賈逸文，屈亞威，劉海峰，

食管鱗狀細(xì)胞癌高分辨率顯微內(nèi)鏡圖像定量分析的診斷價(jià)值

賈逸文1，屈亞威2，劉海峰1，2

目的 探究食管鱗狀細(xì)胞癌高分辨率顯微內(nèi)鏡圖像定量分析的診斷價(jià)值。方法 選擇35例食管鱗狀細(xì)胞癌和正常食管黏膜的大體標(biāo)本，在前期制定的食管鱗狀細(xì)胞癌高分辨率顯微內(nèi)鏡(high resolution microendoscopy，HRME)診斷標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，回顧性分析其HRME圖像特征。根據(jù)標(biāo)本病理結(jié)果，由一名經(jīng)驗(yàn)豐富的HRME醫(yī)師挑選出1張HRME圖片，納入訓(xùn)練集，用計(jì)算機(jī)軟件對(duì)圖像特征進(jìn)行定量分析，制定圖像分析診斷標(biāo)準(zhǔn)。在此基礎(chǔ)上，將100例內(nèi)鏡下疑診食管鱗狀細(xì)胞癌的活檢標(biāo)本的HRME圖像納入測(cè)試集，進(jìn)行HRME圖像定量分析，將計(jì)算機(jī)分析得出的預(yù)診斷結(jié)果與病理結(jié)果進(jìn)行比較，評(píng)估定量分析HRME圖像對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌的診斷價(jià)值。結(jié)果 通過(guò)定量分析HRME圖像中細(xì)胞的核面積(nuclear area，NA)對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌和正常食管黏膜進(jìn)行區(qū)分，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在訓(xùn)練集中的敏感性和特異性分別為90%和97%，測(cè)試集中的敏感性和特異性分別為97%和90%。結(jié)論 定量分析HRME圖像可以區(qū)分食管鱗狀細(xì)胞癌組織和正常食管黏膜，并能夠增加診斷的客觀性，有利于HRME技術(shù)的推廣應(yīng)用。

高分辨率顯微內(nèi)鏡；食管癌；定量分析；診斷

食管癌是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其術(shù)后的5年生存率僅為19%[1]。而鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是我國(guó)最常見(jiàn)的病理類型。目前，國(guó)際上公認(rèn)診斷食管癌的方法是盧戈碘染色后對(duì)食管不染色區(qū)域進(jìn)行病理活檢[2]。這種方法雖然敏感性超過(guò)了95%，但是特異性低于65%[3，4]，很多食管表面的炎性病變常常也表現(xiàn)為不染或淡染區(qū)域，為了不造成漏診，臨床采取多部位活檢的方法，不僅增加了患者的費(fèi)用，也延長(zhǎng)了檢查時(shí)間，造成大量臨床資源的浪費(fèi)[5-7]。近年來(lái)，隨著共聚焦顯微內(nèi)鏡(confocal laser endomicroscopy，CLE)、高分辨率顯微內(nèi)鏡(high-resolution microendoscopy，HRME)等亞細(xì)胞顯微成像技術(shù)的不斷出現(xiàn)[8-12]，能夠在內(nèi)鏡檢查的同時(shí)，對(duì)病變區(qū)域?qū)崿F(xiàn)類似于病理活檢的成像檢查，提高了食管癌的診斷效率，對(duì)改善預(yù)后具有十分重要的意義。

本課題組研發(fā)了一套HRME成像設(shè)備，在前期研究中，利用HRME技術(shù)已對(duì)食管鱗狀上皮炎性反應(yīng)、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、食管鱗狀細(xì)胞癌等標(biāo)本進(jìn)行成像，并總結(jié)出相關(guān)的診斷標(biāo)準(zhǔn)。雖然初學(xué)者通過(guò)學(xué)習(xí)診斷標(biāo)準(zhǔn)可以掌握HRME診斷技術(shù)[13，14]，但是不同的觀察者受到自身的主觀影響，對(duì)同一病變的HRME圖像診斷時(shí)存在差異，影響其診斷的準(zhǔn)確性。然而，通過(guò)對(duì)HRME圖像進(jìn)行計(jì)算機(jī)圖像處理并定量分析，不僅能夠增加HRME診斷的客觀性，同時(shí)減少了診斷時(shí)間[15-17]。本研究在之前制定的食管鱗狀細(xì)胞癌診斷標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上[18]，通過(guò)定量分析HRME圖像，從而評(píng)估這種方法對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌的診斷價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇2015-05至2016-05就診于武警總醫(yī)院胸外科并行食管鱗狀細(xì)胞癌切除手術(shù)的大體標(biāo)本35例，以及2015-05至2016-05就診于武警總醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心行內(nèi)鏡檢查時(shí)疑診為食管鱗狀細(xì)胞癌的活檢標(biāo)本100例。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 試劑與藥品 0.9%氯化鈉注射液(辰欣藥業(yè)股份有限公司)、0.01%原黃素鹽酸鹽(美國(guó)Sigma公司)、鏈霉蛋白酶顆粒(北京泰德制藥股份有限公司)、碳酸氫鈉(北京泰德制藥股份有限公司)等。

1.3 成像設(shè)備 自主研發(fā)的HRME成像系統(tǒng)，包括白光LED光源、500 nm二向色鏡、濾光片、1.8 m含30000像元的傳像光纖、10×顯微物鏡、三維組合平移臺(tái)、科學(xué)級(jí)低溫制冷CCD相機(jī)和計(jì)算機(jī)圖像處理軟件，成像過(guò)程中HRME以15幀/s的速度攝取圖像，由CCD傳輸至計(jì)算機(jī)。

1.4 方法

1.4.1 HRME檢查 在大體標(biāo)本中，選擇腫瘤組織及切緣附近的正常食管表面黏膜組織的標(biāo)本。對(duì)于內(nèi)鏡下疑診為食管鱗狀細(xì)胞癌的患者，常規(guī)行組織活檢，選擇組織較完整、表面殘?jiān)俚幕顧z標(biāo)本。大體標(biāo)本和活檢標(biāo)本依次使用生理鹽水，去黏液劑(鏈霉蛋白酶顆粒和碳酸氫鈉混合溶液)和生理鹽水進(jìn)行沖洗，去除表面黏液和殘留物，干棉球擦干，備用。將標(biāo)本展平置于成像平臺(tái)上，局部噴灑0.01%原黃素鹽酸鹽2.0～3.0 ml，染色30 s后用生理鹽水洗去組織表面殘留染料，干棉球擦干組織表面的液體。光纖頭端以不同角度觀察組織表面，留取清晰的圖片用于圖像分析。

1.4.2 病理檢查 HRME成像后，進(jìn)行點(diǎn)對(duì)點(diǎn)活檢，標(biāo)本經(jīng)甲醛溶液固定，行病理學(xué)檢查。

1.4.3 圖像質(zhì)量 控制所有拍攝的HRME圖像由1名經(jīng)驗(yàn)豐富的HRME醫(yī)師根據(jù)病理結(jié)果進(jìn)行圖片篩選，留取病理提示為食管鱗狀細(xì)胞癌和正常鱗狀上皮的HRME圖像。去除有運(yùn)動(dòng)偽影的、離焦的、有雜質(zhì)覆蓋及病理診斷為其他的HRME圖像，從剩余圖像中選取一張能最能體現(xiàn)病變特征的清晰HRME圖像。所有大體標(biāo)本攝得的HRME圖像納入訓(xùn)練集，所有活檢標(biāo)本攝得的圖像納入測(cè)試集。

1.4.4 圖像分析 在訓(xùn)練集中，分別提取食管鱗狀細(xì)胞癌組和正常鱗狀上皮HRME圖像特征進(jìn)行分析。首先在圖像中去除過(guò)暗和過(guò)亮的區(qū)域，這些區(qū)域是由于成像光纖頭端不平整或染料聚集造成的。通過(guò)對(duì)圖像進(jìn)行低通濾波處理，使用閾值標(biāo)記出過(guò)暗或過(guò)亮的區(qū)域，將這些區(qū)域去除，留下亮度均勻的區(qū)域中，選取500×500像素大小區(qū)域作為可疑病灶區(qū)域(region of interest，ROI)進(jìn)行圖像分析。對(duì)ROI區(qū)域進(jìn)行高斯濾波處理，去除圖像中的網(wǎng)格，這些網(wǎng)格是光纖束的輪廓，在成像時(shí)不可避免，會(huì)影響圖像質(zhì)量。形態(tài)學(xué)圖像處理標(biāo)記并分割出ROI中的細(xì)胞核。使用直方圖二值化的算法，確定細(xì)胞核的閾值，可以將ROI中的細(xì)胞核和核外胞質(zhì)進(jìn)行分割，并計(jì)算細(xì)胞核面積。整個(gè)圖像分析過(guò)程耗時(shí)2.5 s(圖1)。

1.4.5 圖像分類 分別計(jì)算在訓(xùn)練集中食管鱗狀細(xì)胞癌和正常鱗狀上皮HRME圖像ROI中的核面積大小，尋找區(qū)分病變的最適值。將此值帶入測(cè)試集加以驗(yàn)證，以病理學(xué)為金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)估定量分析HRME圖像對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌的診斷價(jià)值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。分別計(jì)算在訓(xùn)練集、測(cè)試集中定量分析HRME圖像對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌診斷的敏感性、特異性，繪制ROC曲線，計(jì)算AUC面積。

圖1 高分辨率顯微內(nèi)鏡圖像診斷食管鱗狀細(xì)胞癌圖像定量分析流程

A，F(xiàn).選取可疑病灶區(qū)域；B，G.光纖輪廓形成圖像中的網(wǎng)格；C，H.使用高斯濾波去除圖像網(wǎng)格；D，I.直方圖二值化分割細(xì)胞核；E，J.計(jì)算細(xì)胞核面積

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 在35例大體標(biāo)本中，包括潰瘍型9例，腫塊型19例和縮窄型7例，病理檢查后，診斷為中-高分化鱗癌10例，中分化鱗癌15例和中-低分化鱗癌9例，HRME成像的正常食道黏膜經(jīng)病理檢查后均證實(shí)為正常鱗狀上皮組織。100例活檢標(biāo)本中，病理檢查后，診斷為正常組織58例，食管鱗狀細(xì)胞癌20例，其他22例。

2.2 HRME 圖片選擇35例大體標(biāo)本共獲得756張圖片，經(jīng)篩查后留取60張圖片并納入訓(xùn)練集用于圖像分析，制定最適細(xì)胞核面積。100例活檢標(biāo)本共獲得1283張圖片，經(jīng)篩查后，留取78張圖片納入測(cè)試集用于圖像分析，評(píng)估最適細(xì)胞核面積的診斷效果。135例拍攝位點(diǎn)及病理結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 135例HRME拍攝位點(diǎn)病理結(jié)果 (n)

2.3 定量圖像分析效果 在訓(xùn)練集中，所用圖像將按照?qǐng)D像分析步驟被定量分析，計(jì)算細(xì)胞核面積并記錄。在正常鱗狀上皮細(xì)胞圖像中，細(xì)胞排列規(guī)則，細(xì)胞核圓，大小均一，核間距正常，視野內(nèi)的細(xì)胞形態(tài)基本一致；鱗狀細(xì)胞癌圖像中，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核大小不一，形態(tài)各異，排列及其紊亂，核間距減小，同時(shí)出現(xiàn)了大量的細(xì)胞核疊加。經(jīng)計(jì)算ROI區(qū)域中的細(xì)胞核面積，正常鱗狀上皮細(xì)胞的平均核面積為(157.32±60.67)μm2，而鱗狀細(xì)胞癌的平均核面積為(583.40±146.40)μm2，兩組細(xì)胞核面積差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

訓(xùn)練集中正常鱗狀上皮及食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的核面積散點(diǎn)圖，并用虛線表示出可以區(qū)別兩種結(jié)構(gòu)的最適核面積，最適核面積為381.25 μm2。將此處作為診斷指標(biāo)，敏感性和特異性分別為90%和97%(圖2A)。在測(cè)試集中應(yīng)用得到的最適核面積進(jìn)行驗(yàn)證，診斷正常鱗狀上皮與食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的敏感性和特異性分別為97%和90%(圖2B)。訓(xùn)練集和測(cè)試集的受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)中，ROC曲線下面積(area under curve，AUC)分別為0.99和0.98(圖3)。

圖2 高分辨率顯微內(nèi)鏡拍攝位點(diǎn)的分布

圖3 圖像定量分析診斷效果

A.訓(xùn)練集，應(yīng)用最適核面積診斷食管鱗狀細(xì)胞癌敏感性和特異性分別為90%和97%；B.測(cè)試集，最適核面積診斷食管鱗狀細(xì)胞癌敏感性和特異性分別為90%和97%；AUC為曲線下的面積

3 討 論

HRME作為一種新型的內(nèi)鏡檢查手段，可以對(duì)組織的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行顯微觀察，具有廣闊的應(yīng)用前景[19-21]。本課題組前期研究證明，通過(guò)判讀HRME檢查圖像可以診斷食管鱗狀細(xì)胞癌，敏感性為96%，特異性為 86%[18]。作為一種新技術(shù)，熟練掌握并運(yùn)用其診斷疾病，需要一定的學(xué)習(xí)時(shí)間[22]。由于不同學(xué)習(xí)者自身的素質(zhì)不同，對(duì)病變的主觀判斷也存在差異[23]，而這種差異往往會(huì)影響診斷結(jié)果，造成漏診誤診。通過(guò)定量分析HRME圖像，可以提取其特征值，采用比較特征值的差異來(lái)診斷疾病，減少了人為因素的干擾，增加HRME診斷的客觀性，從而提升了診斷準(zhǔn)確性[24]。

本研究評(píng)估了定量分析HRME圖像診斷食管鱗狀細(xì)胞癌的可行性，證明通過(guò)計(jì)算并比較HRME圖像中細(xì)胞核面積，可以區(qū)分食管正常鱗狀上皮和食管鱗狀細(xì)胞癌。這種診斷方法在訓(xùn)練集中其敏感性為90%，特異性為97%，測(cè)試集中敏感性為97%，特異性為90%。相比之前通過(guò)人為判讀HRME圖像的診斷方法，不僅具有極高的敏感性和特異性，還避免了不同HRME醫(yī)師的主觀因素對(duì)診斷結(jié)果的干擾，增加了診斷的準(zhǔn)確性。同時(shí)，計(jì)算機(jī)可以根據(jù)HRME圖像自主進(jìn)行預(yù)診斷，極大的減少了HRME醫(yī)師的工作壓力，方便非專業(yè)HRME醫(yī)師使用，有助于HRME技術(shù)的推廣。

食管鱗狀上皮細(xì)胞內(nèi)含有大量糖原，遇碘后發(fā)生化學(xué)顯色反應(yīng)呈棕褐色，而食管癌及癌前病變的細(xì)胞內(nèi)糖原含量減少，遇碘不著色，形成不染區(qū)域。所以，目前臨床上廣泛使用的盧戈碘對(duì)食管可疑病變進(jìn)行染色的方法來(lái)發(fā)現(xiàn)食管癌及癌前病變。碘染后能夠清晰顯示食管病變黏膜的范圍及形態(tài)，在不染區(qū)域進(jìn)行活檢，能夠提高活檢的準(zhǔn)確性及早期食管癌的檢出率，據(jù)文獻(xiàn)[3，4]報(bào)道，其診斷食管癌的敏感性超過(guò)95%，特異性低于65%。這種方法雖然對(duì)病變有極高的敏感性，但特異性并不高，加之活檢具有的隨意性，且病變分化程度具有不均一性，臨床使用中往往因?yàn)椴荒軠?zhǔn)確活檢到食管癌細(xì)胞，而造成漏診。

與盧戈式碘染色活檢法一樣，HRME技術(shù)同樣建立在檢查者主觀疑診的基礎(chǔ)上，所以仍然存在漏診的情況。但如能將HRME技術(shù)與盧戈式碘染色活檢相結(jié)合，利用盧戈碘染色的高敏感性發(fā)現(xiàn)病變，并在盧戈碘染色的基礎(chǔ)上，對(duì)不染區(qū)域進(jìn)行HRME檢查，后再取活檢可以彌補(bǔ)單純碘染色特異性低的不足。能夠從根本上提升活檢的準(zhǔn)確性。對(duì)于臨床診斷食管鱗狀細(xì)胞癌具有重要意義。

本研究結(jié)果表明，通過(guò)定量分析HRME圖像對(duì)診斷食管鱗狀細(xì)胞癌具有重要意義，但此研究仍有一些局限性：(1)本研究為單中心實(shí)驗(yàn)，未做多中心驗(yàn)證；(2)受到自動(dòng)圖像幀選和算法處理時(shí)間的限制，圖像定量分析還未能做到實(shí)時(shí)分析。下一步準(zhǔn)備在圖像識(shí)別方面做新的研究。

綜上所述，盡管該技術(shù)還未能達(dá)到理想的效果，但本實(shí)驗(yàn)展示了定量分析HRME圖像對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌具有較高的診斷價(jià)值，如能與當(dāng)前染色活檢法相輔相成，可以提高活檢的準(zhǔn)確性，并減少不必要的活檢操作。同時(shí)，圖像定量分析也有利于HRME技術(shù)的推廣。未來(lái)實(shí)現(xiàn)在體實(shí)時(shí)的HRME圖像定量分析，可對(duì)病變邊界進(jìn)行判斷，這將有利于在治療中減少病變的切除范圍，從而減少治療操作對(duì)患者造成的醫(yī)療創(chuàng)傷[25]。隨著HRME技術(shù)的相關(guān)研究越來(lái)越多，這項(xiàng)新的技術(shù)也必將體現(xiàn)更好的診斷價(jià)值。

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(2016-10-17收稿 2016-12-06修回)

(責(zé)任編輯 武建虎)

Quantitative analysis of high resolution microendoscopic images for diagnosis of esophageal squamous cell carcinoma

JIA Yiwen1，QU Yawei2，and LIU Haifeng1，2.

1.Graduate School, Anhui Medical University，Hefei 230032，China; 2.Department of Gastroenterology，General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force，Beijing 100039，China

Objective To explore the diagnostic value of high-resolution microendoscopy in quantitative analysis of esophageal squamous cell carcinoma.Methods Thirty-five cases of esophageal squamous cell carcinoma and normal esophageal mucosa were selected. The HRME image of esophageal squamous cell carcinoma was analyzed retrospectively. According to the pathological results of specimens, an HRME image was selected by an experienced HRME clinician to be included in the training set. The image features were quantitatively analyzed by computer software, and diagnostic criteria for image analysis were formulated. On this basis,the HRME images of biopsy specimens of 100 cases of suspected esophageal squamous cell carcinoma were input into the test set for quantitative analysis of these HRME images. The results of pre-diagnosis via a computer were compared with pathological results. The diagnostic value of quantitative HRME images for esophageal squamous cell carcinoma was determined.Results The quantitative analysis of the nuclear area in HRME images was used to distinguish esophageal squamous cell carcinoma from normal esophageal mucosa. Statistical analysis showed that the sensitivity and specificity were 90% and 97% respectively in the training set, but were 97% and 90% respectively in the test set.Conclusions Quantitative analysis of HRME images can distinguish esophageal squamous cell carcinoma from normal esophageal mucosa, increase the reliability of diagnosis, and contribute to the popularization and application of this technology.

high resolution microendoscopy；esophageal squamous cell carcinoma；quantitative analysis；diagnostic

首都臨床特色應(yīng)用研究(Z141107002514099)

賈逸文，碩士研究生。

1.230032 合肥，安徽醫(yī)科大學(xué)研究生院;

2.100039 北京，武警總醫(yī)院消化內(nèi)科

劉海峰，E-mail：haifengliu333@163.com

R604；R735.1