占文婷，胡思卓，黃倞文，焦順山

（上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院食品科學(xué)與工程系，上海 200240）

辣椒粉中還原型維生素C含量的測(cè)定

占文婷，胡思卓，黃倞文，焦順山＊

（上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院食品科學(xué)與工程系，上海 200240）

采用鉬藍(lán)比色法測(cè)定辣椒粉中還原型維生素C含量，重點(diǎn)探究鉬藍(lán)化合物的最佳吸收波長(zhǎng)、草酸-EDTA溶液中的EDTA-2Na最佳加入量以及水浴處理后的靜置時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。結(jié)果表明：采用鉬藍(lán)比色法測(cè)量辣椒粉中還原型維生素C的含量，鉬藍(lán)化合物的最佳吸收波長(zhǎng)為760nm，EDTA-2Na推薦加入量為0.075g/L，且水浴處理后無(wú)需靜置。優(yōu)化后的測(cè)定方法得到的維生素C標(biāo)準(zhǔn)曲線R2為0.97，還原型維生素C在0～0.04mg/mL內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，適合批量和少量樣品的測(cè)定。用此法測(cè)得的辣椒粉中還原型維生素C含量為4.12mg/g。

鉬藍(lán)比色法；辣椒粉；還原型維生素C；吸收峰；EDTA-2Na

維生素C，又名抗壞血酸，是一種水溶性維生素。還原型維生素C可以參與人體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)和芳香族氨基酸的代謝［1］，預(yù)防和治療缺鐵性及惡性貧血、壞血病、癌癥等疾?。?］，還能夠促進(jìn)膠原蛋白、細(xì)胞間質(zhì)的形成和類固醇的代謝以及抗衰老［3］，有利于維持細(xì)胞膜的完整性及骨骼、牙齒的正常功能，增強(qiáng)人體免疫功能。辣椒營(yíng)養(yǎng)豐富，富含各類維生素和礦物元素，尤其是維生素C，被譽(yù)為“蔬菜之冠”。辣椒粉是辣椒制品，是目前世界上使用最廣泛的調(diào)味品。根據(jù)2013修訂版《中國(guó)居民膳食營(yíng)養(yǎng)素參考攝入量》，中國(guó)居民膳食維生素C平均需要量在35～85mg/天。由于人體不能自身合成維生素C，所以必須從外界食物中或膳食補(bǔ)充劑中獲取?！吨袊?guó)食物成分表2015完整版》指出，在所有的食物中，甘肅蘭州的甜椒（脫水）中維生素C含量為8.46mg/g，在維生素C含量排行中位列第一。Daood等［4］報(bào)道新鮮辣椒中維生素C含量為3.2～4.5mg/g；吉雪花和陳于平的研究表明10個(gè)品種的制干辣椒維生素C含量分布在1.2～3.3mg/g。

還原型維生素C的測(cè)定方法一般有2，6-二氯靛酚法［5］、熒光光度法［6］、碘量法［7］、紫外分光光度法［8］等。但是由于辣椒粉溶液為黃色，2，6-二氯靛酚滴定法依賴溶液突變?yōu)槲⒓t色以確定滴定終點(diǎn)，難度系數(shù)很大；熒光比色法受光影響大，要求避光操作，因而復(fù)雜麻煩，同時(shí)吸光值易受色素影響，不適用含有類胡蘿卜素的辣椒粉；碘量法中碘易揮發(fā)，碘液需要標(biāo)定，且溶液與空氣接觸時(shí)間長(zhǎng)，易造成還原型維生素C被氧化；紫外分光光度法中沒(méi)有對(duì)維生素C進(jìn)行保護(hù)，得到數(shù)值普遍偏小，且操作麻煩［9，10］。鉬酸銨比色法主要是利用鉬酸銨在偏磷酸、硫酸的條件下與還原型維生素C反應(yīng)，生成不易受提取液顏色影響的鉬藍(lán)化合物，通過(guò)分光光度法可以測(cè)定還原型維生素C的含量；同時(shí)樣品中的還原糖及常見(jiàn)的還原物質(zhì)對(duì)于測(cè)定結(jié)果幾乎沒(méi)有干擾，結(jié)果準(zhǔn)確度高，且反應(yīng)顯色時(shí)間較短，操作較易。維生素C在果蔬中利用鉬藍(lán)比色法進(jìn)行測(cè)定的方法比較見(jiàn)表1。

表1 維生素C在果蔬中利用鉬藍(lán)比色法進(jìn)行測(cè)定的方法比較Table 1The comparison of molybdenum blue spectrometry methods for determining the content of VCin fruits and vegetables

續(xù) 表

已有相關(guān)研究利用鉬酸銨比色法測(cè)定維生素C含量，但是其中關(guān)于最大吸收波長(zhǎng)、試劑配制的報(bào)道都有所相異，在表1中對(duì)相關(guān)研究進(jìn)行了系統(tǒng)歸納整理；除此之外，水浴后靜置時(shí)間也各不相同。因此，本文對(duì)鉬酸銨比色法測(cè)定辣椒粉中還原型維生素C含量的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行研究和優(yōu)化，重點(diǎn)探究鉬藍(lán)化合物的最佳吸收峰波長(zhǎng)，草酸-EDTA溶液中的EDTA-2Na最佳加入量以及水浴處理后靜置時(shí)間對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響，以建立適合辣椒粉中還原型維生素C含量測(cè)定的鉬酸銨比色法的最佳條件。

1 測(cè)定原理

反應(yīng)方程式如上，其中，還原型維生素C脫掉2個(gè)氫原子，生成氧化型維生素C，正六價(jià)的鉬原子被還原為正五價(jià)的鉬原子，鉬酸銨被還原生成亮藍(lán)色的鉬藍(lán)絡(luò)合物，在分光比色法下可以測(cè)定參與反應(yīng)的還原型維生素C含量。

其中，鉬酸銨存在多種形式，反應(yīng)方程式中的鉬元素存在于正鉬酸根離子中，但是正鉬酸根離子（MOO4）2－穩(wěn)定存在于堿性環(huán)境中，仲鉬酸根離子（Mo7O24）6－則穩(wěn)定存在于酸性條件下，當(dāng)介質(zhì)由堿性變?yōu)樗嵝詴r(shí)，正鉬酸根離子（MOO4）2－會(huì)部分轉(zhuǎn)變?yōu)橹巽f酸根離子，具體轉(zhuǎn)變平衡過(guò)程如下［20］：

實(shí)驗(yàn)所加入的試劑為四水合七鉬酸銨（NH4）6Mo7O24·4H2O。實(shí)驗(yàn)測(cè)得：配制的鉬酸銨（七鉬酸銨）溶液pH為5.508；尚未加入鉬酸銨溶液的反應(yīng)體系pH為0.970；待充分混合后，反應(yīng)體系pH變?yōu)?.100；水?。?0℃，15min）后，反應(yīng)體系pH為1.167；再定容至25mL后，pH增大至1.286。可以看出，鉬酸銨溶液中鉬元素的存在形式會(huì)隨著反應(yīng)體系的pH進(jìn)行自動(dòng)調(diào)整，最初加入的試劑對(duì)于整體反應(yīng)并沒(méi)有影響。

反應(yīng)體系中的草酸作為介質(zhì)，pKa值為1.25，小于EDTA的pKa值1.78，所以草酸酸性更強(qiáng)；與EDTA-2Na反應(yīng)，強(qiáng)酸制弱酸，生成EDTA。

生成的EDTA利于絡(luò)合反應(yīng)體系中的金屬離子，從而還原型維生素C可全部與鉬酸銨進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，而多余的草酸和偏磷酸-乙酸溶液中的乙酸提供酸性條件，有利于穩(wěn)定維生素C及創(chuàng)造反應(yīng)環(huán)境。

EDTA的水溶性在25℃為0.5g/L，較難溶于水，EDTA-2Na在22℃的溶解度為10.8g/dL，相比EDTA，鈉鹽具有更好的水溶性，因此加入EDTA-2Na。由表1可知，實(shí)驗(yàn)方案中所配制的草酸-EDTA溶液中加入的EDTA-2Na量主要為0.075g和0.75g。1000mL溶液中，最大可溶解EDTA 0.5g，EDTA-2Na 108g。0.75g EDTA-2Na與草酸反應(yīng)過(guò)后，生成的EDTA為0.589g，大于EDTA溶解度0.5g；而0.5g EDTA最大溶解度對(duì)應(yīng)二水EDTA-2Na 0.637g。所以當(dāng)加入0.75g EDTA-2Na時(shí)，并不能完全溶解，在使用超聲波碎溶后，實(shí)驗(yàn)表明溶液仍會(huì)呈現(xiàn)出白色渾濁現(xiàn)象。

根據(jù)化學(xué)反應(yīng)方程式計(jì)算：反應(yīng)體系中，每加入1mg維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液，對(duì)應(yīng)需至少加入偏磷酸0.908mg，鉬酸銨（以鉬元素計(jì)算）0.136mmol，5%硫酸0.146mL。

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 材料與儀器

5%鉬酸銨溶液：準(zhǔn)確稱取5.00g鉬酸銨，用蒸餾水定容到100mL；草酸-EDTA溶液：6.30g草酸＋0.75g EDTA-2Na，用蒸餾水定容到1000mL；3%偏磷酸-乙酸溶液：偏磷酸3.00g＋冰醋酸48mL，溶解后用蒸餾水定容到100mL；標(biāo)準(zhǔn)維生素C溶液：準(zhǔn)確稱取抗壞血酸25mg，用適量草酸-EDTA溶液溶解，定容到25mL（現(xiàn)配現(xiàn)用）；5%（V/V）硫酸。

實(shí)驗(yàn)所用辣椒粉為陜西寶雞德有鄰食品有限公司標(biāo)細(xì)辣椒粉。酶標(biāo)儀（Multiskan GO 1510-01035）；離心機(jī)（Hermle Z 323KCentrifuge，HERMLE Labortechnik GmbH Siemensstr 25D-78564Wehingen，Germany）；四水合七鉬酸銨（NH4）6Mo7O24·4H2O和乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）、二水合草酸、偏磷酸和硫酸全部來(lái)自于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；抗壞血酸（維生素C）、乙酸（冰乙酸）購(gòu)于上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；所有試劑都為分析純（AR）級(jí)別。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

報(bào)道方法，準(zhǔn)確稱取1.50g的辣椒粉，加入草酸-EDTA溶液，用研缽搗碎后轉(zhuǎn)移入25mL容量瓶中，用草酸-EDTA溶液定容至25mL；搖勻后轉(zhuǎn)移至50mL圓底離心管中，25℃，5000r/min離心10min，取上清液為待測(cè)樣品的提取液。

分別吸取梯度體積的維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液（0，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00mL）或辣椒粉提取液1.00mL于25mL比色管中，加入4.00mL草酸-EDTA溶液、1.00mL 5%硫酸溶液和0.50mL 3%偏磷酸-乙酸溶液，混勻后加入2.00mL 5%鉬酸銨，振蕩均勻，放入30℃水浴鍋中水浴15min，顯色，用去離子水定容至25mL，在酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)下測(cè)量其吸光度。

3 結(jié)果與討論

為了檢測(cè)辣椒粉背景物對(duì)鉬藍(lán)比色法是否存在干擾，并對(duì)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以0（空白），0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00mL的維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液和1.00mL的辣椒粉提取液進(jìn)行以下各反應(yīng)條件的優(yōu)化。

3.1 吸收波長(zhǎng)的確定

取維生素C標(biāo)液（1mg/mL）1.00mL，采用實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行顯色；并在波長(zhǎng)200～1000nm用酶標(biāo)儀進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 鉬藍(lán)絡(luò)合物的吸收光譜曲線Fig.1Absorption spectrum curve of molybdenum blue complex

由圖1和數(shù)據(jù)分析可知，鉬藍(lán)絡(luò)合物在多處出現(xiàn)吸收峰；根據(jù)表1，鉬藍(lán)絡(luò)合物吸收波長(zhǎng)通常選定在243，700，705，760，839，850nm，其中760nm為最常使用的測(cè)量波長(zhǎng)。根據(jù)圖表分析（見(jiàn)圖1）和文獻(xiàn)記錄（見(jiàn)表1）的吸收峰波長(zhǎng)，選定吸收峰波長(zhǎng)243，682，760nm進(jìn)行進(jìn)一步系統(tǒng)研究。分別添加0，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00mL維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行反應(yīng)、顯色，在243，682，760nm處進(jìn)行光度測(cè)量及數(shù)據(jù)擬合。加入0.40mL維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)后，OD-243值已經(jīng)超出了酶標(biāo)儀檢測(cè)上限（實(shí)驗(yàn)所用Multiskan GO 1510-01035酶標(biāo)儀檢測(cè)上限為6），只有當(dāng)維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液和辣椒粉的維生素C提取液進(jìn)行更多倍的稀釋，OD-243才能控制在檢測(cè)范圍內(nèi)，同時(shí)誤差也會(huì)更大，因此不考慮鉬藍(lán)絡(luò)合物243nm處的測(cè)量。682，760nm處的分析數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

表2 不同波長(zhǎng)下的標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品中維生素C含量（n＝3）Table 2The standard curve and content of VCin samples at different wavelengths（n＝3）

觀察R2擬合度，OD-760的擬合度更好，同時(shí)760nm也更常見(jiàn)于研究分析中，最終本文采用760nm作為鉬藍(lán)化合物的測(cè)量波長(zhǎng)。

3.2 不同EDTA-2Na加入量的影響

分別吸取0，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00mL維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液加入25mL比色管中，采用實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行顯色并立即在波長(zhǎng)760nm處測(cè)量吸光度。由表1可知，文獻(xiàn)報(bào)道EDTA-2Na的加入量為0.075g/L或0.750g/L，為系統(tǒng)探究EDTA-2Na加入量對(duì)辣椒粉中還原型維生素C含量測(cè)定的影響，維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和草酸-EDTA溶液中的EDTA-2Na加入量選取0.050，0.075，0.100，0.300，0.750，1.000g/L，數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

表3 不同濃度EDTA溶液下的標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品中維生素C含量（n＝3）Table 3The standard curve and content of VCin samples with different concentration of EDTA（n＝3）

圖2 不同濃度EDTA溶液下樣品中維生素C含量走勢(shì)圖Fig.2The trend chart of VCcontent in samples with different concentration of EDTA

由表3可知，在顯著性水平P＝0.05時(shí)，不同EDTA-Na加入量（0.050，0.075，0.100，0.300，0.750，1.000g/L）對(duì)于檢測(cè)辣椒粉中還原型維生素C含量的測(cè)定沒(méi)有顯著性影響。且由圖2可知，這6個(gè)條件下測(cè)得的辣椒粉中還原型維生素C含量的變化趨勢(shì)平緩；0.075，0.300g/L EDTA-2Na加入量測(cè)得的辣椒粉中還原型維生素C含量較大。

由于加入EDTA-2Na的量對(duì)于辣椒粉中還原型維生素C含量的測(cè)定影響不顯著，而0.075g/L的EDTA-2Na加入量所測(cè)得辣椒粉中還原型維生素C含量較大，且0.075g/L的EDTA-2Na加入量已在很多蔬果還原型維生素C含量的測(cè)定中被應(yīng)用（見(jiàn)表1），所以最終選用0.075g/L的EDTA-2Na加入量完成草酸-EDTA溶液的配制。

3.3 水?。?0℃，15min）后靜置時(shí)間的影響

根據(jù)高俊鳳、吉雪花等和諶智鑫等的研究結(jié)果，選定水浴條件為30℃下水浴15min。劉紹俊等研究指出水浴后需靜置1h，而高俊鳳報(bào)道水浴后無(wú)需靜置。因此，為系統(tǒng)探究水浴后靜置時(shí)間對(duì)辣椒粉中還原型維生素C含量測(cè)定的影響，在水?。?0℃，15min）后分別靜置0，10，20，30min并在波長(zhǎng)760nm處測(cè)量吸光度，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 水?。?0℃，15min）后不同放置時(shí)間的吸光度（n＝3）Table 4The absorbance of different waiting time after water bathing（30℃，15min）（n＝3）

結(jié)果表明：該體系除了加入0.80mL標(biāo)準(zhǔn)維生素C溶液的反應(yīng)體系吸光值在10min后有所增大，其余組均無(wú)顯著性差異；同時(shí)所有擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2均在0.99以上，斜率和截距也幾乎一樣。表明水浴（30℃，15min）后靜置時(shí)間對(duì)于辣椒粉中還原型維生素C含量測(cè)定無(wú)顯著性影響。在Bajaj等、李軍［21］和李玉紅的研究中，都證明了反應(yīng)體系在沒(méi)有加入偏磷酸-乙酸溶液時(shí)需要1h才能使吸光值達(dá)到穩(wěn)定，在加入后，只需要15min就可以穩(wěn)定，且至少穩(wěn)定45min，這些結(jié)論與本文研究結(jié)果相一致。因此，水?。?0℃，15min）后直接測(cè)量反應(yīng)體系吸光度為最佳，不僅可以縮短測(cè)量時(shí)間，且不影響測(cè)量結(jié)果。

4 結(jié)論

本研究確定了利用鉬藍(lán)比色法測(cè)定辣椒粉中還原型維生素C含量的最佳測(cè)量條件：鉬藍(lán)絡(luò)合物的最佳吸收波長(zhǎng)為760nm，草酸-EDTA溶液中EDTA-2Na的最佳加入量為0.075g/L，且水浴處理后無(wú)需靜置即可測(cè)量實(shí)驗(yàn)中生成的鉬藍(lán)絡(luò)合物的吸光值。該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，適合測(cè)定辣椒粉等有色蔬果中還原型維生素C的含量。本研究測(cè)得所用辣椒粉中還原型維生素C的含量為4.12mg/g。

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Determination of the Reduced Vitamin C Content in Paprika

ZHAN Wen-ting，HU Si-zhuo，HUANG Jing-wen，JIAO Shun-shan＊
（Department of Food Science and Engineering，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200240，China）

Molybdenum blue spectrometry method is applied to determine the content of reduced vitamin C in paprika，the influence of absorption spectrum of molybdenum blue complex，additive amount of EDTA-2Na in oxalic acid solution and waiting time after water bathing is studied.The results show that the optimal absorption spectrum of molybdenum blue complex is 760nm，the suggested additive amount of EDTA-2Na is 0.075g/L and waiting is not needed after water bathing.By applying those optimal conditions，vitamin C standard curve＇s R2is 0.97，the method has a good linear relationship in the range of 0～0.04mg/mL.The method is simple，rapid，accurate as well as suitable for determining batched and small amount of samples.The content of reduced vitamin C in paprika is 4.12mg/g.

molybdenum blue spectrometry method；paprika；reduced vitamin C；absorption spectrum；EDTA-2Na

TS207.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.03.024

1000-9973（2017）03-0104-06

2016－09－11 ＊通訊作者

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（31401538）；教育部第48批留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金；上海交通大學(xué)青年教師科研啟動(dòng)基金

焦順山（1983－），男，河南新鄉(xiāng)人，副教授，博士，主要從事新型食品加工及貯藏技術(shù)方面的研究。