劉子梅，余文熙，孫 矗，袁 媛，沈 贊

上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，上海 200233

ICAM-1在三陰性乳腺癌中的表達(dá)的臨床意義及與預(yù)后的關(guān)系

劉子梅，余文熙，孫 矗，袁 媛，沈 贊

上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，上海 200233

背景與目的：三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)侵襲性強(qiáng)，預(yù)后差，治療手段匱乏。該研究通過(guò)檢測(cè)人TNBC與對(duì)應(yīng)癌旁組織中細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)蛋白的表達(dá)，研究ICAM-1蛋白與TNBC臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。方法：收集59例TNBC及其對(duì)應(yīng)的50例癌旁組織標(biāo)本，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)ICAM-1在59例TNBC及50例癌旁組織中的表達(dá)水平，比較其陽(yáng)性率。分析ICAM-1蛋白的表達(dá)與TNBC年齡、腫瘤大小、臨床病理類型、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期、脈管癌栓、神經(jīng)浸潤(rùn)、Ki-67、p53和E-cadherin等臨床病理特征及與患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：TNBC中ICAM-1的表達(dá)明顯高于癌旁組織(P=0.000)。ICAM-1與淋巴轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)和TNM分期有關(guān)(P分別為0.036、0.027和0.048)，與腫瘤大小、臨床病理類型、脈管癌栓、Ki-67水平、p53和E-cadherin表達(dá)等無(wú)關(guān)。ICAM-1高表達(dá)組患者的無(wú)病生存時(shí)間(disease-free survival，DFS)顯著較ICAM-1低表達(dá)組短(P=0.036)，但對(duì)于總生存時(shí)間(overall survival，OS)沒(méi)有顯著影響。另外，Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型多因素分析，ICAM-1表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響DFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(HR=3.2，95%CI：1.6-6.4，HR=2.7，95%CI：1.3-5.9，P均＜0.05)。結(jié)論：ICAM-1蛋白可以作為判斷TNBC惡性程度的指標(biāo)，ICAM-1高表達(dá)的三陰性乳腺癌臨床預(yù)后差。

三陰性乳腺癌；細(xì)胞間黏附分子-1；免疫組化；預(yù)后

三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是乳腺癌分子分型中的一種，其雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)和人表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epithelial growth factor receptor-2，HER-2)表達(dá)均陰性。具有腫瘤負(fù)荷大、惡性程度高、臨床復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移早和缺少相應(yīng)治療手段等臨床特點(diǎn)。

細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)，又叫做CD54分子，由ICAM-1基因編碼，屬于黏附分子中免疫球蛋白超家族中的成員，是介導(dǎo)黏附反應(yīng)重要的一個(gè)黏附分子。它分為sICAM-1(可溶型)和mICAM-1(膜型)2種，mICAM-1(膜型)在細(xì)胞表面以糖蛋白的形式存在，sICAM-1(可溶型)位于細(xì)胞外以游離形式存在。ICAM-1在促進(jìn)炎癥部位的黏連性、控制腫瘤惡化、轉(zhuǎn)移及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)中起重要作用。它通過(guò)與其受體的特異性結(jié)合，使白細(xì)胞、炎癥細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等與內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附作用增強(qiáng)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞活化，使它們更容易穿透內(nèi)皮。內(nèi)皮細(xì)胞上的細(xì)胞間黏附分子介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間或細(xì)胞與基質(zhì)間相互接觸和結(jié)合，從而參與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與活化、細(xì)胞組織生長(zhǎng)與分化、免疫應(yīng)答、炎性反應(yīng)、血管生成及腫瘤轉(zhuǎn)移等生理病理過(guò)程［1］。ICAM-1的研究在肝癌［2］、前列腺癌［3］和肺癌［4］中均有報(bào)道，但在TNBC中研究較少，本研究旨在探討ICAM-1與TNBC臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 標(biāo)本收集與處理

收集2008—2013年上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院TNBC患者根治標(biāo)本59例(剔除新輔助化療患者)。其中癌組織59例，癌旁組織50例(50例為對(duì)應(yīng)癌組織樣本，缺失9例)。根據(jù)NCCN指南，HER-2陰性包括免疫組織化學(xué)法結(jié)果陰性或行FISH檢測(cè)結(jié)果無(wú)擴(kuò)增?；颊吣挲g24～83歲，平均年齡57.4歲，根據(jù)AJCC TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ～Ⅱ期40例，Ⅲ～Ⅳ期19例，浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌38例，浸潤(rùn)性小葉癌3例，基底細(xì)胞癌8例，其他10例，腫塊小于等于2 cm者23例，大于2 cm者36例。59例患者中，術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移15例，其中骨轉(zhuǎn)移6例，肺轉(zhuǎn)移3例，肝轉(zhuǎn)移2例，淋巴結(jié)2例，局部復(fù)發(fā)2例。所有標(biāo)本經(jīng)10%甲醛溶液固定后，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度為5 μm。

1.2 主要試劑耗材

ICAM-1兔抗人單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司(貨號(hào)ab53013)，即用型SABC(過(guò)氧化物酶)試劑盒、改進(jìn)型檸檬酸鈉抗原修復(fù)液、DAB辣根過(guò)氧化物酶顯色試劑盒、蘇木素染色液、中性樹(shù)膠封片劑和磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)等均購(gòu)自上海威奧生物科技有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)法染色

本實(shí)驗(yàn)分為陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。陽(yáng)性對(duì)照組使用正常肺組織(已知ICAM-1表達(dá)量高)，陰性對(duì)照組采用PBS代替一抗。實(shí)驗(yàn)組包括59例癌組織和50例癌旁組織標(biāo)本。載玻片防脫片劑處理，置58～60 ℃烤箱30～60 min。切片常規(guī)脫蠟至水：二甲苯60 ℃ 5 min共3次。100%→95%→75%酒精，每級(jí)均為3 min。3%H2O2室溫5～10 min滅活內(nèi)源性酶。0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH為6.0)熱修復(fù)抗原。5%BSA封閉液封閉，ICAM-1兔抗人一抗(1∶50稀釋)，4 ℃過(guò)夜。滴加生物素化山羊抗兔IgG(二抗)，37 ℃ 20 min。滴加試劑SABC，37 ℃ 20 min。DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒(AR1022)。取1 mL蒸餾水，加試劑盒中A、B和C試劑各1滴，混勻后加至切片。蘇木素復(fù)染堿性PBS返藍(lán)。中性樹(shù)脂封片。

1.4 免疫組織化學(xué)法結(jié)果及判定標(biāo)準(zhǔn)

所有的免疫組織化學(xué)切片均由兩位資深病理科醫(yī)師評(píng)審，參照參考文獻(xiàn)［5-6］的判定標(biāo)準(zhǔn)，最后評(píng)分結(jié)果采取陽(yáng)性細(xì)胞比例及著色深淺相結(jié)合的方法，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)小于等于25%記為1分，25%～50%記為2分，大于50%記為3分，ICAM-1蛋白為細(xì)胞膜蛋白，在細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中著色，顯微鏡下無(wú)著色記為0分，著色為淺黃顆粒記為1分，深黃或棕色顆粒記為2分。最后兩者所得評(píng)分相乘，0和1分為陰性表達(dá)，2、3、4和6分為陽(yáng)性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件，率的比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)統(tǒng)計(jì)量應(yīng)用非參數(shù)Spearman相關(guān)，根據(jù)需要并做Fisher精確檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。單因素生存分析應(yīng)用Log-rank檢驗(yàn)，對(duì)于P＜0.05的指標(biāo)應(yīng)用Cox風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素分析。

2 結(jié) 果

2.1 ICAM-1蛋白癌組織和癌旁組織的表達(dá)

59例癌組織中陽(yáng)性43例(72.9%)，陰性16例(21.7%，圖1)。50例癌旁組織中，陽(yáng)性9例(18%)，陰性41例(82%)。ICAM-1蛋白的表達(dá)癌組織明顯高于癌旁組織(P=0.000，表1)。

圖1 免疫組化標(biāo)記ICAM-1蛋白在TNBC及癌旁組織中的表達(dá)情況Fig. 1 Immunohistochemical staining of ICAM-1 protein in TNBC and para-carcinoma tissues

表1 ICAM-1蛋白在TNBC及癌旁組織中的表達(dá)情況Tab. 1 expression of ICAM-1 in TNBC and para-carcinoma tissues［n(%)］

2.2 ICAM-1的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系

ICAM-1與淋巴轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)和TNM分期有關(guān)(P分別為0.036、0.027和0.048)，與腫瘤大小、臨床病理類型、脈管癌栓、Ki-67水平、p53和E-cadherin表達(dá)等無(wú)關(guān)(表2)。

表2 TNBC中ICAM-1蛋白的表達(dá)和臨床病理特征之間的關(guān)系Tab. 2 Association of ICAM-1 protein expression with the clinicopathological features in TNBC［n(%)］

2.3 ICAM-1與預(yù)后的關(guān)系

單因素分析顯示，ICAM-1蛋白的表達(dá)與無(wú)病生存時(shí)間(disease-free survival，DFS)相關(guān)，與(overall survival，OS)無(wú)關(guān)(圖2)。多因素分析顯示，ICAM-1蛋白的表達(dá)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響無(wú)疾病生存DFS的獨(dú)立預(yù)后因素(P＜0.05，表3、4)。

圖2 TNBC中ICAM-1的表達(dá)與DFS及OS之間的關(guān)系Fig. 2 Association of ICAM-1protein expression with DFS and OS in TNBC

表3 TNBC臨床病理特征和DFS的關(guān)系Tab. 3 Association of TNBC clinicopathological features with DFS

表4 Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型多因素分析影響DFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素Tab. 4 Cox proportional hazards model analysis the independent risk of DFS

3 討 論

乳腺癌是女性患者最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，并且其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。TNBC是乳腺癌的一種特殊類型，其復(fù)發(fā)率高，轉(zhuǎn)移早。由于TNBC的ER、PR和HER-2表達(dá)均陰性，內(nèi)分泌與靶向藥物均無(wú)用武之地，加上國(guó)際又無(wú)規(guī)范的化療方案可供臨床醫(yī)師參考，一直被看作是比較頑固的腫瘤，因此找到其相應(yīng)靶點(diǎn)就成為了一項(xiàng)難題。

ICAM-1基因定位于染色體19p13.2，編碼一種糖蛋白即ICAM-1蛋白，全長(zhǎng)532個(gè)氨基酸，分子量為80×103～100×103，主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞及免疫細(xì)胞的表面，它可以和淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(lymphocyte function-associated antigen-1，LFA1)即整合素CD11a/CD18或MAC(CD11b/CD18)相結(jié)合，也是鼻病毒的受體。

ICAM-1在促進(jìn)炎癥部位的黏連性、控制腫瘤惡化轉(zhuǎn)移及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。它通過(guò)與其受體的特異性結(jié)合，使白細(xì)胞、炎癥細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等與內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附作用增強(qiáng)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞活化，使它們更容易穿透內(nèi)皮。內(nèi)皮細(xì)胞上的細(xì)胞間黏附分子介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間或細(xì)胞與基質(zhì)間相互接觸和結(jié)合，從而參與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與活化、細(xì)胞組織生長(zhǎng)及分化、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、血管生成及腫瘤轉(zhuǎn)移等生理病理過(guò)程［1］。

ICAM-1在正常組織中一般呈低水平的表達(dá)，但在肺和腎臟組織中表達(dá)量較高。最近有研究發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)與很多惡性腫瘤相關(guān)，包括前列腺癌［7］和卵巢癌［8］。Hayes等［9］利用免疫組織化學(xué)法研究了300例人體正常的組織、癌組織及轉(zhuǎn)移組織，發(fā)現(xiàn)ICAM-1的表達(dá)與很多類型腫瘤相關(guān)，且在腫瘤的轉(zhuǎn)移中也扮演著重要的角色。另外，ICAM-1蛋白也被報(bào)道與某些腫瘤特定的臨床病理類型相關(guān)。

關(guān)于ICAM-1蛋白與TNBC的臨床病理特征之間的關(guān)系研究很少，因此，我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)法直接測(cè)定ICAM-1在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ICAM-1的表達(dá)癌組織中明顯高于癌旁組織，且與淋巴轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)和TNM分期有關(guān)，與腫瘤大小、臨床病理類型、脈管癌栓、Ki-67水平、p53和E-cadherin表達(dá)等無(wú)關(guān)。預(yù)后方面提示ICAM-1表達(dá)與無(wú)疾病生存DFS相關(guān)，ICAM-1高表達(dá)的患者PFS較低表達(dá)的患者短，但與OS無(wú)關(guān)，可能是由于我們的標(biāo)本數(shù)太少，乳腺癌5年生存率太高，隨訪截止時(shí)間期間未出現(xiàn)太多患者死亡，因此，我們也不將OS作為我們的研究終點(diǎn)。

本研究只是在組織標(biāo)本中檢測(cè)到ICAM-1的表達(dá)，后續(xù)試驗(yàn)還需要在TNBC細(xì)胞株中采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測(cè)ICAM-1 mRNA的表達(dá)及蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)及其敲出后對(duì)細(xì)胞行為學(xué)的影響，并在裸鼠成瘤模型上進(jìn)一步研究其參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制。ICAM-1有可能成為T(mén)NBC潛在的一個(gè)靶點(diǎn)。

［1］ 肖宇宏, 白 云, 宋 敏, 等. 內(nèi)毒素刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞免疫相關(guān)分子的表達(dá)［J］. 免疫學(xué)雜志, 2006, 22(2)： 124-128.

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Clinical signif i cance of ICAM-1 expression and its correlation with prognosis of triple-negative breast cancer

LIU Zimei, YU Wenxi, SUN Chu, YUAN Yuan, SHEN Zan (Department of Medical Oncology,

Shanghai Jiao Tong University Affiliated Sixth People’s Hospital, Shanghai 200233, China)

Background and purpose: Triple negative breast cancer (TNBC) is with high invasion, poor prognosis and lack of usefull treatment. This study investigated expression status of ICAM-1 protein in TNBC in order to explore its relationship with clinicopathological features and outcome in patients. Methods: Fifty-nine tissue samples of TNBC were collected while 50 cases of para-carcinoma tissue samples were used as negative controls. Immunohistochemical staining was conducted to detect expression level of ICAM-1 protein. The relationship of ICAM-1 protein expression with clinicopathological features (age, tumor size, subtype, grade, status of lymph node metastasis, TNM stage, vascular tumor thrombus, nerve inf i ltration, Ki-67, p53 and E-cadherin expression) and outcome in patients were analyzed. Results: The ICAM-1 protein expression of TNBC was signif i cantly higher than that in adjacent tissues (P=0.000). ICAM-1 expression was related to status of lymph node metastasis, grade and TNM stage (with a P-value of 0.036, 0.027 and 0.048, respectively), while demonstrated an undef i ned relationship with tumor size, subtype, vascular tumor thrombus and expression of Ki-67, p53 and E-cadherin. The disease-free survival (DFS) of ICAM-1 high expression set was shorter than that of the lower one but has nothing to do with overall survival (OS). In addition, Cox proportional hazards model showed that ICAM-1 expression and lymph node metastasis were independent risk factors of DFS in patients (HR=3.2, 95%CI: 1.6 to 6.4, HR=2.7, 95%CI: 1.28 to 5.9, P＜0.05). Conclusion: ICAM-1 could serve as a predictive factor for dif f erentiation status of TNBC. The high expression of ICAM-1 in TNBC may indicatepoorer prognosis.

Triple-negative breast cancer; Intercellular adhesion molecule-1; Immunohistochemistry; Prognosis

SHEN Zan E-mail: sshenzzan@vip.sina.com

10.19401/j.cnki.1007-3639.2017.02.007

R737.9

A

1007-3639(2017)02-0121-07

2016-08-08

2016-12-16）

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(30872991)。

沈 贊 E-mail：sshenzzan@vip.sina.com