侯維娜 王瑞鵑 王鵬飛 侯瑞田 董文超 丁振江

(承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

血管緊張素Ⅱ?qū)ρ軆?nèi)皮細(xì)胞線粒體轉(zhuǎn)錄因子A表達(dá)的影響

侯維娜 王瑞鵑1王鵬飛1侯瑞田1董文超1丁振江1

(承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

目的 探討血管緊張素(Ang)Ⅱ?qū)ρ軆?nèi)皮細(xì)胞線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)表達(dá)及細(xì)胞功能的影響。方法 將不同濃度的Ang Ⅱ(1×10-7～1×10-5mol/L)與原代人臍靜脈細(xì)胞(HUVECs)共孵育，在24 h用免疫印跡技術(shù)和RT-PCR分別檢測(cè)TFAM的表達(dá)量；在12 h用流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位及細(xì)胞的凋亡率變化。結(jié)果 Ang Ⅱ以濃度依賴的方式降低TFAM的表達(dá)量；隨著Ang Ⅱ濃度升高，線粒體膜電位降低水平、細(xì)胞凋亡率增加(P<0.01)。結(jié)論 Ang Ⅱ降低HUVECs TFAM表達(dá)量及導(dǎo)致細(xì)胞損傷。

血管緊張素Ⅱ；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；線粒體轉(zhuǎn)錄因子A

血管緊張素(Ang)Ⅱ作用于內(nèi)皮細(xì)胞后可產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，ROS大量累積引起的氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，尤其是早期對(duì)線粒體的影響可貫穿動(dòng)脈粥樣硬化(AS)病變產(chǎn)生的早期階段〔1～3〕。適量的ROS可上調(diào)存活途徑增強(qiáng)抗氧化應(yīng)激基因的表達(dá)；隨著其濃度的升高，可誘導(dǎo)DNA損傷，甚至細(xì)胞凋亡。有研究顯示，線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)在一定程度上可對(duì)抗ROS產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，使細(xì)胞免受損傷〔4〕，但是高濃度的ROS可抑制TFAM表達(dá)，導(dǎo)致線粒體功能障礙，甚至引起細(xì)胞死亡。本實(shí)驗(yàn)將不同濃度的AngⅡ作用于內(nèi)皮細(xì)胞，觀察內(nèi)皮細(xì)胞中TFAM的表達(dá)及細(xì)胞的功能變化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUEVCs,ScienCell)，Ang Ⅱ(Millipore Corporation)，完全培養(yǎng)基(ScienCell，Catalog Number：1001)，單克隆兔抗人一抗(Abcam)，山羊抗兔二抗(KPL)，Trizol(ambion)，F(xiàn)astQuant RT Kit(with gDNA)第一鏈合成系統(tǒng)試劑盒(TIANGEN 公司)，SuperRealPreMixPlus(SYBR Green)試劑盒(TIANGEN 公司)，引物設(shè)計(jì)合成(TaKaRa Biotechnology公司)，檢測(cè)細(xì)胞膜電位試劑盒(SIGMA-ALDRICH)，凋亡試劑盒(BD)，DYY-III2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠)，RT-PCR 擴(kuò)增儀(Roche公司)，流式細(xì)胞儀(CYTOMICS FC 500)。

1.2 HUVES細(xì)胞培養(yǎng) 將原代細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，用ScienCell公司的內(nèi)皮培養(yǎng)基隔1 d換液1次，培養(yǎng)至6～7代時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞消化液為0.25%+EDTA的胰蛋白酶。

1.3 不同濃度的Ang Ⅱ?qū)UVECs的影響 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs細(xì)胞，調(diào)至1×106/ml接種于6孔板培養(yǎng)12 h，加入藥物終濃度為10-7、10-6、10-5mol/L的Ang Ⅱ作為實(shí)驗(yàn)組(分別為B、C、D組)，對(duì)照組(A組)不加藥物。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均在于不加血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。

1.3.1 Western印跡檢測(cè)細(xì)胞TFAM蛋白表達(dá) 提取蛋白，進(jìn)行BCA蛋白定量，煮沸蛋白，配膠，加樣后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。將膜置于TFAM、β-actin一抗中4℃孵育過(guò)夜，洗膜后將膜置于二抗中孵育2 h。曝光，定影，掃描膠片并用軟件進(jìn)行分析。

1.3.2 RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞TFAM mRNA表達(dá) 引物設(shè)計(jì)：TFAM上游引物5′ GTTGCAACTTCTGTGGAAGCAT 3′，下游引物5′TCCGCCCTATAAGCATCTTGA 3′；β-actin上游引物5′AGGCGAGCATCCCCCAAAG 3′，下游引物5′GGGCACGAAGGCTCATCATT 3′，由TaKaRa Biotechnology有限公司合成?？俁NA的提取：使用美國(guó)Invitrogen公司Trizol試劑，按照試劑說(shuō)明書中方法對(duì)總RNA進(jìn)行提取。逆轉(zhuǎn)錄RT反應(yīng)，按TIANGEN 生物工程公司兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書操作。PCR擴(kuò)增：每個(gè)反應(yīng)體系均為 25 μl，TFAM 反應(yīng)條件：預(yù)變性 95℃，10 min；變性95℃，10 s；退火64℃，20 s；延伸72℃，15 s；進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。

1.3.3 流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧、線粒體膜電位、細(xì)胞凋亡率 按照線粒體膜電位試劑盒說(shuō)明書，JC-10孵育20 min，離心后收集細(xì)胞，加入Assay buffer，置于流式細(xì)胞儀檢測(cè)。按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行FITC、PI雙染色，37℃避光放置30 min，置于流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPASS19.0軟件行t檢驗(yàn)，單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度Ang Ⅱ作用于HUVECs TFAM蛋白、mRNA的表達(dá)水平 不同濃度的Ang Ⅱ(0，10-7，10-6，10-5mol/L)作用于細(xì)胞24 h后，各組TFAM蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.94±0.04、0.78±0.09、0.48±0.09、0.40±0.73，實(shí)驗(yàn)組蛋白表達(dá)量均較對(duì)照組減少，具有一定的濃度依賴性(均P<0.01)；同時(shí)，A、B、C、D組TFAM mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.94±0.08、0.78±0.09、0.44±0.07、0、40±0.08，與TFAM蛋白的表達(dá)水平相似，B、C、D組TFAM mRNA相對(duì)表達(dá)量與A組相比明顯減少(均P<0.01)。見圖1。

圖1 不同濃度的Ang Ⅱ作用于HUVECs后TFAM的表達(dá)量

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度的Ang Ⅱ?qū)UVECS膜電位水平、凋亡率 細(xì)胞膜電位檢測(cè)：JC-10 在線粒體內(nèi)形成多聚體，其發(fā)射光為紅色熒光；細(xì)胞發(fā)生早期凋亡前，線粒體膜電位即表現(xiàn)下降，JC-10以單體的形式存在于胞質(zhì)內(nèi)發(fā)綠色熒光。不同濃度的Ang Ⅱ作用細(xì)胞24 h后，A、B、C、D組細(xì)胞的線粒體膜電位減低水平為26.98±4.46、41.74±4.24、60.47±4.52、70.16±3.07，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組線粒體膜電位下降增多(P<0.01)。細(xì)胞凋亡顯示，不同濃度的Ang Ⅱ作用于細(xì)胞后，各組的早期凋亡率及晚期凋亡率分別為4.0%、1.8%，10.8%、2.9%，5.2%、8.2%，1.4%、15%。實(shí)驗(yàn)組早期凋亡多于A組，隨著Ang Ⅱ濃度的增加早期凋亡減少，晚期凋亡增加。

3 討 論

冠狀動(dòng)脈AS主要表現(xiàn)為炎癥引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂及泡沫細(xì)胞形成的慢性退行性病變〔5〕，內(nèi)皮細(xì)胞的功能失調(diào)可直接導(dǎo)致AS的發(fā)生發(fā)展〔6〕。本研究結(jié)果顯示，Ang Ⅱ可下調(diào)HUVECs TFAM表達(dá)量，增加線粒體膜電位的下降率及細(xì)胞的凋亡率。

ROS主要在線粒體電子傳遞、氧化磷酸化和三羧酸(TCA)循環(huán)的過(guò)程中產(chǎn)生。正常情況下，ROS參與關(guān)鍵信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)，包括細(xì)胞生長(zhǎng)和分化〔7〕，一旦失去平衡，ROS過(guò)量積累產(chǎn)生的氧化應(yīng)激可對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞線粒體、DNA、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)造成損傷〔8〕。研究顯示機(jī)體內(nèi)存在Ang Ⅱ刺激細(xì)胞使細(xì)胞產(chǎn)生ROS的途徑：過(guò)多Ang Ⅱ通過(guò)調(diào)節(jié)NADPH氧化酶(NOX)的活性增加ROS的產(chǎn)生〔9,10〕；另外研究顯示，刺激產(chǎn)生的ROS可作為信號(hào)傳導(dǎo)因子，誘導(dǎo)Rac及P40向細(xì)胞膜移動(dòng)，激活蛋白激酶C，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞NADPH氧化酶活化，導(dǎo)致線粒體的氧化損傷〔11,12〕。

線粒體的早期損傷主要表現(xiàn)為調(diào)節(jié)組成線粒體生物合成的蛋白合成減少，其中作為線粒體轉(zhuǎn)錄及復(fù)制的關(guān)鍵激活因子及TFAM在氧化應(yīng)激中起著重要的作用。TFAM是核基因編碼的一種小分子多肽，可維護(hù)線粒體DNA的完整性，從而抑制細(xì)胞凋亡〔13〕。正常機(jī)體中氧化應(yīng)激損傷時(shí)，TFAM增加的表達(dá)量可導(dǎo)致線粒體的含量增加，線粒體膜電位增高及凋亡量減少〔14,15〕。Picca等〔16〕報(bào)道顯示細(xì)胞受到氧化應(yīng)激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的PKA-CREB(G蛋白耦聯(lián)-cAMP 反應(yīng)原件結(jié)合蛋白)通路激活，上調(diào)過(guò)氧化物酶體增生物激活受體γ共激活因子(PGC-1α)、核呼吸因子(NRF)-1的表達(dá)量，進(jìn)而增加TFAM 的表達(dá)量；TFAM 與線粒體DNA的親和力增加，調(diào)節(jié)線粒體DNA的拷貝數(shù)，維護(hù)線粒體DNA的完整和穩(wěn)定，促進(jìn)線粒體DNA的損傷修復(fù)。然而，氧化應(yīng)激產(chǎn)物的異常積累會(huì)損傷細(xì)胞核DNA的功能導(dǎo)致TFAM的表達(dá)量降低。本研究顯示Ang Ⅱ下調(diào) TFAM表達(dá)量，說(shuō)明細(xì)胞對(duì)抗氧化應(yīng)激過(guò)度刺激時(shí)細(xì)胞發(fā)生不可逆的損傷，導(dǎo)致TFAM表達(dá)量減少；也有研究顯示可能與細(xì)胞內(nèi)自身的負(fù)反饋相關(guān)，細(xì)胞受到ROS刺激后，線粒體內(nèi)TFAM的含量增加導(dǎo)致核內(nèi)的TFAM與NRF-1結(jié)合形成免疫共沉淀，導(dǎo)致NRF-1的表達(dá)量降低，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的TFAM表達(dá)量降低〔17〕；同時(shí)有研究顯示，細(xì)胞質(zhì)中Lon 的蛋白水解酶可以使磷酸化的TFAM裂解，高濃度的ROS抑制HSP60-70-TFAM復(fù)合物形成，從而抑制線粒體的生物合成〔18〕。

目前認(rèn)為線粒體在細(xì)胞的死亡中起關(guān)鍵作用，承載著為細(xì)胞制造能量的重要功能，其功能受損會(huì)導(dǎo)致整個(gè)細(xì)胞的功能障礙。功能障礙及細(xì)胞的完整性遭到破壞的內(nèi)皮細(xì)胞，會(huì)使脂質(zhì)代謝紊亂，形成脂質(zhì)斑塊，最終形成AS。TFAM在線粒體的生物合成中發(fā)揮重要作用，其含量的變化必然引起線粒體功能改變，線粒體膜電位的變化便是最敏感的指示〔19〕，本研究發(fā)現(xiàn)TFAM表達(dá)量減少將直接引起線粒體功能障礙。血管內(nèi)皮細(xì)胞作為血管壁的第一層屏障，其完整性具有重要的作用，在導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的三條基本途徑和誘導(dǎo)的不同類型的細(xì)胞凋亡過(guò)程中均出現(xiàn)了MMP表達(dá)下降其，往往早于細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變。Lodha等〔20〕對(duì)腎臟細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，Ang Ⅱ會(huì)引起ROS的產(chǎn)生使細(xì)胞直接進(jìn)入凋亡程序，進(jìn)而發(fā)展為腎小管硬化。本研究也同時(shí)發(fā)現(xiàn)了高濃度Ang Ⅱ(10-5mol/L)可直接導(dǎo)致細(xì)胞不經(jīng)過(guò)早期凋亡直接過(guò)渡到晚期凋亡。

近期研究顯示，可通過(guò)檢測(cè)外周血TFAM mRNA的表達(dá)量預(yù)測(cè)骨關(guān)節(jié)疾病，同時(shí)外周血TFAM mRNA的表達(dá)量與軟骨細(xì)胞TFAM的表達(dá)量呈正相關(guān)〔21〕。冠心病患者內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷嚴(yán)重，由此可推斷TFAM在體內(nèi)表達(dá)量減少，在進(jìn)一步的研究中，可以通過(guò)與正常人進(jìn)行對(duì)照觀察TFAM在冠心病中的表達(dá)量，進(jìn)一步研究其可否作為早期檢測(cè)冠心病的標(biāo)志因子。另外，研究顯示在治療心力衰竭中，體外將TFAM mRNA引入細(xì)胞內(nèi)治療心力衰竭，可增加細(xì)胞線粒體的功能〔19〕。推測(cè)在治療AS時(shí)可以通過(guò)靶向治療改善內(nèi)皮細(xì)胞線粒體功能進(jìn)而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞和修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。

1 Morales MG，Abrigo J，Meneses C，etal.The Ang-(1-7)/Mas-1 axis attenuates the expression and signalling of TGF-β1 induced by AngⅡ in mouse skeletal muscle〔J〕.Clin Sci (Lond)，2014；127(4)：251-64.

2 Nishimura S，Manabe I，Nagasaki M，etal.In vivo imaging visualizes discoid platelet aggregations without endothelium disruption and implicatescontribution of inflammatory cytokine and integrin signaling〔J〕.Blood，2012；119(8)：e45-56.

3 Park M，Vittinghoff E，Ganz P，etal.Role of soluble endothelial cell-selective adhesion molecule biomarker in albuminuria and kidney function changes in patients with coronary artery disease：the heart and soul study/significance〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2014；34(1)：231-6.

4 Choi BJ，Matsuo Y，Aoki T，etal.Coronary endothelial dysfunction is associated with inflammation and vasa vasorum proliferation in patients with early atherosclerosis〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2014；34(11)：2473-7.

5 Verma S，Wang CH，Li SH，etal.A self-fulfilling prophecy：C-reactive protein attenuates nitric oxide production and inhibits angiogenesis〔J〕.Circulation，2002；106(8)：913-9.

6 Vita JA.Endothelial function〔J〕.Circulation，2011；124(25)：906-12.

7 Hamanaka RB，Chandel NS.Mitochondrial reactive oxygen speciesregulate cellular signaling and dictate biological outcomes〔J〕.Trends Biochem Sci，2010；35(9)：505-13.

8 BalabanRS，Nemoto S，F(xiàn)inkel T.Mitochondria，oxidants，and aging〔J〕.Cell，2005；120(4)：483-95.

9 Touyz RM.Reactive oxygen species and angiotensin II signaling in vascular cells-implications in cardiovascular disease〔J〕.Braz J Med Biol Res，2004；37(8)：1263-73.

10 Wilkinson-Berka JL，Rana I，Armani R，etal.Reactive oxygen species，Nox and angiotensin Ⅱ in angiogenesis implications for retinopathy〔J〕.Clin Sci(Lond)，2013;124(10)：597-615.

11 Elnakish MT，Hassanain HH，Janssen PM，etal.Emerging role of oxidative stress in metabolic syndrome and cardiovascular diseases：important role of Rac/NADPH oxidase〔J〕.J Pathol，2013;231(3)：290-300.

12 H?ll M，Koziel R，Sch?fer G，etal.ROS signaling by NADPH oxidase 5 modulates the proliferation and survival of prostate carcinoma cells〔J〕.Mol Carcinog，2016;55(1)：27-39.

13 Danisovic L，Varga I，Zamborsky R，etal.The tissue engineering of articular cartilage：cells，scaffolds and stimulating factors〔J〕.Exp Biol Med (Maywood)，2012;237(1)：10-7.

14 Chakrabarty S，D′Souza RR，Bellampalli R，etal.Comprehensive DNA copynumber profile and BAC library construction of an Indian individual〔J〕.Gene，2012;500(2)：186-93.

15 Sanjiban Chakrabarty，Reena Reshma D′Souza.Upregulation of TFAM and mitochondria copy number in human lymphoblastoid cells〔J〕.Mitochondrion，2014;14(1)：52-8.

16 Picca A，Lezza AM.Regulation of mitochondrial biogenesis through TFAM-mitochondrial DNA interactions：usefu linsights from aging and caloria restriction studies〔J〕.Mitochondrion,2015;15(1)：67-75.

17 Lee EJ，Kang YC，Park WH，etal.Negative transcriptional regulation of mitochondrial transcription factor(TFAM)by nuclear TFAM〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2014;450(1)：166-71.

18 Wenz T.Regulation of mitochondrial biogenesis and PGC-1 alpha under cellular stress〔J〕.Mitochondrion，2013;13(2)：134-42.

19 Ikeda M，Ide T，F(xiàn)ujino T，etal.Overexpression of TFAM or twinkle increases mtDNA copy number and facilitates cardioprotection associated with limited mitochondrial oxidative stress〔J〕.PLoS One，2015;10(3)：e0119687.

20 Lodha S，Dani D，Mehta R，etal.Singhal，Angiotensin Ⅱ-induced mesangial cell apoptosis：role of oxidative stress〔J〕.Mol Med，2002;8(12)：830-40.

21 陳斌偉，楊進(jìn)順，黃 彥，等.骨關(guān)節(jié)炎患者線粒體轉(zhuǎn)錄因子A表達(dá)與線粒體DNA拷貝數(shù)關(guān)系的研究〔J〕.臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2015;14(12)：976-9.

〔2016-08-31修回〕

(編輯 郭 菁)

國(guó)家自然科學(xué)基金(81000068)；河北省引進(jìn)留學(xué)人員資助項(xiàng)目(C2015005001)

王瑞鵑(1975-)，女，博士，副主任醫(yī)師，主要從事心血管疾病研究。

侯維娜(1989-)，女，在讀碩士，主要從事心血管內(nèi)科研究。

R3

A

1005-9202(2017)05-1059-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.008

1 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心臟內(nèi)科