倪煒華，鮑曉瑾，翁光燦，周燕

（嘉興市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，浙江嘉興 314000）

GPC凈化高效液相色譜法測(cè)定辣椒粉中蘇丹紅

倪煒華，鮑曉瑾，翁光燦，周燕

（嘉興市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，浙江嘉興 314000）

文章中建立了通過GPC凈化處理，應(yīng)用高效液相色譜法檢測(cè)辣椒粉中蘇丹紅的實(shí)驗(yàn)方法。樣品經(jīng)乙酸乙酯/環(huán)己烷（1∶1）提取，通過GPC分離凈化，濃縮后用乙腈定容，以0.1%甲酸的水溶液和乙腈（85∶15）以及0.1%甲酸的乙腈溶液和丙酮（80∶20）作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)高效液相色譜分離，紫外檢測(cè)器測(cè)定，外標(biāo)法定量。該方法在0.05～5.0mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均回收率為88.1%～98.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.90%～4.02%，檢出限為0.0054～0.0088mg/kg。該方法精密度好，靈敏度高，能簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地測(cè)定辣椒粉中的蘇丹紅（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ）殘留量。

GPC；高效液相色譜法；辣椒粉；蘇丹紅

蘇丹紅屬偶氮系列染料，是應(yīng)用廣泛的化工合成染色劑，主要應(yīng)用于蠟、油彩、汽油等工業(yè)領(lǐng)域，目前已確認(rèn)了有機(jī)偶氮染料的毒性，其大多數(shù)有致癌性［1］，包括蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ和蘇丹紅Ⅳ。它的化學(xué)成分中含有一種叫萘的化合物，該物質(zhì)具有偶氮結(jié)構(gòu)，由于這種化學(xué)結(jié)構(gòu)的性質(zhì)決定了它具有致癌性，對(duì)人體的肝腎器官具有明顯的毒性作用，在食品中禁止使用［2］。現(xiàn)有測(cè)定蘇丹紅的方法有很多，主要包括HPLC［3］、UPLC－MS［4，5］、酶聯(lián)免疫［6］以及流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法［7］等，但最常用的是高效液相色譜法（HPLC）。中國(guó)和歐盟［8］均頒布了HPLC測(cè)定食品中蘇丹紅的標(biāo)準(zhǔn)方法。國(guó)標(biāo)GB/T 19681－2005使用正己烷萃取，堿性氧化鋁凈化［9］，步驟繁瑣，且氧化鋁難以準(zhǔn)確控制活化程度的缺陷，造成方法重現(xiàn)性較差。本文采用GPC凈化，高效液相色譜-紫外檢測(cè)器進(jìn)行色譜分析，外標(biāo)法定量，測(cè)定辣椒粉中違禁使用的蘇丹紅，取得了滿意的效果，方法回收率范圍在88.1%～98.1%。同時(shí)，該方法操作簡(jiǎn)單，能有效去除雜質(zhì)干擾，滿足一般檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的檢測(cè)需求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與設(shè)備

Agilent 1200高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；全自動(dòng)固相萃取定量濃縮儀 德國(guó)LC Tech公司；電子天平；離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；氮吹儀美國(guó)Orgnomation公司；恒溫水浴振蕩器。

1.2 試劑與材料

蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ均購(gòu)自Dr.Ehrenstorfer公司，分別用乙腈配成100mg/L的儲(chǔ)備液，4℃保存，使用時(shí)根據(jù)需要配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液；乙酸乙酯、環(huán)己烷、乙腈、丙酮、甲酸均為HPLC級(jí)；水為超純水。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

色譜柱：色譜柱為Agilent公司的SB C18（150mm× 4.6mm，5μm）；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：20μL；流動(dòng)相A：0.1%甲酸的水溶液和乙腈（85∶15），B：0.1%甲酸的乙腈溶液和丙酮（80∶20）；流動(dòng)相梯度洗脫條件見表1。

表1 高效液相色譜分離梯度條件

檢測(cè)波長(zhǎng)：蘇丹紅Ⅰ，478nm；蘇丹紅Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，520nm。

1.4 樣品處理

1.4.1 提取

準(zhǔn)確稱取2g勻質(zhì)樣品（準(zhǔn)確到0.0001g）于離心管中，加入10mL乙酸乙酯/環(huán)己烷（1∶1），漩渦混合，超聲提取30min。8000r/min下離心10min，將上清液全部轉(zhuǎn)移至GPC進(jìn)樣瓶中。

1.4.2 凈化濃縮

GPC吸取5mL樣液進(jìn)行凈化，流速5mL/min，棄去前面1500s的淋洗液，收集接下來的600s淋洗液，最后用240s淋洗GPC柱，將收集液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。用1.00mL乙腈溶解殘?jiān)?，過0.22μm有機(jī)濾膜，供HPLC測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)選擇0.1%甲酸的水溶液和乙腈（85∶15）以及0.1%甲酸的乙腈溶液和丙酮（80∶20）作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ的保留時(shí)間適宜，峰形良好，且基線穩(wěn)定。為了使蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ的靈敏度足夠高，通過對(duì)蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行光譜掃描，最終確定蘇丹紅Ⅰ的檢測(cè)波長(zhǎng)為478nm，在蘇丹紅Ⅰ出峰之后，切換波長(zhǎng)至520nm，使蘇丹紅Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ在520nm下出峰。

2.2 提取條件的確定

實(shí)驗(yàn)選用乙酸乙酯/環(huán)己烷（1∶1）、乙腈、乙醇3種溶劑作提取劑，比較了3種溶劑的提取效率，經(jīng)過超聲提取，結(jié)果表明：提取效率相差不大，樣品中的蘇丹紅提取效率均可達(dá)90%以上?？紤]到過GPC用到的溶劑為乙酸乙酯/環(huán)己烷（1∶1），如果用乙腈或乙醇提取，還要進(jìn)行溶劑替換，增加了實(shí)驗(yàn)步驟，易造成損失。所以，本實(shí)驗(yàn)最后采用乙酸乙酯/環(huán)己烷（1∶1）作為提取劑。

2.3 GPC條件的選擇

將蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ混合標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)GPC柱，進(jìn)樣量為5mL，流動(dòng)相為環(huán)己烷/乙酸乙酯（1∶1），蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ的紫外掃描圖見圖1。

圖1 蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ色譜圖

由圖1可知，蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ的流出時(shí)間主要集中在25.5～34min，并采用分段收集，上液相檢測(cè)各階段蘇丹紅含量，最終選擇收集時(shí)間為25～35min，其余時(shí)間為丟棄時(shí)間。

圖2 未過GPC樣品圖

圖3 過GPC后樣品圖

由圖2和圖3可知，GPC凈化能夠有效去除辣椒粉中大量的脂肪及其他脂溶類物質(zhì)。樣品經(jīng)過GPC凈化后，可以有效去除樣品中雜質(zhì)，特別是蘇丹紅Ⅲ，保留時(shí)間附近經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)雜峰，容易發(fā)生誤判。GPC凈化后，可以有效去除這一問題，增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限

配制蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液100.0mg/L，并逐級(jí)稀釋成濃度分別為0.05，0.1，0.5，1.0，5.0mg/L系列的標(biāo)準(zhǔn)工作液，進(jìn)樣量為10μL。以所得峰面積對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度進(jìn)行回歸分析，線性關(guān)系良好。線性回歸方程式、線性相關(guān)系數(shù)和檢出限（S/N＝3）見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

2.5 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

以陰性辣椒粉樣品為基體，添加蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述方法及儀器條件進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加水平做6次平行，添加水平、平均回收率及精密度見表3。

表3 回收率及精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

續(xù) 表

由表3可知，辣椒粉中蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ含量檢測(cè)，添加水平在0.02，0.1，0.5mg/kg時(shí)，平均回收率為88.1%～98.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.90%～4.02%，符合相關(guān)規(guī)定要求。

3 結(jié)論

本文建立了運(yùn)用GPC凝膠凈化，高效液相色譜法檢測(cè)辣椒粉中蘇丹紅的方法。該方法前處理步驟少，提取效率高，定量限低，精密度和準(zhǔn)確度高，特別是可以有效去除雜質(zhì)干擾，增加結(jié)果的可靠性。

［1］Stiborova M，Martinek V，Rydlova H，et al.Sudan I is a potential carcinogen for humans evidence for its metabolic activation and detoxication by human recombinant cytochrome P450 1A1and liver microsomes［J］.Cancer Res.，2002，62（20）：5678-5684.

［2］賈濤.應(yīng)用液相色譜分析技術(shù)測(cè)定飼料中蘇丹紅含量的探討［J］.檢測(cè)技術(shù)，2013（4）：53-58.

［3］周建科，劉瑞英，李曉陽.山楂飴中蘇丹紅的高效液相色譜法測(cè)定［J］.現(xiàn)代食品科技，2009，25（2）：208-210.

［4］孫姝琦，田毅敏，杜振霞.超高效液相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用分析番茄醬中蘇丹紅i～iv含量［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2007，26：225-227.

［5］Hou X，Li Y，Cao S，et al.Analysis of para red and Sudan dyes in egg yolk by UPLC-MS-MS［J］.Chromatographia，2010，71（1）：135-138.

［6］Hu X，F(xiàn)an Y，Zhang Y，et al.Molecularly imprinted polymer coated solid-phase microextraction fiber prepared by surface reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization for monitoring of Sudan dyes in chilli tomato sauce and chilli pepper samples［J］.Anal.Chim.Acta.，2012，731：40-48.

［7］牛麗川，宋正華.流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定蘇丹紅Ⅰ［J］.分析化學(xué)，2009，37（A01）：209.

［8］Vérétout O，Demesse L，Szymanski L.Analysis and dosage of the colorants Sudan and Bixin in chili powder and pepper-based products［R］.Health ＆Consumer Protection Directorate-General，European Commission，News Notification：03/99.

［9］GB/T 19681－2005，食品中蘇丹紅染料的檢測(cè)方法高效液相色譜法［S］.

Determination of Sudan Red in Chili Powder after Purification with GPC by HPLC

NI Wei-hua，BAO Xiao-jin，WENG Guang-can，ZHOU Yan
（Jiaxing Institute for Food and Drug Control，Jiaxing 314000，China）

Establish a method to detect Sudan red in chili powder after purification with GPC by HPLC.The samples are extracted with ethyl acetate and cyclohexane（1∶1），separated and purified by GPC，after being concentrated to a definite volume with acetonitrile，with 0.1%formic acid water solution and acetonitrile（85∶15）and 0.1%formic acid in acetonitrile solution and acetone（80∶20）as mobile phase for gradient elution，with high performance liquid chromatography for separating，UV detector for determination and external standard method for quantitative analysis.The calibration curves show good linearity in the mass concentration range of 0.05～5.0mg/L，the average recoveries are from 88.1%to 98.1%and the relative standard deviations are from 0.90%to 4.02%，the limits of detection are 0.0054～0.0088mg/kg.This method is simple，rapid，sensitive and accurate for the determination of Sudan red（I，II，III，IV）residues in chili powder.

GPC；HPLC；chili powder；Sudan red

TS201.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.03.031

1000-9973（2017）03-0130-03

2016－09－14

倪煒華（1982－），男，浙江嘉興人，工程師，主要從事食品添加劑檢測(cè)方面的研究。