徐 娜 許凱揚(yáng) - 方 芳 舒孝順 - 李赤翎 -

(長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410114)

黃櫨(Cotinuscoggygriascop.)為漆樹(shù)科黃櫨屬植物，一直被用作保持水土的防護(hù)林和園林綠化的景觀植物。近代研究表明其具有抑制前列腺素生成、解痙、抗腫瘤及治療黃疸型病毒肝炎等作用[1-3]，其中，漆黃素為主要有效成分[4]，含量由葉、莖枝、根依次遞減[5]。此外，由于漆黃素化學(xué)結(jié)構(gòu)式中B環(huán)上存在鄰苯二酚羥基，故也常用作抗氧化劑[6]，可用于功能性食品、藥品的開(kāi)發(fā)。目前對(duì)于漆黃素的研究主要集中在提取、應(yīng)用等方面[7-8]，而有關(guān)漆黃素分離純化的研究，報(bào)道較少[9]。

柱色譜技術(shù)是植物功能成分分離的常用方法，發(fā)展迅速，已經(jīng)應(yīng)用到生物醫(yī)藥工程等各個(gè)領(lǐng)域。張偉[10]、王克勤[11]、苗建武[12]等分別對(duì)聚酰胺樹(shù)脂分離山楂提取物中的總黃酮、芹菜黃酮、丹參總酚酸的工藝進(jìn)行了研究。由于漆黃素富含羥基，可通過(guò)分子中的酚羥基與聚酰胺分子中的酰胺基形成氫鍵蒂合產(chǎn)生吸附[11]，故本試驗(yàn)擬以黃櫨葉粗提物為原料，研究聚酰胺分離純化黃櫨葉漆黃素的工藝條件，旨在為漆黃素的開(kāi)發(fā)和利用提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

黃櫨葉：購(gòu)于河南南陽(yáng)，烘干粉碎后置陰涼干燥處備用；

漆黃素標(biāo)準(zhǔn)品：西安匯林生物科技有限公司；

聚酰胺：80～100目，武漢立思捷科技有限公司；

氫氧化鈉、鹽酸、無(wú)水乙醇：分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電熱鼓風(fēng)干燥箱：101A-2型，天津市泰斯特儀器有限公司；

中草藥粉碎機(jī)：FW177型，天津市泰斯特儀器有限公司；

精密電子天平：FA2014型，天津天馬衡基儀器有限公司；

超聲波清洗機(jī)：SB3200D型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-52型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV-5200型，上海元析儀器有限公司；

層析柱：φ2 cm×30 cm，武漢立思捷科技有限公司；

恒溫振蕩器：THZ-C型，蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 聚酰胺樹(shù)脂的預(yù)處理與回收 市售的聚酰胺用乙醇浸泡2 h，用3～4倍體積的乙醇洗至溶液透明后蒸至無(wú)殘留物。再依次用2倍體積5%的NaOH溶液、1倍體積蒸餾水、2～3倍體積10%的醋酸溶液洗滌，最后用蒸餾水洗至中性，濾取樹(shù)脂，自然晾干，備用。使用過(guò)的聚酰胺一般用5%的NaOH溶液洗滌，洗至NaOH溶液顏色很淡，然后水洗，再用10%的醋酸液洗，最后用蒸餾水洗至中性即可[13]。

1.2.2 粗提物的制備 稱取粉碎后黃櫨葉500 g，用60%的丙酮溶液(5 000 mL)超聲提取30 min，過(guò)濾，重復(fù)2次，合并濾液，濃縮至無(wú)丙酮味，冷凍干燥，測(cè)得漆黃素含量后備用。

1.2.3 漆黃素的測(cè)定 采用紫外分光光度法[14]。

(1) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取漆黃素標(biāo)準(zhǔn)品2.00 mg，用60%丙酮溶解，定容至100 mL容量瓶中。精確吸取0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00 mL于10 mL容量瓶中，用60%丙酮定容至刻度，在最大吸收峰366 nm處測(cè)定其吸光度，所得數(shù)據(jù)經(jīng)回歸處理，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A=0.075 9C-0.027 3，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 7。

(2) 樣品漆黃素的測(cè)定：取一定量樣品，按漆黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法測(cè)定樣品吸光度，帶入回歸方程得出濃度。

1.2.4 靜態(tài)吸附試驗(yàn)

(1) 上樣量的確定：分別稱取聚酰胺0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 g，加適量的水充分膨脹后(以下均做此處理)，再分別加入漆黃素濃度為0.267 9 mg/mL提取液20 mL，振蕩24 h后，吸取上清液測(cè)定漆黃素濃度，按式(1)和(2)計(jì)算吸附量和吸附率。

(1)

(2)

式中：

X1——吸附量，mg/g；

X2——吸附率，%；

C0——初始濃度，mg/mL；

C1——吸附后濃度，mg/mL；

V——吸附液體積，mL；

W——樹(shù)脂質(zhì)量，g。

(2) 吸附時(shí)間的確定：準(zhǔn)確稱取6 g聚酰胺樹(shù)脂，加入漆黃素濃度為0.267 9 mg/mL的提取液40 mL，振蕩，分別在0.25，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00 h取樣，測(cè)定漆黃素濃度，計(jì)算吸附量。繪制靜態(tài)吸附動(dòng)力曲線圖。

(3) 洗脫劑濃度的選擇：分別稱取9份3 g聚酰胺，加入漆黃素濃度為0.267 9 mg/mL的提取液20 mL，振蕩1 h后，濾出樹(shù)脂，烘干，再分別加入20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%的乙醇溶液各100 mL，振蕩2 h后，取上清液測(cè)定漆黃素濃度，按式(3)和(4)計(jì)算解析量和解析率。

(3)

(4)

式中：

J1——解析量，mg/g；

J2——解析率，%；

C2——解析液濃度，mg/mL；

V——解析液體積，mL；

W——樹(shù)脂質(zhì)量，g。

1.2.5 動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)

(1) 上樣流速的確定：取5 g聚酰胺裝入層析柱中，將3份漆黃素濃度為0.267 9 mg/mL的提取液30 mL分別以0.5，1.0，2.0 mL/min的流速通過(guò)聚酰胺柱，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，收集流出液，測(cè)定漆黃素濃度，計(jì)算吸附率。

(2) 樣品濃度的選擇：取5份5 g聚酰胺裝入層析柱中，分別加入漆黃素濃度為0.267 9，0.535 8，1.071 6，1.607 4，2.143 2 mg/mL的提取液30 mL，以1 mL/min的流速通過(guò)聚酰胺柱，收集流出液，測(cè)定漆黃素濃度，計(jì)算吸附率。

(3) 上樣量的確定：取5 g聚酰胺于層析柱中，加入漆黃素濃度為0.535 8 mg/mL的提取液100 mL，以1 mL/min的流速通過(guò)聚酰胺柱，收集流出液，每10 mL為一管，測(cè)定漆黃素濃度，繪制泄露曲線。

(4) 洗脫劑濃度的確定：取5 g聚酰胺于層析柱中，加入漆黃素濃度為0.535 8 mg/mL的提取液40 mL，以1 mL/min 的流速通過(guò)聚酰胺柱。用水洗至無(wú)色后，分別用10%，30%，50%，70%，90%的乙醇進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液，測(cè)定漆黃素濃度。

(5) 洗脫液用量的確定：取5 g聚酰胺于層析柱中，加入漆黃素濃度為0.535 8 mg/mL的提取液40 mL，以1 mL/min 的流速通過(guò)聚酰胺柱。用水洗至無(wú)色后，用120 mL 體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，每10 mL為一管，測(cè)定漆黃素濃度，繪制洗脫曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 靜態(tài)吸附試驗(yàn)

2.1.1 上樣量的確定 由表1可知，漆黃素量一定時(shí)，吸附率隨樹(shù)脂量的增多而增加。當(dāng)漆黃素量與樹(shù)脂量的比值為1∶372 (g/g)時(shí)，吸附基本達(dá)到飽和，此時(shí)再增加樹(shù)脂量，吸附率變化較少，為節(jié)約成本，宜選擇1∶372 (g/g)為最佳上樣量。

2.1.2 吸附時(shí)間的確定 由圖1可知，吸附量在前1 h內(nèi)增長(zhǎng)較快，1～2 h變化趨于平緩,2 h后基本達(dá)到吸附平衡。這是由于吸附初期，樹(shù)脂表面與漆黃素接觸充分，而吸附后期受到孔容的限制[15]。故選擇1 h為靜態(tài)吸附時(shí)間。

表1 不同上樣量的靜態(tài)吸附測(cè)定結(jié)果

圖1 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線圖Figure 1 kinetics curve diagram of static adsorption

2.1.3 洗脫劑濃度的選擇 由圖2可知，解析率隨乙醇濃度的增加而增大，當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，解析率最大，此后再增加乙醇濃度，解析率變化不大?？紤]效益和成本，宜選擇60%的乙醇為洗脫劑。

圖2 洗脫劑濃度對(duì)解析率的影響Figure 2 Effect of eluent concentration on analytical rate

2.2 動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)

2.2.1 上樣流速的確定 由圖3可知，吸附率隨上樣流速的增加而減小，上樣流速過(guò)大，樣品未被吸附就流出樹(shù)脂柱；流速過(guò)小，試驗(yàn)周期長(zhǎng)。從吸附效果與試驗(yàn)周期考慮，選擇1 mL/min 作為上樣流速。

2.2.2 樣品濃度的選擇 由圖4可知，當(dāng)漆黃素濃度為0.535 8 mg/mL時(shí)，吸附率最大，若再加大樣品濃度，吸附率反而呈下降趨勢(shì)。這是由于過(guò)高的樣品濃度不利于擴(kuò)散和吸附。故選擇0.535 8 mg/mL為上樣濃度。

2.2.3 上樣量的確定 由圖5可知，從40 mL開(kāi)始，漆黃素開(kāi)始發(fā)生泄露，當(dāng)上樣量為70 mL時(shí)，流出液中漆黃素濃度達(dá)到0.404 7 mg/mL，接近進(jìn)樣濃度。故選擇40 mL為最大上樣量，約為2 BV。換算成漆黃素與樹(shù)脂量的比值約為1∶233 (g/g)，與靜態(tài)吸附上樣量1∶372 (g/g)相比，動(dòng)態(tài)吸附效率較高。

圖3 上樣流速對(duì)吸附率的影響Figure 3 Effect of sample velocity on adsorption rate

圖4 樣品濃度對(duì)吸附率的影響Figure 4 Effect of sample concentration on adsorption rate

圖5 泄露曲線圖Figure 5 Leakage curve

2.2.4 洗脫劑濃度的確定 由表2可知，10%，30%，50%，70%乙醇洗脫混合物漆黃素占全部洗脫所得漆黃素量的97%，已洗脫出漆黃素的絕大部分，殘留的漆黃素量較少，從經(jīng)濟(jì)方面考慮，宜選擇70%乙醇作為洗脫劑。

2.2.5 洗脫液用量的確定 由圖6可知，漆黃素含量隨洗脫液用量的增加而增加，第8收集管漆黃素濃度較低，此時(shí)，可以認(rèn)為絕大部分漆黃素已被洗脫下來(lái)。故選擇80 mL作為最適洗脫量，約為4 BV。

表2 不同濃度乙醇洗脫混合后漆黃素含量

圖6 洗脫曲線圖Figure 6 Elution curve diagram

2.3 精制次數(shù)對(duì)漆黃素純度的影響

將黃櫨葉粗提物配置成濃度為0.535 8 mg/mL的溶液，以2 BV為上樣量，1 mL/min的流速通過(guò)80～100目的聚酰胺柱，吸附完成后，水洗至無(wú)色，然后用4 BV體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至無(wú)乙醇味，冷凍干燥，計(jì)算純化物中漆黃素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，重復(fù)精制3次。

表3 精制次數(shù)對(duì)漆黃素純度的影響

由表3可知，黃櫨葉粗提物經(jīng)過(guò)聚酰胺樹(shù)脂的3次吸附和解吸后漆黃素含量由粗品的10.30%升高到了79.82%，純度提高了6.75倍。

3 結(jié)論

樹(shù)脂法具有工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，無(wú)有害殘留物等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于有效成分的分離與純化。而聚酰胺可通過(guò)分子中的酰胺羰基與黃酮類化合物中的酚羥基形成氫鍵蒂合而產(chǎn)生吸附作用，故聚酰胺是分離純化黃酮類化合物較好的吸附劑。本試驗(yàn)考察了聚酰胺分離純化黃櫨葉漆黃素的工藝，確定了最佳條件：上樣流速1 mL/min，樣品濃度0.535 8 mg/mL，上樣量2 BV，洗脫劑為70%的乙醇，洗脫劑用量4 BV，在此工

藝條件下，黃櫨葉粗提物經(jīng)聚酰胺樹(shù)脂精制3次后漆黃素純度提高了6.75倍，表明此分離純化方法可行。但本試驗(yàn)僅對(duì)聚酰樹(shù)脂分離純化黃櫨葉漆黃素的工藝條件進(jìn)行了單因素試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上對(duì)純化條件進(jìn)一步優(yōu)化，可通過(guò)正交或響應(yīng)面試驗(yàn)探究各影響因素之間關(guān)系，為下一步提純工藝提供參考。

[1] 王繼紅. 從木臘樹(shù)中提取非瑟酮的研究[J]. 實(shí)驗(yàn)室科學(xué), 2012, 15(6): 87-89.

[2] 廖洪利, 吳也, 臧志和. 漆黃素抗腫瘤作用研究進(jìn)展[J]. 天津藥學(xué), 2013, 25(6): 44-46.

[3] 李建華, 段丹丹, 馬聰玲, 等. 黃櫨有效成分漆黃素提取工藝研究[J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2012, 27(7): 1 956-1 958.

[4] 陶峰, 顏仁杰, 周海鳳, 等. 黃櫨化學(xué)成分與藥理活性研究進(jìn)展[J]. 世界臨床藥物, 2014, 35(2): 109-112.

[5] 王俊杰, 江善青, 王剛, 等. 黃櫨植物化學(xué)成分、藥理作用與臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 國(guó)際中醫(yī)中藥雜志, 2015, 37(3): 283-285.

[6] 陳興玉, 李萍, 張昌華, 等. 漆黃素與酸、堿、鹽反應(yīng)的動(dòng)態(tài)紫外吸收光譜[J]. 光散射學(xué)報(bào), 2013, 25(4): 429-432.

[7] 陳虹霞, 王成章. 漆樹(shù)黃酮類化合物研究進(jìn)展[J]. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā), 2013, 25(12): 1 752-1 758.

[8] 劉東鋒, 李法慶, 楊成東. 一種漆黃素的提取方法: 中國(guó), 201010500143.0[P]. 2010-10-09.

[9] 龍麗輝, 郭增軍. 黃櫨中漆黃素提取工藝及含量測(cè)定方法的研究進(jìn)展[J]. 中華臨床醫(yī)學(xué)研究雜志, 2006，12(21): 2 937-2 938.

[10] 張偉, 葛志強(qiáng), 蔣建蘭. 聚酰胺樹(shù)脂分離純化復(fù)方山楂提取物中總黃酮的研究[J]. 中草藥, 2009, 40(1): 63-66.

[11] 王克勤, 嚴(yán)志慧, 羅軍武, 等. 聚酰胺樹(shù)脂分離純化芹菜黃酮的工藝研究[J]. 食品與機(jī)械, 2009, 25(3): 46-50.

[12] 苗建武, 陳紹民, 王超, 等. 聚酰胺樹(shù)脂分離純化丹參總酚酸的研究[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2011, 17(3): 28-30.

[13] 周林. 桑枝黃酮提取分離及抗氧化活性研究[D]. 重慶: 西南大學(xué), 2011: 30.

[14] 申慶亮, 李建華, 于盛茂, 等. 紫外分光光度法測(cè)定黃櫨糖漿中漆黃素含量[J]. 中國(guó)中藥雜志, 1990, 15(7): 40-41.

[15] 董江濤. 柿黃酮的提取、純化及抗氧化性研究[D]. 上海: 上海海洋大學(xué), 2010: 43.