changes in different periods of MOG35-55 peptide -induced EAE mice,trying to in order to reveal the role and its mechanism of difference immune responses during the occurrence,development and persistent process of EAE.Method MOG35-55 peptide as an immunogen induced C57BL/6 mice to produced chronic non-remitting EAE model.We used the method of histopathological to observe the changes in neurological function at different times of experimental animals,at the same time,Western blot,and RT-PCR technologies were used to detect some important indicators of immune parameters and make a comprehensive analysis.Result The study found that MOG35-55 peptide can be successfully induced the chronic non-remitting EAE animal model.Compared with control group,lymphocyte and mononuclear macrophages of proliferation and infiltrating;The expression of C3 protein were decreased in brain (P<0.05),the expressions of MHCⅠ、MHCⅡ and IL-12 protein were increased (P<0.05);the expressions of IL-27 and B7 mRNA were increased (P<0.05).Conclusion The activation of the APC,increased expression of MHC molecule and IL-12 in the central nervous system is an early event in EAE and throughout the entire process of its pathological changes.Downstream events caused by immune responses of the APC can cause EAE animal model myelin damage directly,the APC is probably the most important start and pathogenic factor for the chronic EAE happened eventually.

Experimentalallergicencephalomyelitis;Myelinoligodendrocyteglycoproteinfusionimmunoglobulin;Antigen-presentingcells

國家自然科學基金地區(qū)科學基金項目(81660212)

寧夏石嘴山市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，寧夏 石嘴山 753600

曹羿堃(1989-)，男，碩士學位，住院醫(yī)師，主要從事神經(jīng)變性疾病研究方向。

周翔魚，Email:zxy839698@163.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170215.1139.002.html

10.13621/j.1001-5949.2017.02.0100

R332

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2016-07-15 [責任編輯]李 潔