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        克氏原螯蝦消化道一種新型抗菌物質(zhì)的分離與鑒定

        2017-03-24 18:30:53黃暢高建軍
        環(huán)球人文地理·評論版 2016年11期
        關(guān)鍵詞:克氏原螯蝦抑菌活性分離

        黃暢+高建軍

        摘要:克氏原螯蝦(Procambarus clarkii )俗稱口味蝦,是我國南方的著名食用蝦,也是目前全世界養(yǎng)殖范圍最廣的淡水螯蝦。我們選擇活體克氏原螯蝦腸道組織為材料,經(jīng)過超聲破碎、高效液相色譜分離、質(zhì)譜和光譜分析、抗菌活性檢測。發(fā)現(xiàn)螯蝦腸道含有一種相對分子質(zhì)量為245.17的新型化合物PC245,其最大吸收波長237nm,同時對嗜水氣單孢菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有明顯的抑菌作用。實驗結(jié)果表明:該抗菌活性物質(zhì)是一種廣譜、高效的新型抗菌天然產(chǎn)物,

        具有潛在的開發(fā)利用價值。

        關(guān)鍵詞:克氏原螯蝦;消化道;抑菌活性;分離;鑒定

        人類為了預(yù)防、治療微生物引起的疾病傳播,發(fā)明了多種有效抗菌物質(zhì),并將它們添加到食品、日用品和保健品中,其中使用最廣泛的就是抗生素。然而由于抗生素類藥物的大量長期使用,導(dǎo)致了耐藥細(xì)菌甚至超級細(xì)菌的出現(xiàn),給動植物細(xì)菌病的防治帶來了嚴(yán)重的挑戰(zhàn)[1]。因此開發(fā)新的抗菌藥物,突破抗生素耐藥性難題,已經(jīng)成為當(dāng)今世界關(guān)注的焦點和研究的熱點。

        從動植物和微生物中提取天然抗菌活性物質(zhì)是尋找新型抗菌藥物的重要途徑,因為天然抗菌活性物質(zhì)具有高效、低毒、無污染和來源廣等特點,可以有效抑制細(xì)菌的生長,同時也不會對環(huán)境造成污染,產(chǎn)生抗藥性[2]。

        克氏原螯蝦屬甲殼綱,十足目,蝲蛄科,螯蝦亞科,原螯蝦屬,體黑紅色;原產(chǎn)于美國、墨西哥以及古巴的淡水中[3]。日本在1918年作為牛蛙餌料從美國引入,1929年從日本引入我國南京地區(qū),現(xiàn)主要分布于長江中下游各水域,并成為我國淡水蝦類養(yǎng)殖的一種重要資源;同時又是生態(tài)競爭優(yōu)勢而導(dǎo)致破壞性危害的外來物種[4]。螯蝦可以在滿布細(xì)菌、比較骯臟、受污染的水體中生活,同時靠水中腐敗的植物和動物尸體為食的獨特食性,這為研究抗菌肽的多樣性和適應(yīng)性提供了理想的材料,本文以克氏原螯蝦為材料,從消化道分泌物中分離新型抗菌活性化合物,并對其結(jié)構(gòu)和抑菌活性進(jìn)行研究。

        1 材料

        1.1 材料??耸显r從湖南岳陽鄉(xiāng)下購得。嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)由中南林業(yè)科技大學(xué)提供。

        1.2 試劑與儀器。三氟乙酸(TFA),Sigma 公司生產(chǎn);乙腈,Merck公司生產(chǎn);HCCA(-氰基- 4-羥基肉桂酸) ,美國ICN 生物醫(yī)學(xué)公司生產(chǎn);高效液相色譜儀(Alliance 2695與1525),美國Waters公司;C- 18色譜柱(250mm×20.00mm和250mm×4.60mm),美國菲羅門公司;質(zhì)譜儀(MALDI- TOF/ TOF),德國Bruker公司;高速冷凍離心機(jī)(5804R),美國Eppendorf公司;高壓滅菌鍋(HVE- 50)美國HIRAYAMA公司。

        1.3 培養(yǎng)基。LB液體培養(yǎng)基: 稱取LB固體培養(yǎng)基1.8 g溶于100 mL蒸餾水中,煮沸至完全溶解,分裝于試管,121℃高壓滅菌20 min,備用。

        MH固體培養(yǎng)基(MH瓊脂平板) : 稱取Mueller- Hinton瓊脂(MHA) 3.8 g溶于100 mL蒸餾水中,煮沸至完全溶解,121℃高壓滅菌20 min,冷卻至55℃傾注平板,備用。

        2 方法

        2.1 螯蝦腸道抗菌活性物質(zhì)提取。選擇新鮮的克氏原螯蝦,在蝦頭部剪一個口子,然后從該開口處沿蝦背部剪開至蝦尾,得到蝦腸,清除脂肪、腸道內(nèi)容物后剪碎。先用組織搗碎機(jī)搗碎,再用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)破碎10次,每次3s。加入超純水4℃攪拌過夜。次日將混合物于4℃、8000r/min離心30min,取上清液冷凍干燥即為抗菌活性物質(zhì)粗提物。

        2.2 反相高效液相色譜純化。第一次反相色譜純化在配備1525泵和2487雙波長檢測器的高效液相色譜系統(tǒng)上進(jìn)行;收集各洗脫峰,并經(jīng)冷凍干燥后,保存?zhèn)溆?。目的組分第二次反相色譜純化在配備2489雙波長檢測器的Alliance 2695系統(tǒng)上進(jìn)行;流動相采用二元梯度:A液含0.1%三氟乙酸水溶液,B液含0.1%三氟乙酸的乙腈;檢測波長為280nm與215nm雙波長;柱溫箱為35℃;分析型C- 18色譜柱為(250mm×4.60mm美國菲羅門公司的Lunar柱)。洗脫梯度見表1。

        2.3 質(zhì)譜分析。質(zhì)譜分析在Bruker公司Micro- TOF QII上進(jìn)行。對篩選得到的目標(biāo)樣品用50%蒸餾水與50%的乙腈溶解后,加入0.1%的甲酸混勻,進(jìn)樣;霧化氣為氮氣,正離子模式下測定目標(biāo)組分的相對分子質(zhì)量。

        2.4光譜分析。在日立UV2300紫外/可見分光光度儀上進(jìn)行。波長范圍:200~1100nm;掃描速度:100nm/min;自動切換波長為340nm。將篩選得到的樣品體積100L進(jìn)行全波長掃描,測定目標(biāo)組分的吸收波長。

        2.5 抑菌活性分析。采用紙片擴(kuò)散法測定抑菌效果。將試驗菌復(fù)蘇,按0.1%的接種量搖菌培養(yǎng)14- 16h;然后按每平板100- 200 L均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板( 9 cm),待稍干后貼上無菌濾紙片(6 mm),在各個濾紙片上分別滴加10、20、30、40L各洗脫峰凍干樣品(40 mg/ml);同時設(shè)置滴加無菌生理鹽水(20 L)為空白對照;4℃靜置3h,37℃恒溫培養(yǎng)24 h,測定抑菌圈的大小,以判斷目標(biāo)樣品的抑菌效果。

        3 結(jié)果與分析

        3.1螯蝦腸道組織樣品制備。螯蝦腸道組織經(jīng)超聲波破碎提取后,離心并取上清冷凍干燥,粗提樣品為淡黃色粘稠狀的固態(tài)物質(zhì)。粗提樣品的檢測、純化、活性分析,每次用50ml蒸餾水溶解,0.22μm針式過濾頭過濾后待用。

        3.2反相高效液相色譜純化。螯蝦腸道組織粗提樣品經(jīng)HPLC分離,在280nm和215nm雙波長檢測條件下,螯蝦腸道組織粗提樣品得到10個比較大的吸收峰,其中保留時間最短為4.75分鐘,最長為30.42分鐘。抑菌試驗篩查實驗顯示色譜純化中保留時間為4.75分鐘的洗脫峰對嗜水氣單孢菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具明顯的抑菌效果。因此,選擇該洗脫峰作為目標(biāo)組分進(jìn)行二次純化(見圖1)。

        從圖1可看到帶星號的洗脫主峰是目標(biāo)峰,旁邊還有幾個小峰,洗脫溶液無色透明,說明目標(biāo)組分通過二次純化后變得更純了。

        3.3 質(zhì)譜分析。目標(biāo)組分經(jīng)質(zhì)譜分析結(jié)果見圖2。從圖可知:目標(biāo)組分主峰的相對分子質(zhì)量為246.17(M+H+),據(jù)此,將該樣品組分命名為PC245;同時,質(zhì)譜分析圖上沒有出現(xiàn)其它較大的分子離子峰,說明二次反相純化后,目標(biāo)組分樣品非常純。

        3.4光譜分析。目標(biāo)組分經(jīng)UV2300紫外/可見分光光度儀分析結(jié)果見圖3。從圖3可知:目標(biāo)組分在237 nm波長處有最大吸收峰,峰值為0.419。

        3.5抑菌活性測定。將目標(biāo)組分PC245對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、嗜水氣單胞菌的抑菌實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計,見圖4、圖5、圖6的抑菌效果。

        圖4 PC245對大腸桿菌的抑制作用

        圖4沿順時針方向滴加樣品體積數(shù)分別為10、20、30、40 μL,平板中間的濾紙片滴加無菌生理鹽水作對照。

        圖5沿順時針方向滴加樣品體積數(shù)分別為10、20、30、40μL,平板中間的濾紙片滴加無菌生理鹽水作對照。

        圖6沿逆時針方向滴加樣品體積數(shù)分別為10、20、30、40 μL。平板中間的濾紙片滴加無菌生理鹽水作對照。

        從圖4、5、6可看到:在濾紙片的周圍出現(xiàn)透明抑菌圈,且抑菌圈的大小隨樣品體積的增加而增大,說明有量、效關(guān)系;同時也可看到PC245對嗜水氣單胞菌的抑菌圈比大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的更大、更清晰、更透明,說明PC245對嗜水氣單胞菌的抑菌效果更好。

        4 討論

        提取天然抗菌活性物質(zhì)來防治細(xì)菌病已經(jīng)成為動植物抗菌制劑開發(fā)的新趨勢。從克氏原螯蝦消化道提取抗菌活性物質(zhì)是找尋抗菌活性化合物的一種新思路[5]。

        大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和嗜水氣單孢菌是三種常見的致病菌,其中嗜水氣單胞菌廣泛存在于水體環(huán)境中,是造成淡水蝦、魚類出現(xiàn)敗血癥的病原菌[6]。

        本項目將從活體克氏原螯蝦獲得的腸道組織進(jìn)行超聲破碎提取,經(jīng)高效液相色譜分離純化,得到一種新型化合物PC245;紫外/可見分光光度掃描顯示PC245在237nm波長處的紫外區(qū)具最大吸收波長,分子量比較小,親水性強(qiáng),推測是一種小分子有機(jī)化合物;抑菌實驗證明PC245對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和嗜水氣單孢菌均具有抑制效果,而且在相同濃度下,PC245對嗜水氣單孢菌抑制作用更明顯,但是PC245的化學(xué)結(jié)構(gòu)還需進(jìn)一步確認(rèn),其完整生物學(xué)活性也有待更深入的研究。

        參考文獻(xiàn)

        [1] 馬蘇,高艷美.動物源細(xì)菌耐藥性對動物細(xì)菌傳染性疾病防治的影響[J].中國獸藥雜志, 2012,(2):50-52.

        [2] 操慶國,國欽,黃敏等.天然抗菌物質(zhì)研究進(jìn)展[J].保鮮與加工.,2006,(3):10-12.

        [3] 王順昌.克氏螯蝦的生物學(xué)和生態(tài)養(yǎng)殖模式[J].淡水漁業(yè), 2003, 33(4): 59-61.

        [4]徐加濤等.克氏原螯蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展背景、現(xiàn)狀與展望[J].水產(chǎn)科技情報,2011,38(4):172-180.

        [5] 蘇建明等.草魚腸道抗菌肽的提取及體外抑菌效果初步研究[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版).2009,35(2):162-165.

        [6] 劉振興等.嗜水氣單胞菌對克氏原螯蝦免疫相關(guān)因子活性的影響[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2011, 30(3): 358~363.

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