谷奕諾 吳艷玲

(延邊大學藥學院，吉林 延吉 133002)

高良姜素對哮喘小鼠氣道炎癥及腫瘤壞死因子-α表達的影響

谷奕諾 吳艷玲

(延邊大學藥學院，吉林 延吉 133002)

目的 探討高良姜素對哮喘小鼠氣道炎癥及腫瘤壞死因子(TNF)-α表達的影響。方法 40只小鼠隨機分為正常對照組、哮喘組、地塞米松組、高良姜素組。卵白蛋白致敏并激發(fā)建立小鼠哮喘模型，計數(shù)支氣管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒細胞，觀察支氣管肺組織病理的改變，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測血清TNF-α的水平，Western印跡法檢測肺組織TNF-α 蛋白的表達。結(jié)果 高良姜素組BALF中嗜酸粒細胞計數(shù)及肺內(nèi)炎癥細胞評分明顯低于哮喘組(P<0.01)；哮喘組血清TNF-α含量、肺組織TNF-α 蛋白表達均顯著高于正常對照組，高良姜素組上述指標均低于哮喘組(P<0.01)。結(jié)論 高良姜素可降低哮喘小鼠TNF-α的表達，減輕哮喘小鼠氣道炎癥。

哮喘；高良姜素；腫瘤壞死因子-α

哮喘是一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為特征的變態(tài)反應(yīng)性疾病為發(fā)病機制并未完全闡明，普遍認為炎癥細胞在氣道的浸潤及其分泌的炎癥介質(zhì)介導了哮喘的炎癥過程〔1〕。研究表明腫瘤壞死因子(TNF)-α是介導其炎癥發(fā)生的重要因素〔2〕。目前，糖皮質(zhì)激素仍是哮喘治療的一線藥物，但因長期應(yīng)用存在的不良反應(yīng)，開發(fā)新的抗哮喘藥物十分必要。高良姜素(3,5,7-三羥基黃酮)是一種黃酮類化合物，廣泛存在于高良姜和蜂膠中，具有多種藥理學活性，如抗腫瘤、抗微生物、抗感染、抗氧化等〔3～5〕。研究表明，高良姜素可通過阻斷組胺的釋放及包括TNF在內(nèi)的炎癥介質(zhì)表達而下調(diào)肥大細胞源性過敏性炎癥〔6〕，但高良姜素對哮喘的治療作用及機制并不很清楚。本研究應(yīng)用高良姜素干預卵白蛋白(OVA)誘導的過敏性哮喘小鼠模型，探討其對哮喘氣道炎癥的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：清潔級8～10周齡(體重20～24 g)的雌性BALB/c小鼠40只，購自吉林大學白求恩醫(yī)學部動物室。試劑：高良姜素(Sigma公司)、OVA(Sigma公司)、氫氧化鋁凝膠(Sigma公司)、小鼠TNF-α酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測試劑盒(武漢博士德生物有限公司)、TNF-α抗體(Cell Signaling公司)。設(shè)備：超聲霧化器(德國百瑞公司)、Olympus顯微鏡(日本Olympus公司)、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(Bio-rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 哮喘模型的建立及分組 將小鼠隨機分為4組：正常對照組、哮喘組、地塞米松組、高良姜素組，每組10只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。哮喘組：于實驗第0、7、14天致敏，腹腔注射1 mg氫氧化鋁乳化的OVA 20 μg。在第21～23天激發(fā)，以超聲霧化器霧化3% OVA鹽水氣溶膠吸入，1次/d，30 min/次。地塞米松組及高良姜素組：哮喘模型建立同哮喘組，但于每次激發(fā)前3 h，分別腹腔注射高良姜素(10 mg/kg)和地塞米松(2 mg/kg)。正常對照組：腹腔注射及霧化時均給予同體積生理鹽水。于末次激發(fā)后24 h處死小鼠，取血、支氣管肺泡灌洗液及肺組織。

1.2.2 支氣管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒細胞計數(shù) 各組小鼠BALF低速離心10 min，沉渣以1 ml的Hanks液重懸，取0.1 ml重懸液涂片做吉姆薩染色，計數(shù)至少200個細胞做嗜酸性粒細胞計數(shù)。

1.2.3 肺組織病理學檢查 取小鼠左肺組織以10%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水石蠟包埋切片，做蘇木素-伊紅(HE)染色，乙醇脫水，透明封片，鏡檢觀察肺組織的炎性浸潤情況。以Myou等〔7〕制定的5分評分系統(tǒng)為標準半定量評定支氣管周圍炎癥細胞浸潤程度，根據(jù)支氣管周圍炎性細胞的多少評分，評判標準：無炎性細胞環(huán)繞(0分)；少量炎性細胞環(huán)繞(1分)； 1個細胞層厚度的炎性細胞環(huán)繞(2分)； 2～4個細胞層厚度炎性細胞環(huán)繞(3分)；多于4個細胞層厚度的炎性細胞環(huán)繞(4分)。

1.2.4 ELISA法檢測血清TNF-α 末次霧化激發(fā)24 h后麻醉小鼠，摘眼球取血約500 μl，2 000 r/min離心2～3 min，取上清即為血清。根據(jù)ELISA檢測試劑盒的說明書操作，測定各組小鼠血清中TNF-α含量。

1.2.5 Western印跡法檢測肺組織TNF-α的表達 提取各組小鼠肺組織的總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜1 h后洗滌，分別加1∶1 000稀釋的兔抗TNF-α抗體、兔抗β-actin抗體(1∶500)，4℃孵育過夜。將 PVDF 膜洗滌后，將其浸泡于二抗中，室溫下?lián)u床搖蕩1 h。再次洗膜，ECL 試劑盒化學發(fā)光法顯示蛋白條帶，圖像分析軟件測定蛋白條帶的吸光度(A) 值。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠BALF中嗜酸性粒細胞計數(shù)及肺內(nèi)炎癥細胞評分比較 哮喘組BALF中嗜酸性粒細胞數(shù)目及炎癥細胞評分較其他各組顯著升高(P<0.01)。高良姜素組與地塞米松組比較差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

2.2 各組小鼠肺組織HE染色的改變 鏡下可見正常對照組肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡間隔無水腫增厚及炎性細胞浸潤；哮喘組肺泡結(jié)構(gòu)破壞，支氣管及血管周圍可見大量炎性細胞浸潤，肺泡間隔明顯增寬；地塞米松組及高良姜素組較哮喘組支氣管及血管周圍炎性細胞浸潤明顯減少，肺泡壁未見明顯增厚(見圖1)。

表1 各組小鼠BALF中嗜酸性粒細胞計數(shù)及 肺內(nèi)炎癥細胞評分

與正常對照組比較:1)P<0.01；與哮喘組比較:2)P<0.01

圖1 高良姜素對哮喘小鼠肺組織HE染色的影響(×200)

2.3 各組小鼠血清TNF-α水平比較 哮喘組血清TNF-α水平(195.66±14.64)pg/ml明顯高于正常對照組(117.67±15.82)pg/ml(P<0.01)；高良姜素組(144.05±9.54)pg/ml低于哮喘組(P<0.01)。高良姜素組與地塞米松組(137.00±12.12)pg/ml差異無統(tǒng)計學意義。

2.4 各組小鼠肺組織TNF-α蛋白表達的變化 哮喘組肺組織TNF-α蛋白表達水平(1.85±0.39)明顯高于正常對照組(1.0)(P<0.01)；高良姜素組(1.49±0.31)低于哮喘組(P<0.01)。高良姜素組與地塞米松組(1.36±0.29)差異無統(tǒng)計學意義。見圖2。

圖2 各組小鼠肺組織TNF-α蛋白表達的變化

3 討 論

哮喘是一種以氣道高反應(yīng)性為主要特征的氣道慢性非特異性炎癥性疾病，多種炎癥細胞及炎癥介質(zhì)介導了哮喘的發(fā)生發(fā)展過程。嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和肥大細胞等炎癥細胞浸潤是哮喘氣道炎癥的實質(zhì)，而嗜酸性粒細胞反應(yīng)又是其中的關(guān)鍵特征。嗜酸性粒細胞通過釋放前炎癥介質(zhì)、細胞毒性介質(zhì)和細胞因子而調(diào)節(jié)氣道炎癥和重塑過程的啟動。本實驗結(jié)果與之前的相關(guān)研究結(jié)果一致〔8〕，表明高良姜素具有減輕OVA誘導的哮喘小鼠氣道炎癥的作用。

TNF-α是一種具有多種生物學效應(yīng)的前炎癥細胞因子，主要由單核-巨噬細胞分泌，與機體的炎癥、免疫反應(yīng)有著十分密切的關(guān)系〔2〕。Farjadian等〔9〕報道哮喘患兒血清TNF-α水平明顯高于正常對照組，經(jīng)天然抗炎癥藥物如ω-3治療后，哮喘患兒肺功能明顯好轉(zhuǎn)的同時血清TNF-α水平較治療前下降，提示藥物可能通過調(diào)節(jié)TNF-α的表達起到抗哮喘的作用。本研究結(jié)果表明TNF-α參與了哮喘的發(fā)病。

研究表明，高良姜素可以有效抑制臭氧所致慢性阻塞性肺疾病小鼠氣道炎癥的發(fā)生，降低血清中TNF-α等炎癥因子的水平〔10〕。另有學者研究顯示高良姜素可以減輕哮喘小鼠的氣道高反應(yīng)性，降低支氣管肺泡灌洗液中白細胞介素(IL)-4、-5、-13的水平，其可能的作用機制是通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB通路〔9〕。本實驗結(jié)果提示高良姜素減輕哮喘氣道炎癥的可能機制包括對TNF-α表達的影響。

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〔2016-10-25修回〕

(編輯 郭 菁/滕欣航)

吳艷玲(1977-)，女，副教授，博士，碩士生導師，主要從事中藥藥理學研究。

谷奕諾(1995-)，男，在讀本科，主要從事呼吸藥理學研究。

R562.2+5

A

1005-9202(2017)05-1096-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.025