王韋崗，唐雙雙，陸源，朱新生

（鎮(zhèn)江市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，江蘇鎮(zhèn)江 212132）

固相萃取-在線光化學衍生-熒光檢測法同時測定辣椒制品中4種蘇丹紅染料

王韋崗，唐雙雙，陸源，朱新生

（鎮(zhèn)江市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，江蘇鎮(zhèn)江 212132）

建立了固相萃取-在線光化學衍生-熒光檢測法同時測定辣椒制品中蘇丹紅 Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，B的方法。用丙酮和乙腈的混合溶液（2∶8）提取樣品中4種蘇丹紅染料，提取液濃縮后經(jīng)C18固相萃取柱凈化，采用高效液相色譜進行分離，在線光化學衍生后進入熒光檢測器測定，外標法定量。結(jié)果表明：4種蘇丹紅在0.10～1.0μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999；低、中、高3個不同加標濃度下，4種蘇丹紅的回收率均大于85%，相對標準偏差為1.58%～4.36%；方法的檢出限（LOD）為0.30～0.45μg/kg，定量限（LOQ）為1.00～1.50μg/kg。該方法具有重現(xiàn)性好、靈敏度高、結(jié)果準確的特點，適用于食品中蘇丹紅殘留的分析檢測。

固相萃?。还饣瘜W衍生；高效液相色譜；熒光檢測法；蘇丹紅

蘇丹紅（Sudan dyes）又名油性紅、溶劑紅，是一類以苯基偶氮萘酚為主要基團的人工合成色素，主要用于石油、機油等工業(yè)溶劑中，起到增色作用［1］。由于用蘇丹紅染色后的食品顏色鮮艷且不易褪色，一些不法食品企業(yè)把蘇丹紅作為色素添加到食品中，然而這類化合物在降解過程中會產(chǎn)生苯胺和萘酚，具有致突變性和致癌性［2－4］，對人體的肝腎器官具有明顯的毒性作用，我國以及歐盟嚴令禁止其作為色素在食品中使用［5］。

國家標準GB/T 19681－2005采用高效液相色譜-紫外法測定食品中的蘇丹紅［6］，該方法靈敏度較低，在測定時需要切換掃描波長，不利于操作。熒光檢測法具有選擇性好、靈敏度高、檢出限低等優(yōu)點，在分析科學及其他相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越多［7－10］，而蘇丹紅的熒光響應(yīng)較低，以熒光檢測法測定時需要對其進行衍生，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂休^強熒光響應(yīng)的化學結(jié)構(gòu)，因此開展研究蘇丹紅分子的熒光性質(zhì)，利用其熒光現(xiàn)象建立蘇丹紅的檢測新方法具有重要的實際意義。本文采用C18固相萃取柱對樣品進行濃縮、凈化，建立了高效液相色譜分離-在線光化學衍生-熒光檢測法同時測定辣椒制品中蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，B的方法，該方法具有重現(xiàn)性好、靈敏度高、結(jié)果準確的特點，適用于食品中蘇丹紅殘留的分析檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器及設(shè)備

Waters e2695高效液相色譜儀（主要包括2475熒光檢測器、柱溫箱、自動進樣器等）；光化學衍生器（由紫外燈、聚四氟乙烯反應(yīng)管組成） 北京華安麥科生物技術(shù)有限公司；超生波清洗器；離心機；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；氮氣吹干儀；Millpore超純水系統(tǒng)；CNWBOND HC-C18（500mg/6mL）固相萃取柱 上海安譜科學儀器有限公司。

1.2 試劑

乙腈、甲醇和丙酮：色譜純，美國Tedia公司；無水硫酸鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水：Millpore超純水。

標準物質(zhì)：蘇丹紅Ⅰ（純度≥99.0%），蘇丹紅Ⅱ（純度≥99.0%），蘇丹紅Ⅲ（純度≥96.0%），蘇丹紅B（純度≥90.0%） 德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

1.3 分析測定條件

色譜柱：CNW Athena C18－WP（250mm×4.6mm，5μm）；流動相A為乙腈，B為甲醇，梯度洗脫：0～11min，100%A；11～12min，100%A～0%A，0%B～100%B，12～25min，100%B；流速：0.8mL/min；進樣體積：20μL；柱溫：30℃；熒光檢測器：激發(fā)波長310nm，發(fā)射波長348nm。

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品的提取

稱取2.0g試樣于50.0mL離心管中，加入5.0g無水Na2SO4，20.0mL丙酮-乙腈（2∶8）溶液，超聲提取20min，以5000r/min離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移至250mL雞心瓶中，殘留物用20.0mL丙酮-乙腈溶液重復(fù)提取1次，合并上清液，并在40℃水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約1mL，待凈化。

1.4.2 固相萃取柱富集凈化

C18固相萃取柱依次用5mL乙腈、5mL水進行活化和平衡，然后將上述待凈化液上樣過柱，用1mL丙酮-乙腈溶液潤洗雞心瓶，并將潤洗液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中，用5mL水淋洗，再用5mL丙酮-乙腈溶液進行洗脫，收集全部洗脫液，氮氣吹干，用丙酮-乙腈溶液重新定容至1mL，經(jīng)0.45μm濾膜過濾后進樣分析。

1.5 標準溶液的配制

分別準確稱取一定質(zhì)量的蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，B，加入少量丙酮超聲溶解后轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，用乙腈稀釋成濃度為0.10mg/mL的標準儲備液，放置于4℃冰箱中避光保存。臨用前，分別準確吸取一定體積的0.10mg/mL標準儲備液，用乙腈逐級稀釋到相應(yīng)濃度的混合標準溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 掃描波長的選擇

采用Waters 2475熒光檢測器自帶的3D掃描功能分別在波長200～340nm，330～600nm范圍內(nèi)掃描4種蘇丹紅光化學衍生產(chǎn)物的激發(fā)波長和發(fā)射波長，掃描結(jié)果見圖1。

圖1 4種蘇丹紅光化學衍生產(chǎn)物的（a）激發(fā)光譜和（b）發(fā)射光譜圖Fig.1（a）Excitation and（b）emission spectra of Sudan dyes after irradiation

由圖1可知，蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，B經(jīng)光化學衍生后其衍生產(chǎn)物的最佳激發(fā)波長分別為312，312，305，305nm；最佳發(fā)射波長均為348nm，因此本文選擇激發(fā)波長310nm、發(fā)射波長348nm作為掃描波長對4種蘇丹紅進行同時測定。

2.2 檢測方法的選擇

分別采用熒光檢測器和柱后光化學衍生-熒光檢測器對相同濃度的4種蘇丹紅混合標準溶液進行測定，測定結(jié)果見圖2。

圖2 光化學衍生前（a）、后（b）4種蘇丹紅混合標準溶液色譜圖Fig.2Chromatogram of the standard solution of Sudan dyes（a）before and（b）after irradiation

由圖2可知，采用熒光檢測器測定時，4種蘇丹紅僅表現(xiàn)出微弱的熒光響應(yīng)，不利于痕量組分含量的測定；經(jīng)光化學衍生后，4種蘇丹紅的熒光響應(yīng)大為增加，這是由于蘇丹紅是一類萘酚偶氮結(jié)構(gòu)型染料，其分子結(jié)構(gòu)中的偶氮基團具有光化學活性，在光照作用下能夠發(fā)生順式和反式結(jié)構(gòu)的互變［11］，甚至能夠與溶劑發(fā)生光化學反應(yīng)，從而導(dǎo)致偶氮化合物的性質(zhì)發(fā)生顯著的變化，生成具有較強熒光響應(yīng)的物質(zhì)。

2.3 流動相的選擇

分別以乙腈、甲醇、乙腈-水（98∶2）、甲醇-水（98∶2）、乙腈-甲醇（98∶2）為流動相等度洗脫，光化學衍生后測定，考察4種蘇丹紅的出峰及分離情況，結(jié)果見圖3。以乙腈為流動相時，4種蘇丹紅均能產(chǎn)生較強的熒光響應(yīng)，且4種蘇丹紅具有很好的分離度；以甲醇為流動相時，蘇丹紅Ⅰ和蘇丹紅Ⅱ僅有微弱的熒光響應(yīng)，響應(yīng)值較低，難以滿足蘇丹紅殘留的檢測要求，蘇丹紅Ⅲ和蘇丹紅B具有較強的熒光響應(yīng)，與乙腈為流動相相比其響應(yīng)值更高；以乙腈-水（98∶2）、甲醇-水（98∶2）、乙腈-甲醇（98∶2）為流動相時，蘇丹紅Ⅰ和蘇丹紅Ⅱ的熒光響應(yīng)均較弱，與未發(fā)生光化學衍生反應(yīng)測定的響應(yīng)值相近。上述實驗表明：蘇丹紅的光化學衍生反應(yīng)及反應(yīng)產(chǎn)物的熒光性質(zhì)與參加反應(yīng)的溶劑相關(guān)，蘇丹紅Ⅰ和蘇丹紅Ⅱ在純乙腈條件下才能發(fā)生光化學衍生反應(yīng)，當流動相中含有微量的水和甲醇時都會影響其光化學反應(yīng)；蘇丹紅Ⅲ和蘇丹紅B與甲醇和乙腈均能發(fā)生光化學反應(yīng)，微量的水不影響這兩者的光化學反應(yīng)，而且在甲醇流動相中兩者的光化學衍生產(chǎn)物的熒光響應(yīng)值更高，主要原因是隨著蘇丹紅Ⅲ和蘇丹紅B分子結(jié)構(gòu)中共軛體系的增大，分子極性減弱，從而在極性較弱的甲醇中表現(xiàn)出更強的熒光強度［12］。因此，分別選擇乙腈和甲醇為光化學反應(yīng)的溶劑，采用梯度洗脫的方法對4種蘇丹紅進行分離和測定。

圖3 流動相對4種蘇丹紅光化學衍生及分離度的影響Fig.3Effects of mobile phase on photochemical derivatization and resolution

2.4 樣品前處理條件的選擇

現(xiàn)有的國家標準測定蘇丹紅時通常采用乙腈直接提取或者氧化鋁層析柱凈化的方法進行樣品前處理［13，14］，而前者容易受到樣品基質(zhì)的影響，提取后存在大量的干擾物質(zhì)，影響目標物質(zhì)的定性和定量；后者處理方法較為繁瑣，氧化鋁的活性對方法回收率的影響很大?？瞻讟悠泛图訕藰悠凡捎肅18固相萃取柱凈化后測定的色譜圖見圖4。

圖4 （a）空白樣品（b）加標樣品的色譜圖Fig.4Chromatogram of（a）blank sample and（b）condiment sample spiked with Sudan dyes

由圖4可知，C18固相萃取柱對4種蘇丹紅具有很好的保留作用，以水為淋洗液可以一次性去除樣品中大部分水溶性干擾物質(zhì)，減少雜質(zhì)對蘇丹紅檢測結(jié)果的影響，同時采用C18固相萃取柱進行樣品前處理，對待測組分還具有濃縮和富集的作用，有利于降低待測組分的檢出限。

2.5 標準曲線、線性范圍及檢出限

分別準確吸取適量體積的蘇丹紅標準儲備液，用乙腈逐級稀釋成一定濃度的混合標準溶液，按上述優(yōu)化的實驗條件進行測定，以峰面積（y，μV·s）對質(zhì)量濃度（x，μg/mL）作圖，所得線性回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)（R2）見表1。向陰性火鍋底料樣品中添加低濃度水平的蘇丹紅混合標準溶液，按照上述方法進行樣品前處理后上機檢測，以S/N＝3為檢出限（LOD），S/N＝10為定量限（LOQ），結(jié)果見表1。

表1 方法的線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限（LOD）和定量限（LOQ）Table 1Linear ranges，regression equations，correlation coefficients，limits of detection and limits of quantitation of the method

由表1可知，采用外標峰面積法定量，4種蘇丹紅在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）大于0.999。與國標方法相比，可較好地減少樣品濃縮、凈化等樣品前處理過程帶來的誤差，該方法線性范圍寬，檢出限低，可滿足實際樣品的檢測。

2.6 回收率和精密度

向陰性火鍋底料樣品中分別加入低、中、高3種質(zhì)量濃度的蘇丹紅混合標準溶液，并以上述實驗方法進行樣品處理和測定，考察實驗方法的回收率，并對加標樣品重復(fù)測定6次，考察實驗方法的精密度。回收率和精密度結(jié)果見表2。

表2 樣品中蘇丹紅加標回收率和精密度實驗結(jié)果（n＝6）Table 2Recoveries and relative standard deviations of Sudan dyes in condiment（n＝6）

由表2可知，蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，B的回收率均在85%以上，相對標準偏差（RSD）為1.58%～4.36%。

3 結(jié)論

本文以C18固相萃取柱凈化樣品，富集蘇丹紅染料，并基于紫外光照射能夠增強蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，B的熒光響應(yīng)，建立了固相萃取-在線光化學衍生-熒光檢測法同時測定辣椒制品中4種蘇丹紅染料的方法。該方法能夠有效去除樣品中雜質(zhì)干擾，具有重現(xiàn)性好、靈敏度高、結(jié)果準確的特點，適用于食品中蘇丹紅殘留的分析檢測。

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Determination of Four Sudan Dyes in Chili Products by HPLC with On-line Photochemical Derivatization and Fluorescence Detection

WANG Wei-gang，TANG Shuang-shuang，LU Yuan，ZHU Xin-sheng
（Zhenjiang Center for Products Quality Supervision and Inspection，Zhenjiang 212132，China）

A method for the measurement of Sudan I，SudanⅡ，SudanⅢand Sudan B in chili products using high performance chromatography（HPLC）with on-line photochemical derivatization and fluorescence detection has been developed.The four kinds of Sudan dyes in samples are extracted by acetone/acetonitrile（2∶8）.The extract is purified by C18solid-phase extraction column and separated by HPLC.Sudan dyes are detected by fluorescence detection after on-line photochemical derivatization，and quantified by external standard method.The results show that the calibration curves for four kinds of Sudan dyes are linear in the range of 0.10～1.05μg/mL，with correlation coefficient（R2）more than 0.999.The recoveries of the standards spiked in real chili products samples for four kinds of Sudan dyes are above 85%，the relative standard deviation RSD（%）is 1.58%～4.36%.The limits of detection（LODs）are in the range of 0.30～0.45μg/kg and the limits of quantification（LOQs）are 1.00～1.50μg/kg.The developed method is simple，sensitive，with good repeatability and can be applied for the routine analysis of Sudan dyes in food.

solid-phase extraction；photochemical derivatization；HPLC；fluorescence detection；Sudan dyes

TS201.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.03.032

1000-9973（2017）03-0133-05

2016－09－14

王韋崗（1984－），男，工程師，碩士，主要從事食品檢測工作。