王冬梅 趙然尊 石 蓓 徐 娟 龍仙萍

(遵義醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，貴州 遵義 563000)

酒精性心肌病模型大鼠縫隙連接蛋白異常表達(dá)的機(jī)制

王冬梅 趙然尊 石 蓓 徐 娟 龍仙萍

(遵義醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，貴州 遵義 563000)

目的 探討縫隙連接蛋白(Cx)異常表達(dá)在酒精性心肌病大鼠發(fā)病中的作用。方法 50只清潔級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、U0126低劑量、中劑量和高劑量組(n=10)。采用4.0%乙醇(1次/d，持續(xù)12 w)復(fù)制酒精性心肌病模型，分析U0126治療后各組大鼠心功能變化及Cx的表達(dá)變化。結(jié)果 酒精性心肌病大鼠心功能及左心室指數(shù)和心臟指數(shù)存在明顯異常，且U0126能夠有效改善大鼠心功能和異常的心臟指數(shù)(P<0.05)；血清Cx40、Cx43和Cx45蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)，而Ras、Raf、MEK、ERK1/2、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2、MMP9和MMP10的表達(dá)明顯升高，U0126能有效恢復(fù)上述蛋白的異常表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論 大鼠酒精性心肌病的發(fā)病過(guò)程與Cx及MMPs異常表達(dá)有關(guān)，且可能是藥物治療的靶點(diǎn)。

酒精性心肌病；縫隙連接蛋白；基質(zhì)金屬蛋白酶

長(zhǎng)期酒精攝入能夠引起機(jī)體全身性病理改變，導(dǎo)致器官功能異常，如酒精性脂肪肝、酒精性低血糖、神經(jīng)戒斷綜合征、胃黏膜急性損傷等〔1,2〕。酒精性心肌病是過(guò)量飲酒引起的心臟功能異常，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，目前其發(fā)病率有逐年升高的趨勢(shì)〔3,4〕，但目前其發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床上也缺乏特效的治療手段?？p隙連接蛋白(Cx)是細(xì)胞間物質(zhì)和信息交流的重要通道，也是心臟功能維系和心肌組織損傷的重要蛋白〔5,6〕。本研究擬分析酒精性心肌病大鼠Cx異常表達(dá)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 清潔級(jí)雄性SD大鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重220～250 g。所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，自由飲水。50只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、U0126低、中、高劑量組(n=10)。

1.2 模型復(fù)制 除對(duì)照組外，其余各組大鼠每日自由飲用體積分?jǐn)?shù)為4.0%的乙醇水溶液，持續(xù)12 w復(fù)制酒精性心肌病大鼠模型。對(duì)照組每日飲用純化水。對(duì)照組和模型組大鼠給予生理鹽水灌胃治療，U0126低、中、高劑量組大鼠分別給予1、10、100 mg/kg的U0126灌胃治療。

1.3 試劑及儀器 Cx40、Cx43檢測(cè)試劑盒購(gòu)自R&D公司；Cx45蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；Ras、Raf蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Amresco公司；絲裂原細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(MEK)蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Sigma公司；細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Santa Cruz公司；基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2、MMP9蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；MMP10檢測(cè)試劑盒購(gòu)自IBL公司；冷凍離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自ABI公司；U0126購(gòu)自Sigma公司。

1.4 檢測(cè)指標(biāo) 分析各組大鼠心功能左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末期壓(LVEDP)、左心室內(nèi)壓最大上升率(+dp/dtmax)、左心室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)及心臟指數(shù)變化，并檢測(cè)心肌組織Cx40、Cx43和Cx45蛋白及Ras、Raf、MEK、ERK1/2、MMP2、MMP9和MMP10的表達(dá)變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件行方差分析、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心功能變化及U0126的干預(yù)分析 模型組大鼠心功能及左心室指數(shù)和心臟指數(shù)存在明顯異常，U0126能夠有效改善大鼠心功能和異常的心臟指數(shù)(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠心功能變化及U0126的干預(yù)分析

與對(duì)照組相比:1)P<0.05；與模型組相比:2)P<0.05，3)P<0.01；下表同

2.2 各組大鼠血清Cx40、Cx43、Cx45表達(dá)變化及U0126的干預(yù)分析 模型組大鼠血清Cx40、Cx43和Cx45蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)，且U0126能夠有效改善上述蛋白的異常表達(dá)(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 各組大鼠心肌組織Ras和Raf蛋白表達(dá)變化及U0126的干預(yù)分析 模型組大鼠心肌組織Ras和Raf蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)，且U0126能夠有效改善上述蛋白的異常表達(dá)(P<0.05)，見(jiàn)表3。

2.4 各組大鼠心肌組織MEK及ERK1/2蛋白表達(dá)變化及U0126的干預(yù)分析 模型組大鼠心肌組織MEK及ERK1/2蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)，且U0126能夠有效改善上述MEK及ERK1/2蛋白的異常表達(dá)(P<0.05)，見(jiàn)表4。

2.5 各組大鼠心肌組織MMPs表達(dá)變化及U0126的干預(yù)分析 模型組大鼠心肌組織MMP2、MMP9和MMP10蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)，且U0126能夠有效改善上述異常表達(dá)(P<0.05)，見(jiàn)表5。

表2 各組大鼠血清Cx40、Cx43、Cx45 表達(dá)變化及U0126的干預(yù)分析

表3 各組大鼠心肌組織Ras和Raf蛋白表達(dá)變化及 U0126的干預(yù)分析

表4 各組大鼠心肌組織MEK及ERK1/2蛋白 表達(dá)變化及U0126的干預(yù)分析

表5 各組大鼠心肌組織MMPs 表達(dá)變化及U0126的干預(yù)分析

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)酒精性心肌病大鼠心功能及左心室指數(shù)和心臟指數(shù)存在明顯異常，且U0126能夠有效改善大鼠心功能和異常的心臟指數(shù)；而且大鼠酒精性心肌病的發(fā)病過(guò)程與Cx及MMPs異常表達(dá)有關(guān)，且可能是藥物治療的靶點(diǎn)。

Cx是心肌組織損傷和藥物改善心臟功能過(guò)程的重要參與蛋白，也是心肌細(xì)胞間物質(zhì)和能量交換的主要通道〔7，8〕。在研究硫化氫對(duì)糖尿病大鼠心肌纖維化及Cx43表達(dá)影響的研究中發(fā)現(xiàn)，Cx43表達(dá)與大鼠心肌纖維化過(guò)程密切相關(guān)，且硫化氫改善心肌組織異常與其調(diào)控Cx43表達(dá)異常有關(guān)〔9〕。以往的研究也發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子TBX3及Cx43等表達(dá)參與了小鼠胚胎心發(fā)育的生理學(xué)過(guò)程〔10〕，且麝香保心丸對(duì)心力衰竭大鼠的心肌保護(hù)作用與其改善心肌重構(gòu)和Cx43、Cx45的異常表達(dá)密切相關(guān)〔11〕。肖婷等〔12〕也發(fā)現(xiàn)硫化氫對(duì)糖尿病大鼠心肌纖維化治療效果與其調(diào)節(jié)大鼠心肌組織中Cx40、Cx45表達(dá)異常有關(guān)。袁勇華等〔13〕也發(fā)現(xiàn)黃芪對(duì)擴(kuò)張型心肌病大鼠心肌Cx43表達(dá)的影響是其治療擴(kuò)張型心肌病的重要機(jī)制。本研究也發(fā)現(xiàn)Cx表達(dá)異常是酒精性心肌病發(fā)病的重要過(guò)程。MMPs家族是心肌組織細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)的關(guān)鍵蛋白，也是心肌功能異常及心臟損傷的重要生物大分子〔14，15〕。在分析急性心肌梗死PCI治療后血清MMP9、C反應(yīng)蛋白變化及意義的研究中發(fā)現(xiàn)，MMP9是PCI治療心肌梗死效果的重要蛋白〔16〕，且康心飲治療缺血性心肌病大鼠效果與其調(diào)節(jié)心肌組織中MMP2、MMP9及TIMP2的表達(dá)有關(guān)〔17〕。以往的研究也發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀對(duì)糖尿病心肌病患者的治療效果與血清MMP2水平變化密切相關(guān)〔18〕，且大劑量瑞舒伐他汀對(duì)急性心肌梗死患者的心功能改善作用也與MMP9的表達(dá)恢復(fù)有關(guān)〔19〕。本研究提示MMPs也是藥物干預(yù)酒精性心肌病的重要潛在靶點(diǎn)。

因此，大鼠酒精性心肌病的發(fā)病過(guò)程與Cx及MMPs異常表達(dá)有關(guān)，且可能是藥物治療的靶點(diǎn)。

1 武占強(qiáng),張紅霞.超聲心動(dòng)圖對(duì)酒精性心肌病診斷及預(yù)后評(píng)估的臨床意義〔J〕.臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)電子雜志,2015；21(34):7101-2.

2 齊欣彤,劉 越,尹新華.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與酒精性心肌病的關(guān)系研究進(jìn)展〔J〕.心臟雜志,2014;9(6):737-9.

3 江 宇,韓鐘霖,曹克將,等.酒精性心肌病小鼠心電圖校正QT間期延長(zhǎng)的電生理機(jī)制探討〔J〕.中國(guó)循環(huán)雜志,2015;11(4):374-8.

4 馬旭閣,周立君,趙繼義.酒精性心肌病發(fā)病機(jī)制研究新進(jìn)展〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述,2015;25(20):3678-80.

5 王 凱.蛋白激酶C對(duì)晚期運(yùn)動(dòng)預(yù)處理心肌保護(hù)效應(yīng)中縫隙連接蛋白43表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志,2015;18(11):1079-84.

6 王糧山,顧承雄.心肌梗死后縫隙連接蛋白43重構(gòu)與室性心律失?！睯〕.中國(guó)循環(huán)雜志,2015;27(11):1120-2.

7 鐘江華,陳小盼,陸士娟,等.正常家兔左心室三層心肌Cx43表達(dá)的異質(zhì)性研究〔J〕.海南醫(yī)學(xué),2016;10(4):517-9.

8 李華波,陳世健,胡建華,等.通心絡(luò)對(duì)心肌梗死大鼠心室縫隙連接蛋白43重構(gòu)及室性心律失常的影響〔J〕.中國(guó)病理生理雜志,2015;8(2):274-8.

9 羅 健,吳志雄,李 芳,等.硫化氫對(duì)糖尿病大鼠心肌纖維化及縫隙連接蛋白43的影響〔J〕.臨床心血管病雜志,2015;12(2):188-90.

10 石 銳,景 雅,師 亮,等.核纖層蛋白A、轉(zhuǎn)錄因子TBX3、縫隙連接蛋白43表達(dá)與小鼠胚胎心發(fā)育〔J〕.解剖學(xué)報(bào),2015;7(2):238-43.

11 吳志雄,江振濤,羅 健,等.麝香保心丸對(duì)心力衰竭大鼠心肌重構(gòu)及縫隙連接蛋白Cx43和Cx45的影響〔J〕.中成藥,2015;18(6):1329-32.

12 肖 婷,羅 健,吳志雄,等.硫化氫對(duì)糖尿病大鼠心肌纖維化及CX40和CX45表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2015;35(21):6025-7.

13 袁勇華,何學(xué)華,方亦兵,等.黃芪對(duì)擴(kuò)張型心肌病大鼠心肌縫隙連接蛋白43表達(dá)的影響〔J〕.臨床兒科雜志,2014;15(11):1080-3.

14 劉科彤,王 新,趙 迪.冠脈介入治療對(duì)不穩(wěn)定型心絞痛患者炎癥因子及肌鈣蛋白I、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、氨基末端腦鈉肽前體的影響〔J〕.海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2015;9(11):16-8.

15 許 濤,劉和俊.血清白介素-18、基質(zhì)金屬蛋白酶-9及血漿纖維蛋白原與急性冠脈綜合征冠脈病變程度的相關(guān)性研究〔J〕.安徽醫(yī)藥,2016;10(2):308-12.

16 劉儉雄,石 理,李 軍,等.急性心肌梗死PCI治療后血清基質(zhì)金屬蛋白酶9、C反應(yīng)蛋白、P選擇素的變化及意義〔J〕.山東醫(yī)藥,2016;7(5):64-5.

17 樓莉峰,鐘劍平,陳 飛,等.康心飲對(duì)缺血性心肌病大鼠心肌MMP-2、MMP-9及TIMP-2表達(dá)的影響〔J〕.國(guó)醫(yī)論壇,2016;10(1):52-4.

18 于 萍,于 健,王楊陽(yáng).阿托伐他汀對(duì)糖尿病心肌病患者血清基質(zhì)金屬蛋白酶-2及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α水平的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2015;35(23):6767-9.

19 吳小燕,吉貞料,陳小紫.大劑量瑞舒伐他汀對(duì)急性心肌梗死患者的心功能和MMP-9及hs-CRP的影響〔J〕.河北醫(yī)藥,2015;16(23):3547-9.

〔2016-06-15修回〕

(編輯 徐 杰)

貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助(No.20132326)

石 蓓(1964-)，女，碩士，主任醫(yī)師，主要從事心血管內(nèi)科方向的研究。

王冬梅(1977-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事心血管內(nèi)科方向的研究。

R54

A

1005-9202(2017)04-0820-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.015