石征宇，易弋，蘇家敏，韋陽道，黎婭＊

（1.廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西柳州 545006；2.廣西科技大學廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西柳州 545006；3.廣西科技大學廣西高校糖資源加工重點實驗室，廣西柳州 545006）

產(chǎn)谷胱甘肽熒光假單胞菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

石征宇1，2，3，易弋1，2，3，蘇家敏1，2，3，韋陽道1，2，3，黎婭1，2，3＊

（1.廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西柳州 545006；2.廣西科技大學廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西柳州 545006；3.廣西科技大學廣西高校糖資源加工重點實驗室，廣西柳州 545006）

方法：在實驗室前期工作中，分離得到一株可生產(chǎn)谷胱甘肽（GSH）的熒光假單胞菌BJYG12，在單因素的基礎上，通過正交試驗對該菌株發(fā)酵生產(chǎn)GSH的條件進行了優(yōu)化。結(jié)果：發(fā)酵溫度28℃，初始pH 7.5，接種量5%，培養(yǎng)基含酵母膏25g/L，蔗糖15g/L，KH2PO41.5g/L，MgSO42.5g/L，優(yōu)化發(fā)酵條件后，菌株產(chǎn)GSH的能力增長了15.7%。

熒光假單胞菌；谷胱甘肽；GSH；優(yōu)化

谷胱甘肽（γ-L-谷氨?；?L-半胱氨?；拾彼幔?］，英文名稱為γ-L-glutamyl-cysteinyl-glycine，簡稱GSH），是一種含γ-酰胺鍵和巰基的三肽［2，3］，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成。谷胱甘肽分子結(jié)構(gòu)中的巰基能與蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基形成二硫鍵［4］，是一種特殊的抗氧化劑，具有清除氧自由基式、解毒和提高免疫等作用。臨床上，由于GSH強大的還原作用，也可用作肝病的改善［5］和治療以及化療和放療副作用的緩解［6］。在食品應用方面，GSH與肌苷酸（IMP）、鳥苷酸（GMP）及L-谷氨酸混合后有非常強的肉類風味［7，8］，是調(diào)味品和健康食品中的鮮味增強劑和營養(yǎng)強化劑。另外，GSH也被添加到保健品和化妝品中，用于人體的保健和美容［9］。目前，由于谷胱甘肽的產(chǎn)量受限而使其價格十分昂貴，因此，探索并建立谷胱甘肽的高效發(fā)酵技術(shù)具有重要的應用價值。

在已報道的文獻中，可發(fā)酵生產(chǎn)GSH的微生物主要以酵母菌為主，也有研究者嘗試利用重組大腸桿菌［10，11］生產(chǎn)GSH。另外，一些革蘭氏陽性菌如乳酸乳球菌［12］、藤黃八疊球菌［13］也可產(chǎn)GSH。也有研究指出熒光假單胞菌（Pseudomonassp.）可以生產(chǎn)GSH，但并未對其進行更深入的研究。本實驗室在前期研究過程中，分離獲得了一株產(chǎn)谷胱甘肽的熒光假單胞菌BJYG12［14］。作為原核生物，該菌株相對于酵母菌來說，具有營養(yǎng)需求簡單、生長周期短、易于基因改造等優(yōu)點，顯示出了較好的研究價值。本文對該菌發(fā)酵生產(chǎn)GSH的條件進行了優(yōu)化，為該菌株的進一步應用提供了部分理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

熒光假單胞菌BJYG12（Pseudomonassp.BJYG12）：由廣西科技大學生物與化學工程學院微生物研究室提供、分離并保藏。KB液體培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨20g，甘油10mL，K2HPO41.5g，MgSO4·7H2O 1.5g，pH調(diào)至7，蒸餾水定容到1L，121℃滅菌20min。

1.2 試驗方法

1.2.1 發(fā)酵流程

1.2.1.1 種子活化

取甘油法保藏的菌種10μL于3mL KB液體培養(yǎng)基中，放置在恒溫搖床中于30℃，120r/min培養(yǎng)48h。

1.2.1.2 種子培養(yǎng)

從種子活化培養(yǎng)基中取出100μL接種于裝有50mL KB液體培養(yǎng)基的三角瓶（250mL）中，放置于30℃恒溫搖床中120r/min培養(yǎng)24h，作為種子液。

1.2.1.3 發(fā)酵

取1mL種子液接種于50mL KB液體培養(yǎng)基（自然pH）的三角瓶（500mL）中，30℃，160r/min培養(yǎng)30h。然后測定下列指標：生物量，取10mL發(fā)酵液離心洗滌，于烘箱中80℃烘干至恒重稱重；GSH含量，采用DTNB法測定其GSH含量［15］。DTNB（5，5-二硫雙-（2-硝基苯甲酸）能和巰基反應生成TNB（5-硫代-2-硝基苯甲酸），TNB在紫外412nm處有最大吸收且30min內(nèi)有穩(wěn)定的性質(zhì)，測定其412nm處的分光光度值進而計算巰基物質(zhì)的量。

1.2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.2.2.1 培養(yǎng)溫度、初始pH及接種量

根據(jù)1.2.1所述，分別改變培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH及接種量進行單因素試驗。

1.2.2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化

碳源的選擇：在1.2.2.1的基礎上，以葡萄糖、蔗糖、乳糖代替KB培養(yǎng)基中的甘油，按1.2.1所述進行發(fā)酵，優(yōu)化碳源及其濃度。

氮源的選擇：在1.2.2.1的基礎上，用有機氮源及無機氮源代替KB培養(yǎng)基中的牛肉膏蛋白胨，按1.2.1所述進行發(fā)酵，優(yōu)化氮源及其濃度。

KH2PO4的選擇：在1.2.2.1的基礎上，用KH2PO4替換KB培養(yǎng)基中的K2HPO4，按1.2.1所述進行發(fā)酵，優(yōu)化磷酸鹽濃度。

硫酸鎂的選擇：在1.2.2.1的基礎上，調(diào)整KB培養(yǎng)基中的MgSO4濃度，按1.2.1所述進行發(fā)酵，優(yōu)化MgSO4濃度。

正交試驗：在1.2.2.1的基礎上，以最優(yōu)碳源、氮源、磷酸鹽和MgSO44個因素為考察指標，進行四因素三水平的正交試驗，對培養(yǎng)基成分進行進一步優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)溫度、初始pH及接種量

2.1.1 培養(yǎng)溫度

按照1.2.1的發(fā)酵流程，分別在26，28，30，32，34℃下考察最適溫度，結(jié)果見圖1。

圖1 培養(yǎng)溫度對GSH含量的影響

由圖1可知，BJYG12在28℃下的GSH產(chǎn)量最高，因此選擇28℃進行后續(xù)試驗。

2.1.2 初始pH

在KB培養(yǎng)基的基礎上，利用低濃度HCl和NaOH調(diào)節(jié)KB培養(yǎng)基的初始pH至6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，考察發(fā)酵液初始pH對GSH產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 初始pH對GSH含量的影響

由圖2可知，pH為7.5時GSH的產(chǎn)量明顯高于其他條件。pH為8.0時GSH含量突然下降，說明菌株對堿性條件較為敏感。

2.1.3 接種量

將種子液分別按1%，3%，5%，10%，15%的接種量接種于KB培養(yǎng)基中，考察接種量對GSH產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 接種量對GSH含量的影響

由圖3可知，接種量在1%～5%范圍內(nèi)，GSH含量波動不大，5%時GSH的產(chǎn)量最高。

2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化

培養(yǎng)基成分與其濃度對菌體的生長和產(chǎn)GSH能力有著重要的影響，因此，在2.1中的最優(yōu)發(fā)酵條件下以KB培養(yǎng)基為基礎，考察最優(yōu)碳源、氮源、磷酸鹽和硫酸鎂以及它們的最佳濃度，最后利用正交試驗對培養(yǎng)基組分進行再次優(yōu)化。

2.2.1 碳源及其最佳濃度

查看伯杰氏手冊可知，在常見的碳源中熒光假單胞菌可利用葡萄糖、蔗糖和乳糖，因此選擇這3種糖替代培養(yǎng)基中的甘油，按所述的發(fā)酵流程進行發(fā)酵，結(jié)果見圖4。

圖4 不同碳源對GSH含量和生物量的影響

由圖4可知，甘油和乳糖所對應的生物量和GSH含量較葡萄糖和蔗糖低很多。雖然蔗糖所對應的生物量較葡萄糖高約5%，但是葡萄糖所對應的GSH含量比蔗糖的高約25%，故選擇葡萄糖作為最優(yōu)碳源。

為了進一步了解葡萄糖濃度對GSH產(chǎn)量的影響，以不同濃度的葡萄糖（10，15，20，25，30，35g/L）來代替KB培養(yǎng)基中的碳源進行發(fā)酵，結(jié)果見圖5。

圖5 不同葡萄糖濃度對生物量及GSH含量的影響

由圖5可知，不同濃度的葡萄糖可使GSH含量和生物量有較大范圍的變化，二者的變化趨勢一致。當葡萄糖濃度為20g/L時所對應的生物量和GSH產(chǎn)量最高。

2.2.2 氮源及其最佳濃度

在此部分試驗中，選擇常見的有機氮源（蛋白胨、酵母膏、牛肉膏）和無機氮源（尿素、硝酸銨、氯化銨），等量替換KB培養(yǎng)基中的氮源，按1.2.1的發(fā)酵流程進行發(fā)酵，通過比較生物量和GSH含量確定最優(yōu)氮源后，再對其濃度進行進一步，優(yōu)化結(jié)果見圖6和圖7。

圖6 不同氮源對生物量和GSH含量的影響

由圖6可知，菌株BJYG12對有機氮源的利用遠遠大于無機氮源，在有機氮源中酵母膏所對應的生物量和GSH含量最高。

圖7 不同濃度的酵母膏對生物量和GSH含量的影響

由圖7可知，當酵母膏濃度小于20g/L時，所對應的生物量和GSH含量隨酵母膏濃度的增加而增加；當酵母膏濃度大于20g/L時，其生物量趨于平穩(wěn)而GSH含量迅速下降，故選擇酵母膏濃度20g/L為最佳濃度。

2.2.3 KH2PO4濃度的確定

配制不同KH2PO4濃度（1，2，3，4，5g/L）的KB培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，結(jié)果見圖8。

圖8 不同濃度KH2PO4所對應的生物量和GSH含量

由圖8可知，生物量和GSH含量隨KH2PO4濃度增加而呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，在濃度為2g/L時生物量和GSH含量均達到最高。

2.2.4 硫酸鎂濃度的確定

配制不同濃度的MgSO4（1，2，3，4，5g/L）且KB培養(yǎng)基中的其他成分不變配制培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH 7.5，滅菌，按1.2.1的發(fā)酵流程，選出最適MgSO4濃度，結(jié)果見圖9。

圖9 不同濃度硫酸鎂對GSH含量和生物量的影響

由圖9可知，隨MgSO4濃度的增加，生物量和GSH含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在2g/L時生物量和GSH含量均相對較高。

2.2.5 正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)基

在單因素的基礎上，采用正交試驗對葡萄糖、酵母膏、磷酸鹽和硫酸鎂的濃度進行進一步的優(yōu)化，選用L9（43）正交表，其因素水平見表1，試驗結(jié)果見表2。

表1 正交試驗因素水平表 g/L

表2 正交試驗結(jié)果

由表2可知，最優(yōu)組合為：B3A2C1D3，即葡萄糖25g/L，酵母膏20g/L，MgSO42.5g/L，KH2PO41.5g/L。采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進行發(fā)酵，測得GSH含量和生物量分別為26.13mg/L和4.339g/L（初始培養(yǎng)基分別為22.58mg/L和3.044g/L），表明優(yōu)化后的培養(yǎng)基較原始培養(yǎng)基GSH含量提高了約15.7%，生物量提高了約42.5%，由此可見優(yōu)化培養(yǎng)基對提高GSH含量是有利的。

3 結(jié)論與討論

目前，在利用發(fā)酵法生產(chǎn)GSH的研究中，所使用的菌種主要是酵母菌，發(fā)酵終濃度一般在100～300mg/L左右［16，17］，很少使用細菌。雖然目前使用細菌發(fā)酵法生產(chǎn)GSH的產(chǎn)量較酵母菌低，但細菌較酵母具有生長快，營養(yǎng)需求簡單，易于基因改造等優(yōu)點，顯示出較好的研究前景。

MgSO4并不是常見的調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的鹽成分，本試驗發(fā)現(xiàn)Mg2＋濃度對該菌株產(chǎn)谷胱甘肽有一定影響，可能是因為Mg2＋通過影響谷胱甘肽代謝相關(guān)酶的活力從而影響谷胱甘肽的產(chǎn)量，這與丁燏在南極硅藻［18］產(chǎn)谷胱甘肽研究中結(jié)果一致，谷胱甘肽的含量都呈現(xiàn)出隨Mg2＋濃度的升高而出現(xiàn)先增加而后降低的現(xiàn)象。

pH值是影響生物代謝和各種酶活力的又一重要因素，本試驗結(jié)果表明：熒光假單胞菌產(chǎn)谷胱甘肽的最適pH為7.5，而衛(wèi)功元等研究產(chǎn)朊假絲酵母產(chǎn)谷胱甘肽的最適pH為5.5［19］，這與酵母菌喜歡偏酸環(huán)境的特性相關(guān)。

此外，本試驗通過培養(yǎng)基成分優(yōu)化得出無機氮源不利于該菌株產(chǎn)谷胱甘肽，可能是因為該菌株利用無機氮源的能力較弱，這與聶敏等研究氮源對產(chǎn)朊假絲酵母合成谷胱甘肽的影響結(jié)果不同［20］，其研究結(jié)果為有機氮源和無機氮源對該菌產(chǎn)谷胱甘肽的能力影響相差無幾。

本試驗最終結(jié)果表明熒光假單胞菌產(chǎn)谷胱甘肽的最適溫度為28℃，最適pH為7.5，最佳接種量為5%，通過對培養(yǎng)條件的優(yōu)化和最適培養(yǎng)基濃度的確定，設計四因素三水平的正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)基，優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成為葡萄糖25g/L，酵母膏20g/L，KH2PO41.5g/L，MgSO42.5g/L。在優(yōu)化后的條件下進行發(fā)酵，GSH含量為26.13mg/L，較初始培養(yǎng)基提高了約15.7%。

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Optimization of the Fermentation Condition ofPseudomonas fluorescensProducing Glutathione

SHI Zheng－yu1，2，3，YI Yi1，2，3，SU Jia-min1，2，3，WEI Yang-dao1，2，3，LI Ya1，2，3＊
（1.College of Biological and Chemical Engineering，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，China；2.Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，China；3.Key Laboratory for Processing of Sugar Resources in Guangxi Higher Education Institutes，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，China）

Methods：During the previous work of the laboratory，a strain ofPseudomonasfluorescensBJYG12is separated，which has the ability to produce glutathione.On the basis of single factor，the fermentation condition ofPseudomonasfluorescensstrain producing glutathione is optimized by the orthogonal test.Results：The fermentation temperature of 28℃，original pH of 7.5，inoculum concentration of 5%，culture medium containing yeast extract of 25g/L，sucrose of 15g/L，KH2PO4of 1.5g/L，MgSO4of 2.5g/L.After promoting the fermentation condition，the capacity of strain producing GSH increases by 15.7%.

Pseudomonasfluorescens；glutathione；GSH；optimization

TS201.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.03.008

1000-9973（2017）03-0031-05

2016－09－15 ＊通訊作者

廣西科學基金（2014GXNSFAA118086）；廣西科學基金（2015GXNSFBA139068）

石征宇（1990－），男，河南新鄉(xiāng)人，碩士，研究方向：微生物分子生物學；黎婭（1980－），女，助理研究員，碩士，研究方向：微生物學。