張 濱 黃旭明 張明興 石藝華 陳碧珊

(廣東藥科大學附屬第一醫(yī)院康復醫(yī)學科，廣東 廣州 510600)

大鼠脊髓損傷后自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3表達的變化

張 濱 黃旭明 張明興 石藝華 陳碧珊

(廣東藥科大學附屬第一醫(yī)院康復醫(yī)學科，廣東 廣州 510600)

目的 探討大鼠脊髓損傷(SCI)后自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3的表達變化對自噬發(fā)生的影響。方法 構(gòu)建大鼠脊髓橫斷損傷模型，分別于損傷后0、4、12 h及1、3、5、7 d通過BBB評分評定SCI大鼠的行為學變化，同時經(jīng)Western印跡檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3的表達；并通過腹腔注射自噬抑制劑3-MA和自噬促進劑Rapamycin于SCI小鼠模型，分別于上述時間點通過Western印跡進行Beclin1、LC3的檢測，初步探討自噬抑制劑和自噬促進劑在SCI后對自噬相關(guān)蛋白表達變化的作用。結(jié)果 隨著大鼠SCI時間的延長，運動逐漸消失，SCI后3 d大鼠出現(xiàn)無運動現(xiàn)象，之后隨著大鼠SCI時間的延長行為逐漸恢復；自噬相關(guān)蛋白Beclin1和 LC3的表達量隨著SCI時間的延長逐漸升高，于3 d左右表達量顯著升高(P<0.01)達到峰值；隨后其表達量隨SCI時間的延長呈現(xiàn)下降的趨勢；Rapamycin作用大鼠后Beclin1和LC3的表達量與對照組相比顯著增高，于3 d達到極顯著水平(P<0.001)；3-MA作用大鼠后Beclin1和LC3的表達量與對照組相比顯著降低(P<0.001)。結(jié)論 Rapamycin能夠促進SCI后自噬相關(guān)蛋白Beclin1和 LC3的表達，最終引發(fā)自噬的發(fā)生，而3-MA能夠抑制Beclin1和 LC3的表達，阻止SCI后自噬現(xiàn)象的發(fā)生。

脊髓損傷；自噬；Beclin1；LC3；Rapamycin；3-MA

脊髓損傷(SCI)包括原發(fā)性SCI和繼發(fā)性SCI，繼發(fā)性SCI除了加重SCI外，神經(jīng)元水腫、變性和壞死現(xiàn)象也明顯加重〔1〕。繼發(fā)性SCI主要是由于神經(jīng)元的凋亡及膠質(zhì)細胞過度增殖，這一系列病理變化嚴重阻礙了軸突的再生，進而影響神經(jīng)功能的恢復〔2〕。自噬作為生物進程中的一種動態(tài)現(xiàn)象，像LC3和Beclin1這些單純自噬體表達的增多，并不能對自噬完全發(fā)生作很好的解釋。不管是自噬體的融合機制被破壞還是相關(guān)溶酶體的失活都可以引發(fā)機體內(nèi)自噬體的異常升高，但自噬活性卻尚未激活〔3〕。完整自噬流的發(fā)生還需要對自噬底物像p62進行檢測，理論上其表達量的高低與自噬現(xiàn)象的發(fā)生密切相關(guān)，隨自噬的增強而呈下降趨勢。只有當自噬底物的減少與自噬體的增多同時發(fā)生時才能證實自噬的發(fā)生。本研究在前人研究的基礎上通過構(gòu)建大鼠脊髓橫斷損傷模型，初步探討自噬抑制劑和自噬促進劑在SCI后對自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3表達變化的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠(廣東藥科大學實驗動物中心提供)84只，體重(230±18)g，隨機分成對照組(0 h)和實驗組(SCI組)，實驗組依照SCI后的時間依次劃分為損傷后4、12 h及1、3、5、7 d組，每組12只。整個實驗過程中室溫飼養(yǎng)，大鼠自由進食和飲水。

1.2 實驗動物模型的制備 參照文獻制備大鼠SCI模型〔3〕，采用復合麻醉方法：復合麻醉劑(即水合氯醛 4.25 g，硫酸鎂2.12 g，戊巴比妥鈉 886 mg，無水乙醇 33.8 ml，雙蒸水定容至100 ml)3 ml/kg ，以T8棘突為中心，切取背部正中切口，暴露 T6～T10棘突及椎板，通過使用手術(shù)鉗除去 T8～T10棘突及全椎板，以脊髓為中心對直徑約 5 mm的圓形區(qū)進行暴露，采用10 g沖擊棒，使圓形薄銅墊片(直徑 3.5 mm)擊于脊髓背側(cè)，打擊致 T8脊髓急性挫傷。對照組僅行椎板和棘突切除，不損傷脊髓，無行為學及后肢運動障礙。

1.3 行為學功能測試 所有大鼠通過BBB(Basso，Beattie，Bresnahan)進行評分，自由活動4 min后通過觀察記錄不同組別大鼠后肢的運動情況。評分采用雙盲法，第一部分為0～7分，主要對恢復早期的后肢關(guān)節(jié)運動狀況進行評估；第二部分為8～13分，主要對恢復中期的步態(tài)及其協(xié)調(diào)運動進行評估；第三部分為14～21分，主要對大鼠運動時爪子的精細運動進行評估，最后取其平均值為BBB評分值。

1.4 Western印跡檢測自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin1的表達 分別取對照組及SCI后4 h、12 h、1 d、3 d、5 d、7 d的大鼠6只稱重。采用頸部處死的方式，快速暴露損傷部位的脊髓，在無菌條件下取出小塊損傷的脊髓并置于液氮中保存。隨后以100 g/L加入蛋白裂解液，冰浴勻漿。13 000 r min 4℃離心15 min，取上清，采用紫外分光光度計測定蛋白含量。

分別取對照組和SCI組蛋白樣品各40 μg，加入4×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液(含10%β-巰基乙醇)，沸水中煮沸5 min，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳，隨后進行電轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移后的聚偏氟乙稀(PVDF)膜用含10%脫脂奶粉的Tris鹽酸緩沖液(TBST)緩沖液室溫包被2 h，然后用抗PISTLRE抗體(1∶200)室溫孵育1 h后4℃過夜，TBST漂洗，轉(zhuǎn)入辣根過氧化物酶(HRP)-山羊抗免IgG(1∶2 000)中，室溫孵育2 h，TBST漂洗5次，增強化學發(fā)光法(ECL)發(fā)光，顯影，定影。最后通過圖像分析儀進行比較分析。每組重復3次，取OD值的平均值進行統(tǒng)計學分析。

1.5 Western印跡檢測Rapamycin和3-MA作用SCI大鼠后自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin1的表達 以2.5 mg/kg濃度的3-MA和0.5 mg/kg濃度的Rapamycin分別作用于SCI大鼠，對0、4、12 h、1、3、5、7 d 7個時間點的組織樣分別提取蛋白，Western印跡進行自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin1的檢測。方法同1.4。

1.6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS22.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 行為學評分 對照組大鼠活動正常，步態(tài)協(xié)調(diào)，足趾能夠持續(xù)抓地，尾巴持續(xù)翹起，動物軀體能夠維持穩(wěn)定，BBB評分為23分。SCI 3 d后，大鼠無運動現(xiàn)象，后側(cè)肢體癱瘓，BBB評分為0.9分；隨著大鼠SCI后時間的不斷延長，其所配的運動功能出現(xiàn)恢復跡象。見圖1。

2.2 自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin1的檢測 SCI后，自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin1 的表達量與對照組相比出現(xiàn)升高的趨勢，隨著損傷時間的不斷延長，其表達量也呈現(xiàn)升高的趨勢。SCI后3 d表達量顯著升高(P<0.01)；之后，其表達量隨SCI時間的延長呈現(xiàn)下降的趨勢。見圖2。

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01 圖1 大鼠SCI后的BBS評分

圖2 Rapamycin和3-MA對自噬相關(guān)蛋白L3的檢測

2.3 自噬促進劑Rapamycin和自噬抑制劑3-MA對Beclin 1和LC3的影響 見圖3。Rapamycin作用于SCI大鼠后，隨著損傷時間的延長Beclin1、LC3的表達量呈現(xiàn)上升的趨勢，SCI 3 d后Rapamycin組Beclin1、LC3的表達量與對照組相比顯著增高，達到極顯著水平(P<0.001)；3-MA組Beclin 1、LC3的表達量與對照組相比顯著降低(P<0.01)。隨后，隨著SCI時間的延長，其表達水平呈現(xiàn)下降趨勢。

圖3 Rapamycin和3-MA對自噬相關(guān)蛋白Beclin1的檢測

3 討 論

自噬是生命機體內(nèi)重要的代謝方式，在動物、植物和單細胞生物中廣泛存在，在細胞增殖分化、組織發(fā)育和穩(wěn)態(tài)的維持中發(fā)揮重要作用〔4〕。自噬主要通過以下途徑發(fā)揮作用：(1)參與細胞生長、分化，組織發(fā)育和重塑基本生命過程；(2)在營養(yǎng)不足時，細胞可以通過自噬作用將自身的大分子營養(yǎng)物質(zhì)分解后再吸收以保證自身能量代謝的需要；(3)當機體受到病原體感染后，自噬與免疫系統(tǒng)的激活與調(diào)控有關(guān)；(4)自噬可以清除細胞內(nèi)的損傷蛋白，降解異常壽命的蛋白從而起到保護細胞的作用。但當自噬過度或不足時，細胞內(nèi)的異常蛋白被聚集后阻礙細胞的正常生命活動，引發(fā)多種慢性疾病〔5〕。自噬參與多種疾病的調(diào)控，如SCI、惡性腫瘤、自身免疫疾病等〔6～8〕。

目前報道的SCI機制主要包括炎癥反應學說、血管學說、內(nèi)環(huán)境失衡學說和凋亡壞死學說。SCI后的再生是其功能修復的主要表現(xiàn)。自噬在SCI后的作用研究在國內(nèi)外尚處于起步階段。研究結(jié)果顯示SCI后自噬細胞的死亡與Beclin1表達異常升高有關(guān)〔9〕。Beclin1作為一種自噬相關(guān)蛋白，能夠促進自噬的發(fā)生，且在SCI后Beclin1的表達量顯著增高〔10〕。Beclin1在神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞中呈現(xiàn)高表達，這在一定程度上促進了自噬現(xiàn)象的激活。LC3作為自噬發(fā)生的相關(guān)蛋白，同樣在神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞中表達量升高，并參與自噬體雙層膜的形成〔11〕。研究表明，在SCI模型體注射Rapamycin能夠增強自噬相關(guān)蛋白的表達〔12〕，而神經(jīng)元的損傷和膠質(zhì)細胞的死亡率明顯下降。表明Rapamycin能夠促進自噬現(xiàn)象的發(fā)生。3-MA作為自噬抑制劑在自噬小體的形成和發(fā)展過程中起到阻遏作用，對細胞內(nèi)蛋白質(zhì)平衡也有一定影響，并進一步加重了疾病的發(fā)展〔13〕。本研究結(jié)果表明，Rapamycin可以有效促進SCI后的細胞自噬，3-MA具有阻礙SCI后細胞自噬的作用。但Rapamycin和3-MA在SCI后自噬現(xiàn)象發(fā)生的作用機制還不明確，有待進一步研究。

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〔2016-10-12修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

廣東省自然科學基金項目(2014A030313360)

黃旭明(1963-)，男，主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)康復研究。

張 濱(1982-)，男，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)康復研究。

R493

A

1005-9202(2017)05-1071-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.014