孫乃坤 王耀宗 劉志剛 付代杰 尚希福 李 旭

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，福建 廈門 361003)

辛伐他汀對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠MMP-3、MMP-9、TGF-β1表達的影響及作用機制

孫乃坤 王耀宗1劉志剛2付代杰3尚希福3李 旭3

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，福建 廈門 361003)

目的 探討辛伐他汀對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-3、MMP-9、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1表達水平的影響及其作用機制。方法 40只膠原誘導(dǎo)膝骨關(guān)節(jié)炎造模成功的大鼠隨機分為模型組和低劑量組、中劑量組和高劑量組，另選取10只未造模大鼠作為對照組。分別給予低、中、高劑量組0.01、0.1、0.5 mg/ml辛伐他汀稀釋液灌胃，劑量為0.2 ml/kg，同時給予對照組和模型組同等劑量無菌生理鹽水灌胃。6 w后處死，采用免疫組化法檢測組織中Caspase-3表達情況。對比5組給藥前、3 w和6 w后血清MMP-3、MMP-9和TGF-β1水平變化及Caspase-3表達情況。結(jié)果 用藥前對照組血清MMP-3、MMP-9和TGF-β1表達水平均較其他各組顯著降低(P<0.05)，3 w后和6 w后對照組和模型組血清因子水平均無顯著變化(P>0.05)，而低、中、高劑量組均隨著用藥時間延長而顯著降低(P<0.05)，3 w和6 w后各項指標水平按照由高到低排列為模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組和對照組，且每兩組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；高劑量組Caspase-3 OD值遠遠高于中劑量組和低劑量組(P<0.05)，中劑量組遠遠高于低劑量組(P<0.05)，低劑量組較對照組和模型組高(P<0.05)，對照組和模型組無顯著差異(P>0.05)。結(jié)論 辛伐他汀可改善膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠血清MMP-3、MMP-9和TGF-β1水平，在一定范圍內(nèi)劑量越高作用效果越好，推測可能和Caspase-3異常激活有關(guān)。

辛伐他??；膝骨關(guān)節(jié)炎；基質(zhì)金屬蛋白酶；轉(zhuǎn)化生長因子β1

膝骨關(guān)節(jié)炎是老年人群中常見疾病類型，以活動障礙和關(guān)節(jié)疼痛為主要臨床表現(xiàn)，嚴重影響居民生活質(zhì)量。對于晚期膝骨關(guān)節(jié)炎，臨床上常采用關(guān)節(jié)置換外科手術(shù)方式解除痛苦，但是大部分早期和中期患者常采用保守治療，而效果不甚理想〔1〕。非甾體類抗炎藥是當前針對膝骨關(guān)節(jié)炎的常用藥物，盡管能夠在一定程度上減輕痛苦，但是在關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)和功能方面保護作用并不理想，且無法延緩病情進展，長期使用還易造成胃腸系統(tǒng)嚴重副作用。辛伐他汀是常用降脂藥物，但是近年來研究發(fā)現(xiàn)該藥物可以抑制炎癥反應(yīng)，同時還可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)，推測對膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨結(jié)構(gòu)和功能也有一定改善作用〔2〕?；诖?，本研究通過觀察辛伐他汀對膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠相關(guān)因子表達水平的影響及其作用機制。

1 資料與方法

1.1 動物 選取50只健康雄性大鼠，體質(zhì)量130～160 g，平均(142.56±5.13)g，均由實驗動物中心提供。喂養(yǎng)條件：適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，光照和黑暗交替12 h，溫度保持(22±2)℃，分籠喂養(yǎng)，可自由活動。

1.2 建模和分組 選取40只大鼠首先給予戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉；采用Hulth法對后肢踝關(guān)節(jié)利用膠原誘導(dǎo)膝骨關(guān)節(jié)炎。造模成功后采用隨機數(shù)字表法將其分為模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組各有10只大鼠。將剩余10只未造模大鼠記為對照組。

1.3 給藥方法 將一定劑量辛伐他汀溶于無菌生理鹽水中，制作濃度為0.01、0.1、0.5 mg/ml的稀釋液，分別給予低、中、高劑量組大鼠0.2 ml/kg稀釋液灌胃。模型組和對照組均在相同時間段給予同等劑量的無菌生理鹽水灌胃，5組大鼠均連續(xù)給藥(或生理鹽水)6 w。

1.4 血清MMP-3、MMP-9和TGF-β1檢測方法 所有大鼠均分別于給藥前、3 w后和6 w后抽取3 ml靜脈血，離心后利用全自動生化分析儀對上清液待檢樣品進行檢測，均為酶聯(lián)免疫法，所用試劑盒均由上海哈靈生物科技有限公司提供。

1.5 Caspase-3表達檢測方法 所有大鼠均于6 w后處死，取后肢踝關(guān)節(jié)病變組織置于甲醛溶液(濃度為10%)中固定，參照《現(xiàn)代實驗動物學(xué)技術(shù)》〔3〕相關(guān)操作行免疫組化法染色并觀察Caspase-3表達情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件，計量資料多樣本比較用F檢驗，兩兩比較用SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 血清MMP-3、MMP-9和TGF-β1表達水平 表1～表3可見，用藥前對照組血清MMP-3、MMP-9和TGF-β1均較低、中、高劑量組和模型組顯著降低(P<0.05)，3 w后和6 w后對照組和模型組血清MMP-3、MMP-9和TGF-β1水平均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而低、中、高劑量組均隨著用藥時間延長而顯著降低(P<0.05)，3 w后和6 w后血清MMP-3、MMP-9和TGF-β1水平按照由高到低排列為模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組和對照組，且每兩組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 血清MMP-3表達水平比較

與用藥前比較：1)P<0.05；與3 w后比較:2)P<0.05；與對照組比較:3)P<0.05；與低劑量組比較:4)P<0.05；與中劑量組比較:5)P<0.05；與高劑量組比較:6)P<0.05；下表同

表2 血清MMP-9表達水平比較

表3 血清TGF-β1表達水平比較

2.2 Caspase-3表達情況 高劑量組Caspase-3 OD值(20.92±1.71)遠遠高于中劑量組(15.78±1.67)和低劑量組(12.34±1.35)(P<0.05)，中劑量組遠遠高于低劑量組(P<0.05)，低劑量組也較對照組(10.25±1.23)和模型組(10.27±1.19)(P<0.05)，而對照組和模型組無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制相關(guān)研究較多，可歸結(jié)為軟骨合成降解因子水平異常降低、促合成因子水平明顯增高，而在此種病理改變過程中，炎癥因子水平紊亂逐漸引起并加重炎癥反應(yīng)是該病發(fā)展的重要推動因素〔4，5〕。目前研究較多的主要有MMP-3、MMP-9和TGF-β1等〔6〕。MMP-3在許多正常生理過程中均有參與，如形態(tài)生成、組織愈合、損傷修復(fù)等，但是一旦相關(guān)基因過度表達造成MMP-3水平異常升高將會導(dǎo)致其細胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)降解等生物學(xué)功能被異常激活，使得成纖維細胞、血管平滑肌細胞、軟骨細胞和內(nèi)皮細胞等均在短時間內(nèi)大量生成，在膝骨關(guān)節(jié)炎、心血管疾病和癌癥等病變過程中起到重要促進作用；MMP-9在腫瘤壞死因子、 血小板源生長因子等誘導(dǎo)下均可明顯增高，增強細胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)降解功能，導(dǎo)致正常組織結(jié)構(gòu)和功能被嚴重破壞，最終促進膝骨關(guān)節(jié)炎形成和發(fā)展；TGF-β1屬于轉(zhuǎn)化生長因子，具有多種生物學(xué)作用：①促進細胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)降解；②促進成骨細胞和成纖維細胞生長；③抑制破骨細胞和上皮細胞生長和生物學(xué)功能；④趨化單核細胞和成纖維細胞〔7,8〕。上述各種生物學(xué)作用均可通過不同途徑導(dǎo)致膝骨關(guān)節(jié)炎的形成和進展。

隨著關(guān)于膝骨關(guān)節(jié)炎形成和發(fā)展中基因表達異常認知逐漸深入，Caspase-3對血清MMP-3、MMP-9和TGF-β1因子表達水平的調(diào)控作用也成為研究的重點和熱點〔9,10〕。Caspase-3主要作用在于執(zhí)行細胞凋亡〔11〕。一旦基因突變導(dǎo)致DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及損傷修復(fù)作用異常，將會使得對Bcl-2拮抗作用減弱，而成纖維細胞和軟骨細胞水平將會異常升高，使相關(guān)因子水平調(diào)控作用減弱，最終引發(fā)膝骨關(guān)節(jié)炎。辛伐他汀屬于一種重要的還原酶抑制劑，可以通過抑制Rho通路對過氧化物酶體增殖物產(chǎn)生促進作用，激活Caspase-3表達，使得其陽性表達水平被明顯調(diào)高，進而使得T淋巴細胞成熟加快，對機體產(chǎn)生顯著免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用，最終通過不同途徑和作用機制將膝骨關(guān)節(jié)炎血清MMP-3、MMP-9、TGF-β1因子水平下調(diào)，促進病情迅速恢復(fù)〔12〕。據(jù)國外相關(guān)動物模型實驗研究表明，MMP-3、MMP-9、TGF-β1異常高水平表達既是膝骨關(guān)節(jié)炎患者外在表現(xiàn)，同時又是病情加重的重要促進因素〔13〕。采用辛伐他汀可以激活Caspase-3表達，同時下調(diào)上述血清因子水平，推測其間存在一定相關(guān)性和調(diào)節(jié)作用。

綜上，在一定范圍內(nèi)，高劑量辛伐他汀對膝骨關(guān)節(jié)炎實驗大鼠病情改善作用顯著，推測可通過激活Caspase-3表達下調(diào)血清MMP-3、MMP-9、TGF-β1表達水平，改善癥狀和嚴重程度，為此類患者臨床治療提供一種全新的思路和參考方案。

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2 馬文俊.A型肉毒毒素對膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠模型鎮(zhèn)痛效果及機制的實驗研究〔D〕.太原：山西醫(yī)科大學(xué),2015.

3 吳端生.現(xiàn)代實驗動物學(xué)技術(shù)〔M〕.北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2007:295-312.

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9 梁建紅.膝骨性關(guān)節(jié)炎患者血清白細胞介素-1、6和轉(zhuǎn)化生長因子-β1水平的變化及意義〔J〕.中國基層醫(yī)藥,2014;21(16):2428-9.

10 徐守宇,姚新苗,翟 云,等.膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中HSP70對軟骨細胞凋亡的影響〔J〕.中國骨傷,2012;25(10):846-51.

11 孟慶才,方 銳,呂 剛.維藥買朱尼對骨性關(guān)節(jié)炎Caspase-3的調(diào)節(jié)作用〔J〕.中國民族醫(yī)藥雜志,2007;13(12):62-4.

12 于春偉,叢大忞,楊春曉.辛伐他汀對腦缺血-再灌注損傷大鼠周圍血MIP-3α、BDNF、cleaved Caspase-3表達與mNSS 的影響〔J〕.腦與神經(jīng)疾病雜志,2015;23(5):358-62.

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〔2016-09-20修回〕

(編輯 徐 杰)

Effect of simvastatin on expression levels of MMP-3,MMP-9 and TGF-β1 of rats with osteoarthritis of the knee

SUN Nai-Kun, WANG Yao-Zong, LIU Zhi-Gang,etal.

The First Affiliated Hospital of Xiamen University, Xiamen 361003, Fujian, China

Objective To discuss the effect of simvastatin on expression levels of matrix metalloproteinase (MMP) -3, MMP-9 and transforming growth factor (TGF) -β1 of rats with osteoarthritis of the knee,and to explore the mechanism of action.Methods 40 successful modeling rats with osteoarthritis of the knee induced by collagen were randomly divided into model,low dose,middle dose and high dose groups,and another 10 rats without modeling were selected as the control group.The low,middle and high dose groups were respectively given 0.01,0.1,0.5mg/ml of simvastatin diluted solution,with the dose of 0.2 ml/kg,then the control and model groups were given same dose of sterile saline to fill the stomach at the same time.6 weeks later, the expression of Caspase-3 was detected by immunohistochemistry.The changes of serum levels of MMP-3, MMP-9, and TGF-β1 before medication,after 3 and 6 weeks were compared among the 5 groups,as well as the expressions of Caspase-3,then the mechanism of action of simvastatin on rats with osteoarthritis of the knee was analyzed.Results The expression levels of serum MMP-3, MMP-9, and TGF-β1 in the control group before medication were significantly lower than that in the other groups (P<0.05),and the levels in the low,middle and high dose groups were significantly decreased with the increase of medication time (P<0.05),then the levels after 3 weeks and 6 weeks were ranked from high to low as follows:the model group,low dose group,middle dose group ,high dose group and control group (P<0.05).The OD value of Caspase-3 in the high dose group was far higher than that in the middle and low dose groups (P<0.05),while the value in the middle dose group was far higher than that in the low dose group (P<0.05),as well as the value in the low dose group was far higher than that in the control group and model group (P<0.05),but there was no significant difference between the control group and model group (P>0.05).Conclusions Simvastatin can improve the serum levels of MMP-3, MMP-9, and TGF-β1 in rats with osteoarthritis of the knee,and in a certain range the higher the dose,the better the effect,and it can be speculated that it may be related to the abnormal activation of Caspase-3.

Simvastatin;Osteoarthritis of the knee;Matrix metalloproteinases; Transforming growth factor β1

國家自然科學(xué)基金(81201383)；安徽省教育廳自然科學(xué)基金(KJ2001Z204)

孫乃坤(1981-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事骨科方面研究。

R684.3

A

1005-9202(2017)05-1050-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.004

1 廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院骨科 2 吉林大學(xué)第二醫(yī)院骨科

3 安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院骨二科