宋 丹，史 茜，侯向前，瑪依努爾·尼亞孜，馬正海

HPV-16 URR突變對(duì)病毒早期啟動(dòng)子活性影響的研究

宋 丹1，史 茜1，侯向前1，瑪依努爾·尼亞孜2，馬正海1

1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，新疆 烏魯木齊 830001

背景與目的：新疆是宮頸癌高發(fā)區(qū)，該地區(qū)宮頸癌高發(fā)與人乳頭瘤病毒16型(human papillomavirus type 16，HPV-16)感染密切相關(guān)。該研究旨在分析新疆地區(qū)婦女宮頸病樣組織中HPV-16上游調(diào)控區(qū)(upstream regulatory region，URR)的突變及其功能。方法：以新疆婦女子宮頸上皮非典型增生(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)和宮頸癌病樣組織標(biāo)本DNA為模板，PCR擴(kuò)增HPV-16 URR片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序比對(duì)，篩選代表性的URR突變體構(gòu)建至pGL3-Basic載體，將其轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，48 h后檢測(cè)熒光素酶活性，分析URR突變體啟動(dòng)子活性。結(jié)果：采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)獲得了55個(gè)HPV-16 URR DNA片段，測(cè)序及序列分析發(fā)現(xiàn)44個(gè)突變位點(diǎn)，其中nt7192(G→T)、nt7433(-→T)、nt7435(C→G)和nt7863(A→-)4個(gè)位點(diǎn)的突變?yōu)樗行蛄泄灿?，nt7520(G→A)位點(diǎn)的突變存在于54個(gè)樣品中，剩余39個(gè)位點(diǎn)的突變存在于不同樣品中。根據(jù)突變的位置、頻率和程度，篩選出9個(gè)URR突變體分別克隆至pGL3-Basic中熒光素酶基因前并轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞。熒光素酶活性分析表明，不同URR突變體的啟動(dòng)子活性差異較大，來(lái)源于宮頸癌的URR突變體啟動(dòng)子活性顯著高于來(lái)源于CIN的URR突變體(P＜0.01)，部分宮頸癌URR突變體的啟動(dòng)子活性顯著高于SiHa和Caski細(xì)胞來(lái)源的URR參照序列的啟動(dòng)子活性。結(jié)論：新疆地區(qū)分離的HPV-16 URR發(fā)生多位點(diǎn)突變，其中部分突變?cè)鰪?qiáng)了URR內(nèi)部啟動(dòng)子的活性，導(dǎo)致HPV-16致癌活性增強(qiáng)。

人乳頭瘤病毒16型；上游調(diào)控區(qū)；突變；啟動(dòng)子

人乳頭瘤病毒16型(human papillomavirus type 16，HPV-16)為無(wú)囊膜的小型雙鏈環(huán)狀DNA病毒，可引起皮膚和黏膜的良性或惡性腫瘤。HPV的基因組全長(zhǎng)約7 900 bp，分為早期區(qū)(E區(qū))、晚期區(qū)(L區(qū))和上游調(diào)控區(qū)(upstream regulatory region，URR)，E區(qū)編碼具有轉(zhuǎn)化活性的E6、E7蛋白以及調(diào)控病毒復(fù)制和基因表達(dá)的E1和E2蛋白，L區(qū)編碼病毒衣殼蛋白，URR區(qū)包含病毒DNA復(fù)制起點(diǎn)(origin of replication，Ori)、E區(qū)啟動(dòng)子P97和調(diào)控病毒基因轉(zhuǎn)錄的多個(gè)順式作用元件。

新疆南部維吾爾族聚居區(qū)是宮頸癌高發(fā)區(qū)，在前期研究中發(fā)現(xiàn)新疆婦女宮頸癌活檢組織標(biāo)本中分離的HPV-16 E6［1］、L1［2］、L2［3］基因以及URR［4］均發(fā)生突變，其中URR的突變最為頻繁。本研究擴(kuò)大宮頸癌病樣數(shù)進(jìn)一步分析新疆地區(qū)HPV-16 URR突變，并分析URR突變體內(nèi)的啟動(dòng)子活性，以探討新疆地區(qū)HPV-16 URR突變與宮頸癌高發(fā)間的內(nèi)在聯(lián)系。

1 材料和方法

1.1 宮頸病變組織

收集宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變Ⅰ(cervical intraepithelial neoplasiaⅠ，CINⅠ)10例、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變Ⅱ(cervical intraepithelial neoplasiaⅡ，CINⅡ)10例、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變Ⅲ(cervical intraepithelial neoplasia Ⅲ，CIN Ⅲ)27例和宮頸癌(cervical cancer，CC)組織標(biāo)本51例。組織樣本都來(lái)自新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，均經(jīng)病理學(xué)診斷。

1.2 質(zhì)粒及細(xì)胞

非洲綠猴腎細(xì)胞Vero為永生化細(xì)胞，大腸桿菌DH5α和載體pGL3-Basic均為本實(shí)驗(yàn)室保存；SiHa和Caski均為整合了HPV-16基因組的宮頸癌細(xì)胞系，其URR作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 主要試劑

Ex Taq DNA聚合酶、DNA marker、T4DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；DNA切膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒LipofectamineTM2000 Reagent購(gòu)自美國(guó) Invitrogen公司；引物合成與測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.4 HPV-16 URR基因擴(kuò)增

分別以新疆婦女宮頸病樣組織基因組以及SiHa和Caski細(xì)胞基因組為模板，用HPV-16 URR特異性引物擴(kuò)增URR片段，上游引物序列為：5’-GCTTGTGTAACTATTG TGTCA-3’，下游引物序列為：5’-GTCCTGA AACATTGCAGTTCTCT-3’，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增參數(shù)為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 30 s，72 ℃1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min；4 ℃終止。PCR產(chǎn)物回收后測(cè)序。

1.5 遞歸式PCR擴(kuò)增W12 URR基因

永生化上皮細(xì)胞W12源自人類宮頸CINⅠ病變組織，W12 URR序列P97啟動(dòng)子活性較弱［5］，因此作為陰性對(duì)照組。根據(jù)GenBank報(bào)道的W12序列(GenBank accession no.AF125673)設(shè)計(jì)引物，遞歸式PCR擴(kuò)增得到W12 URR片段。

1.6 HPV-16 URR基因篩選及構(gòu)建重組質(zhì)粒

測(cè)序后對(duì)HPV-16 URR序列進(jìn)行分析，根據(jù)突變位點(diǎn)及頻率篩選出具有代表性的突變株，將其構(gòu)建至pMD18-T，同時(shí)將W12 URR片段構(gòu)建至pMD18-T，重組質(zhì)粒經(jīng)Hind Ⅲ與KpnⅠ雙酶切獲得URR片段和W12 URR片段，與同樣酶切的pGL3-basic載體在T4連接酶作用下于16 ℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α菌株中，在含Amp+瓊脂平板上挑選單菌落，增菌培養(yǎng)后以堿裂解法小量提取重組質(zhì)粒，經(jīng)Hind Ⅲ與KpnⅠ雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，并對(duì)酶切鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定。

1.7 熒光素酶檢測(cè)分析

Vero細(xì)胞鋪入12孔板，細(xì)胞長(zhǎng)至約80%時(shí)，pGL3-URR轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，pGL3-basic空載體作為空白對(duì)照，SiHa和Caski URR重組質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，W12 URR重組質(zhì)粒為陰性對(duì)照，每組6個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶的活性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。求每組平均值和方差，對(duì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組進(jìn)行兩組數(shù)據(jù)的成組t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 宮頸病樣URR突變基因分析

以宮頸病樣DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共得到55個(gè)大小約為750 bp的URR片段，其中CIN來(lái)源的URR片段13個(gè)，宮頸癌來(lái)源的URR片段42個(gè)，測(cè)序后與公布的德國(guó)標(biāo)準(zhǔn)株URR序列(GI：333031)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)44個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變，其中nt7192(G→T)、nt7433(-→T)、nt7435(C→G)和nt7863(A→-)4個(gè)位點(diǎn)的突變?yōu)樗行蛄泄灿?，nt7520(G→A)位點(diǎn)的突變存在于54份樣品中，這5個(gè)位點(diǎn)的突變?cè)谛陆貐^(qū)趨于恒定；其余39個(gè)位點(diǎn)的突變?cè)诓糠謽悠分写嬖?，分析結(jié)果見表1。

2.2 篩選URR突變體并構(gòu)建pGL3-URR重組質(zhì)粒

根據(jù)上述URR序列突變的位置、頻率和程度，篩選出9個(gè)URR突變體并克隆入pGL3-Basic載體，獲得重組質(zhì)粒pGL3-URR-CINⅠ、pGL3-URR-CINⅡ、pGL3-URR-CINⅢ、pGL3-URRCC1、pGL3-URR-CC2、pGL3-URR-CC3、pGL3-URR-CC4、pGL3-URR-CC5和pGL3-URR-CC6，篩選的9個(gè)URR片段突變情況見表2。上述重組質(zhì)粒經(jīng)KpnⅠ和Hind Ⅲ酶切產(chǎn)生約5 400 bp的質(zhì)粒片段和約750 bp的URR片段，與預(yù)期結(jié)果相符，說(shuō)明重組質(zhì)粒pGL3-URR構(gòu)建正確(圖1)。

表1 宮頸癌和子宮上皮非典型增生組織中HPV-16 URR基因序列的變異Tab. 1 Variation of HPV-16 URR from cervical cancer and cervical intraepithelial neoplasia

表2 代表性URR突變體的變異Tab. 2 The variation of the typical URR mutants

圖1 重組質(zhì)粒pGL3-URR的酶切分析Fig. 1 Restriction endonuclease analysis of recombinant plasmid pGL3-URR

2.3 熒光素酶活性分析

將不同URR突變體的pGL3-basic/URR重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Vero細(xì)胞，熒光素酶檢測(cè)結(jié)果表明，不同URR突變體啟動(dòng)子活性存在較大差異，來(lái)源于宮頸癌的URR突變體啟動(dòng)子活性顯著高于來(lái)源于CIN的URR突變體(P＜0.01)。CIN(CINⅠ、CIN Ⅱ、CIN Ⅲ)URR序列平均啟動(dòng)子活性是W12 URR啟動(dòng)子活性2.75倍，宮頸癌(CC1、CC2、CC3、CC4、CC5和CC6)URR序列平均啟動(dòng)子活性是W12 URR啟動(dòng)子活性12.62倍，其中CC2 URR啟動(dòng)子活性是W12 URR啟動(dòng)子活性的26倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，是對(duì)照細(xì)胞SiHa和Caski URR啟動(dòng)子活性的1.26和 1.9倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，圖2)。

圖2 CIN和CC中HPV-16 URR片段啟動(dòng)子活性Fig. 2 The promoters activity of HPV-16 URR fragments from CIN and CC

3 討 論

HPV-16早期基因的表達(dá)由URR上的P97早期啟動(dòng)子啟動(dòng)，啟動(dòng)子的活性受病毒早期蛋白和轉(zhuǎn)錄因子等調(diào)控，URR的突變可增強(qiáng)或減弱URR內(nèi)部啟動(dòng)子的活性。HPV-16 URR以兩個(gè)E2蛋白結(jié)合位點(diǎn)為界分成3個(gè)區(qū)域：5’區(qū)、3’區(qū)和中央?yún)^(qū)。5’區(qū)包含晚期轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)、多聚腺苷酸化位點(diǎn)［6］和轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白E2結(jié)合位點(diǎn)［7］。3’區(qū)包含病毒的Ori，該元件在病毒DNA的復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用，Ori長(zhǎng)度約100 bp，是一個(gè)相對(duì)保守的區(qū)域，含E1和E2蛋白結(jié)合位點(diǎn)，以及其他復(fù)制必需元件。E1蛋白和E2蛋白與Ori結(jié)合形成前起始復(fù)合物并起始病毒DNA的復(fù)制［8-9］。中央?yún)^(qū)為增強(qiáng)子區(qū)域，全長(zhǎng)約400 bp，兩端分別是E2蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，包含了多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，如特異蛋白1(specificity protein 1，SP1)［10］、細(xì)胞核因子1(nuclaer factor-1，NF-1)［11］及陰陽(yáng)因子1(yin-yang factor 1，YY1)等［12］，這些轉(zhuǎn)錄因子通過與URR結(jié)合調(diào)節(jié)P97啟動(dòng)子的活性，從而影響致癌基因E6、E7的表達(dá)。

核酸雜交和HPV-16核苷酸序列分析表明，不同地區(qū)、不同種族及不同人群HPV-16陽(yáng)性標(biāo)本中的HPV-16核苷酸序列存在大量變異，且變異譜系分布有著明顯的地域性［13-16］。前期研究表明新疆地區(qū)HPV-16的各基因均有突變，其中URR也發(fā)生多位點(diǎn)的突變，本研究擴(kuò)大樣本后對(duì)HPV-16 URR突變進(jìn)行分析，結(jié)果表明，nt7192(G→T)、nt7433(-→T)、nt7435(C→G)和nt7863(A→-)4個(gè)位點(diǎn)的突變?yōu)樗蠻RR序列共有，除了CIN Ⅲ樣品外，nt7520(G→A)位點(diǎn)的突變存在于其他54份樣品中。本研究發(fā)現(xiàn)的一些突變現(xiàn)已報(bào)道，7192位(C→T)和7729(A→C)在亞裔美洲型(AA)中普遍存在［4,17］，nt7449(T→C)［4］、nt7843(A→G)［17］及nt7792(A→G)［18］的突變可顯著提高URR啟動(dòng)子活性，其余的突變位點(diǎn)尚未見報(bào)道。

W12為來(lái)自人類宮頸CIN Ⅰ病變組織的永生化上皮細(xì)胞，W12 URR序列P97啟動(dòng)子活性較弱［10］，SiHa和Caski均為整合了HPV-16基因組的宮頸癌細(xì)胞系，其URR啟動(dòng)子活性較高，可作為URR啟動(dòng)子活性研究的陽(yáng)性對(duì)照［19］。有研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于宮頸癌的URR突變體啟動(dòng)子活性顯著高于來(lái)源于CIN的URR突變體，其中CC2的URR啟動(dòng)子活性明顯高于SiHa、Caski和其他病樣的URR啟動(dòng)子活性，該URR突變體除普遍存在的5個(gè)位點(diǎn)的突變外，還存在nt7820-7868間的48個(gè)堿基缺失，且缺失片段中包括E2蛋白結(jié)合位點(diǎn)E2BS2， nt7820-7868間一些堿基的突變能增強(qiáng)URR啟動(dòng)子活性［18-21］。本研究中CC2的URR啟動(dòng)子活性是W12 URR啟動(dòng)子活性的26倍，推測(cè)nt7820-7868間的48個(gè)堿基的缺失也會(huì)增強(qiáng)URR啟動(dòng)子活性。

CC1、CC3和CC5樣品除普遍存在的5個(gè)位點(diǎn)的突變外，還存在nt7841(G→A)位點(diǎn)的突變，Dong等［21-22］報(bào)道，HPV-16 URR序列中YY1蛋白結(jié)合位點(diǎn)(nt7840-nt7848)和SP1結(jié)合位點(diǎn)(nt7842-nt7847)重疊，SP1與YY1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合該位點(diǎn)，本研究中CC1、CC3和CC5樣品URR啟動(dòng)子活性較W12 URR啟動(dòng)子活性提高了7、12和8倍，推測(cè)與nt7841(G→A)突變有關(guān)，該位點(diǎn)的突變可能改變了YY1、SP1轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，從而使得URR啟動(dòng)子活性提高。有研究報(bào)道，位于3’-URR末端的nt7660-nt7890片段的突變是使亞裔美洲型(AA)URR序列啟動(dòng)子活性增強(qiáng)的主要原因［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，所有URR序列在nt7660-nt7890位點(diǎn)都存在突變，如nt7729(A→C)、nt7841(G→A)和nt7863(A→-)等，且宮頸癌URR序列的突變位點(diǎn)多于CIN URR序列。

本研究中除了CINⅢ樣品外，nt7520(G→A)位點(diǎn)的突變存在于其他54份樣品中，該位點(diǎn)的突變?cè)趤喴崦乐扌?AA)中普遍存在，其啟動(dòng)子活性較W12 URR啟動(dòng)子活性提高了3.3倍［23-24］，Schmidt等［25］也發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)的突變改變了YY1、SP1和AP-1等轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，從而增強(qiáng)了HPV-16的致癌活性。另有一些突變位點(diǎn)已被證實(shí)可增強(qiáng)URR啟動(dòng)子活性，如nt7792(C→T)位的YY1結(jié)合位點(diǎn)突變可顯著提高啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性［18］。此外，還有一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的突變尚未見報(bào)道，如nt7729(A→C)和nt7826(T→C)，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，這兩個(gè)位點(diǎn)分別位于NF-1和1-Oct結(jié)合位點(diǎn)［19］，其突變也可能影響URR啟動(dòng)子活性。

上述結(jié)果表明，新疆婦女宮頸病變組織中分離的URR存在多個(gè)位點(diǎn)突變，其中一些突變?cè)鰪?qiáng)了URR內(nèi)部啟動(dòng)子活性，從而可能促進(jìn)病毒致癌基因的復(fù)制，并最終促進(jìn)其致癌活性。

［1］ 馬正海, 錢 東, 馬 紀(jì), 等. 中國(guó)新疆維吾爾族婦女宮頸癌組織中乳頭狀瘤病毒16型E6基因的克隆和序列分析［J］. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2001, 28(3)： 400-404.

［2］ 馬正海, 張富春, 梅新娣, 等. 新疆南部地區(qū)維吾爾族婦女宮頸癌組織中人乳頭狀瘤病毒16型L1基因突變譜分析［J］. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2004, 84(12)： 987-991.

［3］ 馬正海, 梅新娣, 張富春. 新疆南部地區(qū)維吾爾族婦女宮頸癌組織中HPV-16型L2基因多態(tài)性突變譜分析［J］. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志, 2004, 24(12)： 968-972.

［4］ 余 猛, 馬正海, 王艷萍, 等. 新疆維吾爾族婦女宮頸癌組織中人乳頭狀瘤16型上游調(diào)控區(qū)DNA多態(tài)性分析［J］.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志, 2006, 26(11)： 1000-1004.

［5］ SCARPINI C G, GROVES I J, PETT M R, et al. Virus transcript levels and cell growth rates after naturally occurring HPV-16 integration events in basal cervical keratinocytes［J］. J Pathol, 2014, 233(3)： 281-293.

［6］ ARANY I, GRATTENDICK K G, TYRING S K. Interleukin-10 induces transcription of the early promoter of human papillomavirus type 16 (HPV-16) through the 5’-segment of the upstream regulatory region (URR)［J］. Antiviral Res, 2002, 55(2)： 331-340.

［7］ GENTHER S M, STERLING S, DUENSING S, et al. Quantitative role of the human papillomavirus type 16 E5 gene during the productive stage of the viral life cycle［J］. J Virol, 2003, 77(5)： 2832-2842.

［8］ CARSON A, KHAN S A. Characterization of transcription factor binding to human papillomavirus type 16 DNA during cellular differentiation ［J］. J Virol, 2006, 80(9)： 4356-4362.

［9］ SIDDIPA A, LEON K C, JAMES C D, et al. The human papillomavirus type 16 L1 protein directly interacts with E2 and enhances E2-dependent replicationand transcription activation［J］. J Gen Virol, 2015, 96(8)： 2274-2285.

［10］ SHIRATSUCHI I, AKAGI Y, KAWAHARA A, et al. Expression of IGF-1 and IGF-1R and their relation to clinicopathological factors in colorectal cancer［J］. Anticancer Res, 2011, 31(7)： 2541-2545.

［11］ LUCIANA B F, CHEN Z G , ELAINE F M, et al. Human papillomavirus 16 non-european variants are pereferentially associated with high-grade cervical lesions［J］. PLoS One, 2014, 9(7)： e100746.

［12］ LACE M J, ISACSON C, ANSON J R, et al. Upstream regulatory region alterations found in human papillomavirus type16 (HPV-16) isolates from cervical carcinomas increase transcription, ori function, and HPV immortalization capacity in culture ［J］. J Virol, 2009, 83(15)： 7457-7466.

［13］ XI L F, KOUTSKY L A, HILDESHEIM A, et al. Risk for high-grade cervical intraepithelial neoplasia associated with variants of human papillomavirus types 16 and 18［J］. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2007, 16(1)： 4-10.

［14］ PIENTONG C, WONGWARISSARA P, EKALAKSANANAN T, et al. Association of human papillomavirus type 16 long control region mutation and cervical cancer［J］. Virol J, 2013, 10(1)： 491-500.

［15］ KAHLA S, KOCHBATI L, HAMMAMI S, et al. Sequence variation in the E2-binding domain of HPV-16 and biological function evaluation in Tunisian cervical cancers［J］. Biomed Res Int, 2013, 2014(6)： 751-759.

［16］ XI L F, KIVAT N B, HILDESHEIM A, et al. Human papillomavirus type 16 and 18 variants： race-related distribution and persistence ［J］. J Natl Cancer Inst, 2006, 98(15)： 1045-1052.

［17］ KAMMER C, WARTHORST U, TORREZ M N, et al. Sequence analysis of the long control region of human papillomavirus type 16 variants and functional consequences for P97 promoter activity［J］. J Gen Virol, 2000, 81(8)：1975-1981.

［18］ WATTS K J, THOMPSON C H, COSSART Y E, et al. Variable oncogene promoter activity of human papillomavirus type 16 cervical cancer isolates from Australia［J］. J Clin Microbiol, 2001, 39(5)： 2009-2014.

［19］ DIPANJANA M, RATNESH K S, SRABONI M, et al. Genetic and epigenetic changes of HPV-16 in cervical cancer differentially regulate E6/E7 expression and associate with disease progression［J］. Gynecol Oncol, 2011, 123(3)： 597-604.

［20］ SUN Z R, LU Z T, LIU J H, et al. Genetic variations of E6 and long control region of human papillomavirus type 16 from patients with cervical lesion in Liaoning China［J］. BMC Cancer, 2013, 13(41)： 4989-4994.

［21］ DONG X P, PFISTER H. Overlapping YY1- and aberrant SP1-binding sites proximal to the early promoter of human papillomavirus type 16［J］. J Gen Virol, 1999, 80(8)： 2097-2101.

［22］ LACE M J, YAMAKAWA Y, USHIKAI M, et al. Cellular factor YY1 downregulates the human papillomavirus 16 E6/ E7 promoter, P97, in vivo and in vitro from a negative element overlapping the transcription-initiation site［J］. J Gen Virol, 2009, 90(10)： 2402-2012.

［23］ PICCONI M A, ALONIO L V, SICHERO L, et al. Human papillomavirus type-16 variants in Quechua aboriginals from Argentina［J］. J Med Virol, 2003, 69(4)： 546-552.

［24］ LUIGI M, ANNA G, JOHN V, et al. Human papillomavirus type 16 long control region and E6 variants stratified by cervical disease stage［J］. Infect Genet Evol, 2014, 26(100)：8-13.

［25］ SCHMIDT M, KEDZIA W, GOZDZICKA J A. Intratype HPV-16 sequence variation within LCR of isolates from asymptomatic carriers and cervical cancers［J］. J Clin Virol, 2001, 23(1-2)： 65-77.

The ef f ect of mutations in the upstream regulatory region of HPV-16 on the activity of virus early promoter

SONG Dan1, SHI Qian1, HOU Xiangqian1, MAYINEUR·Niyazi2, MA Zhenghai1(1. College of

Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, Xinjiang Uyghur Autonomous Region, China; 2. Gynecology and obstetrics Xinjiang Uyghur Autonomous Region People’s Hospital, Urumqi 830001, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China)

Background and purpose: The incidence of cervical cancer is rather high in Xinjiang, which is closely associated with the infection of human papilloma virus type 16 (HPV-16). The purpose of this study was to analyze the variants and function of HPV-16 upstream regulatory region (URR) in the tissues of cervical cancer biopsies from Xinjiang. Methods: The DNAs were extracted from the tissues of cervical epithelial atypical hyperplasia (CIN) and cervical cancer biopsies. HPV-16 URR segments were amplif i ed by PCR. Based on the sequence analysis of the URR, the representative URR variants were selected and cloned into pGL3-Basic. The recombinant plasmids were transfected into Vero cell lines respetively. Luciferase activity of transfected cells was detected 48 h after transfection. Results: Fifty-f i ve HPV-16 URR DNA fragments were obtained through PCR, and 44 mutations were found from the URR fragments. 4 of these mutations, including nt7192(G→T) , nt7433(- →T), nt7435 (C→G) and nt7863 (A→-) occurred in all sequences. The mutation at nt7520 (G→A) occurred in 54 URR sequences, and the 39 other mutations were present in dif f erent samples. Based on the location and frequency of the mutations in the URR fragments, 9 URRvariants were selected and cloned into pGL3-Basic. Then the luciferase activity of the cells transfected with pGL3-URR plasmids was detected respectively. Promoter activity of URR mutants from cervical cancer are significantly higher than that of URR mutants from CIN (P＜0.01). Promoter activity of URR fragments from some cervical cancer was signif i cantly higher than that of the URR fragments from SiHa and Caski cells. Conclusion: Multiple mutations occurred in HPV-16 URR of cervical cancer patients from Xinjiang. The promoter activity and carcinogenicity of some URR mutants have been enhanced.

Human papillomavirus type 16; Upstream regulatory region; Mutation; Promoter

MA Zhenghai E-mail: mzhxju@126.com

10.19401/j.cnki.1007-3639.2017.02.005

R737.33

A

1007-3639(2017)02-0109-06

2016-03-15

2016-09-10）

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31060025)。

馬正海 E-mail：mzhxju@126.com