謝亞芹 趙 娟 李秀華 馮翔宇

(承德醫(yī)學院病理生理學教研室，河北 承德 067000)

福辛普利對慢性心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的影響

謝亞芹 趙 娟 李秀華1馮翔宇1

(承德醫(yī)學院病理生理學教研室，河北 承德 067000)

目的 探討福辛普利對慢性心力衰竭(CHF)大鼠心肌細胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3 表達水平的影響。方法 雄性Wistar大鼠50只隨機抽取10只為假手術(shù)組，其余大鼠采用腎上腹主動脈縮窄法建立大鼠CHF模型，6 w后將成模大鼠隨機分為CHF組、Fos10組、FOS20組(福辛普利10、20 mg·kg-1·d-1)。治療8 w后，觀察各組大鼠血流動力學指標和左心室重量指數(shù)(LVMI)；透射電鏡觀察左室心肌組織形態(tài)的改變；TUNEL法檢測大鼠左心室心肌細胞的凋亡指數(shù)；SP免疫組織化學染色法檢測左心室心肌組織Caspase-3蛋白的表達。結(jié)果 CHF組與假手術(shù)組相比，大鼠左心室舒張末壓(LVEDP)、LVMI、心肌細胞凋亡指數(shù)、Caspase-3蛋白的表達均明顯升高(P<0.01)，左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率(±dp/dtmax)顯著下降(P<0.01)；與CHF組比較，F(xiàn)os10組和Fos20組大鼠LVEDP、LVMI、心肌細胞凋亡指數(shù)、Caspase-3蛋白的表達均明顯降低(P<0.01)，左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率(±dp/dtmax)顯著升高(P<0.01)，且Fos20組效果明顯。電鏡下觀察：Fos10組和Fos20組心肌損傷程度較CHF組明顯減輕。結(jié)論 福辛普利可通過下調(diào)Caspase-3的表達抑制心肌細胞凋亡，改善CHF大鼠心室功能及心肌超微結(jié)構(gòu)。

福辛普利；慢性心力衰竭；超微結(jié)構(gòu)；細胞凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

慢性心力衰竭(CHF)發(fā)生時左室功能的不斷惡化是心肌細胞凋亡或(和)剩余的心肌細胞收縮功能代償不足的結(jié)果，而凋亡可能是心肌細胞不斷丟失的根源所在〔1～3〕。作為第三代血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)類藥物的福辛普利在逆轉(zhuǎn)心肌肥厚，降低心臟負荷的同時具有作用時間更長，副作用減少，肝腎雙重排泄等優(yōu)點，因此成為近年來研究的熱點。但其能否抑制CHF心肌細胞凋亡及作用是否存在劑量依賴性仍需進一步研究。本研究將以腹主動脈縮窄方式建立慢性壓力負荷性心力衰竭動物模型，觀察福辛普利對CHF大鼠心肌細胞的超微結(jié)構(gòu)、心肌細胞凋亡及凋亡相關(guān)調(diào)節(jié)基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級雄性Wistar大鼠50只(北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證編號：2009-0004)，福辛普利(10 mg，商品名：蒙諾，購自中美上海施貴寶制藥有限公司)，TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(美國羅氏Roche公司)，Caspase-3兔抗多克隆抗體(武漢博士德生物公司)，SP免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的制備及分組 將50只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機抽取10只作為假手術(shù)組，其余大鼠全部采用腎上腹主動脈縮窄手術(shù)制作CHF模型〔4〕。假手術(shù)組只分離腹主動脈而不結(jié)扎。術(shù)后均給予青霉素20萬U連續(xù)3 d腹腔注射，常規(guī)喂養(yǎng)6 w，造模大鼠逐漸出現(xiàn)呼吸、心跳加快、倦怠無力、食欲減退等表現(xiàn)，模型制備中死亡10只，假手術(shù)組大鼠無死亡。檢測血流動力學參數(shù)，以左心室舒張末壓(LVEDP)≥15 mmHg作為成模標準，待成功建立模型后，將成模大鼠隨機分為3組，即CHF組、Fos10組和Fos20組，每組10只。Fos10組和Fos20組大鼠分別給予福辛普利10 mg·kg-1·d-1和20 mg·kg-1·d-1，CHF組和假手術(shù)組大鼠給予生理鹽水灌胃，連續(xù)8 w。

1.2.2 血流動力學監(jiān)測 將大鼠測體重后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.5 g/kg)大鼠，經(jīng)右頸總動脈逆行插管至左心室，另一端接壓力換能器輸入多媒體生物信號記錄儀系統(tǒng)，獲取LVEDP，左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率(±dp/dtmax)。

1.2.3 標本制備及計算左心室重量指數(shù)(LVMI) 福辛普利治療結(jié)束后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.5 g/kg)，進行血流動力學監(jiān)測后，迅速開胸取出心臟，冰生理鹽水洗凈，分離左心室稱重，后將部分放入4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟和包埋，備用于TUNEL法檢測細胞凋亡、免疫組織化學染色檢測Caspase-3蛋白表達。另取1 mm3大小的左心室組織數(shù)塊放入3.1%戊二醛中固定，留待電鏡檢測心肌組織的超微結(jié)構(gòu)改變。LVMI=大鼠左心室重量/大鼠體重。

1.2.4 心肌組織超微結(jié)構(gòu)的觀察 取1 mm3大小的左心室心肌數(shù)塊放入3.1%戊二醛溶液內(nèi)，經(jīng)0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗后再固定于10 %鋨酸溶液中，按電鏡常規(guī)技術(shù)脫水、包埋，用EMUC6 型超薄切片機(德國萊卡公司)作超薄切片，經(jīng)醋酸鈉與枸櫞酸鉛雙重染色，在H-7650B透射電鏡(日本日立公司)下觀察并照相。

1.2.5 TUNEL法檢測細胞凋亡 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，proteinase K工作液消化15 min，TUNEL反應(yīng)液37℃孵育60 min，過氧化物酶轉(zhuǎn)化劑37℃孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片。凋亡細胞的細胞核呈棕褐色著染。凋亡指數(shù)(AI)的確定：以TUNEL陽性細胞數(shù)目與同一視野神經(jīng)細胞總數(shù)的比值作為左心室心肌細胞凋亡指數(shù)，每只動物任選3張切片，每張切片選取4個視野，取平均值。

1.2.6 免疫組織化學檢測Caspase-3蛋白的表達 采用SP法檢測左心室心肌組織Caspase-3蛋白的表達。Ⅰ抗分別為Caspase-3多克隆抗體，稀釋濃度均為1∶100。實驗同時以0.01 mmol/L PBS代替第1抗體作為陰性對照，以胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)，采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)在10×20倍顯微鏡下對免疫陽性結(jié)果進行半定量分析，以免疫陽性產(chǎn)物面積與視野面積的比值表示該抗原的相對含量。每只動物任選3張切片，每張切片選取4個視野，取平均值。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件行單因素方差分析及LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 血流動力學參數(shù)及LVMI檢測結(jié)果 與假手術(shù)組相比，CHF組大鼠LVEDP、LVMI顯著增高(P<0.01)，±dp/dtmax明顯下降(P<0.01)；與CHF組相比，F(xiàn)os10組和Fos20組大鼠LVEDP、LVMI明顯下降(P<0.01)，±dp/dtmax明顯上升(P<0.01)，F(xiàn)os20組效果明顯(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠血流動力學參數(shù)、LVMI、AI及心肌組織Caspase-3表達比較

與CHF組比較：1)P<0.01;與Fos10組：2)P<0.01

2.2 心肌細胞超微結(jié)構(gòu)的觀察 電鏡下觀察：假手術(shù)組心肌細胞輪廓清晰，粗細肌絲排列整齊，明暗帶清晰可見，細胞核呈橢圓形，核仁居中。CHF組心肌細胞出現(xiàn)心肌凋亡征象，表現(xiàn)為肌絲排列紊亂，肌節(jié)錯位、各帶結(jié)構(gòu)分辨不清，部分灶性溶解，線粒體腫脹、嵴不同程度斷裂溶解，心肌細胞水腫，細胞核固縮，染色質(zhì)邊集。Fos10組和Fos20組心肌細胞損傷明顯減輕，細胞輕度水腫，肌纖維排列規(guī)則，心肌線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)改變較CHF組明顯減輕。Fos20組心肌細胞超微結(jié)構(gòu)改善優(yōu)于Fos10組。見圖1。

2.3 心肌細胞凋亡檢測結(jié)果 見表1、圖2。TUNEL陽性產(chǎn)物位于胞核，呈棕褐色顆粒狀。與假手術(shù)組比較，CHF組大鼠心肌組織細胞凋亡明顯增多，AI明顯增高(P<0.01)；Fos10組和Fos20組大鼠心肌組織細胞AI較CHF組明顯降低(P<0.01)，F(xiàn)os20組降低更為顯著(P<0.01)。

圖1 各組大鼠左心室心肌組織的超微結(jié)構(gòu)(×20 000)

圖2 TUNEL法檢測各組大鼠心肌細胞凋亡(TUNEL法，×400)

2.4 免疫組織化學法檢測心肌組織Caspase-3蛋白表達結(jié)果 Caspase-3免疫陽性產(chǎn)物呈棕黃色，位于心肌細胞質(zhì)。CHF組較假手術(shù)組大鼠心肌組織Caspase-3蛋白表達增高(P<0.01)，F(xiàn)os10組和Fos20組較CHF組Caspase-3蛋白表達降低，F(xiàn)os20組降低更加顯著(P<0.01)。見表1、圖3。

圖3 各組大鼠左心室心肌組織Caspase-3蛋白表達(DAB，×400)

3 討 論

研究證實，機械牽張可以誘導心肌細胞的凋亡〔5〕。因此采用縮窄腎上腹主動脈所致壓力負荷增加可誘導心肌細胞凋亡和間質(zhì)纖維化〔6〕。本研究表明CHF組大鼠明顯出現(xiàn)心功能的惡化，同時LVMI增加，提示CHF組大鼠心室壁增厚，出現(xiàn)心肌肥厚，在慢性壓力負荷增加時，可發(fā)生心肌細胞的凋亡及心肌纖維化，并最終導致心功能的惡化。福辛普利作為一種ACEI，能夠有效抑制周圍血管及組織緊張素轉(zhuǎn)化酶的作用，減少血管緊張素Ⅱ的刺激作用，減輕氧化應(yīng)激，提高緩激肽的水平，從而發(fā)揮抗凋亡作用〔7,8〕。本研究顯示福辛普利可改善心室功能，有效抑制了心肌重構(gòu)及心肌細胞凋亡的發(fā)生。在超微結(jié)構(gòu)上，福辛普利可通過對保護線粒體及心肌纖維的正常結(jié)構(gòu)，減少膠原纖維的生成而改善心肌的超微結(jié)構(gòu)，并且高劑量組效果更加顯著。

與壞死不同，細胞凋亡是受基因控制的程序化的死亡過程。線粒體在缺血、缺氧、 氧化應(yīng)激、細胞鈣超載等病理條件下，會發(fā)生腫脹釋放細胞色素C，激活Caspase-3〔9〕。Caspase-3被認為是各種凋亡刺激因子激活的Caspase家族中的關(guān)鍵蛋白酶，是細胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，其活化標志著凋亡進入不可逆階段〔10〕?，F(xiàn)已證實Caspase-3在心、腦等重要器官缺血再灌注過程及腫瘤細胞均異常表達〔11,12〕，參與細胞凋亡。本研究中通過福辛普利的治療可抑制心肌凋亡基因Caspase-3的表達，提示對Caspase-3表達的抑制作用可能是該藥抗心肌凋亡的分子機制之一，福辛普利下調(diào)Caspase-3的表達可呈劑量依賴性。但關(guān)于福辛普利鈉長期應(yīng)用的合理劑量及對重要臟器的毒副作用等問題還有待進一步研究。

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〔2015-11-27修回〕

(編輯 曹夢園)

河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學研究重點課題計劃項目(20110180)；河北省高校重點學科建設(shè)項目資助(冀教高〔2013〕4號病理學與病理生理學)

謝亞芹(1983-)，女，碩士，講師，主要從事心力衰竭的基礎(chǔ)與臨床研究。

R541.6

A

1005-9202(2017)05-1056-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.007

1 承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院老年病科