陳曉靚 - 郭曉青 - 吳娜怡郁 -- 代甜甜 -

(貴陽護(hù)理職業(yè)學(xué)院，貴州 貴陽 550081)

水芹屬傘科多年生宿根草本水生植物，具有清熱解毒、清肝利膽[1-2]等功效，在提高免疫功能、抗心律失常[3-4]等方面也有一定的功效。目前已有水芹降血糖方面的報(bào)道[5]，但水芹對(duì)2型糖尿病小鼠成模的干預(yù)作用尚未見報(bào)到。本研究用高糖高脂喂養(yǎng)聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)建立2型糖尿病小鼠，考察水芹提取物對(duì)2型糖尿病小鼠成模的影響，旨在研究水芹對(duì)2型糖尿病的干預(yù)作用，降低糖尿病的發(fā)病率，以期為黔產(chǎn)水芹在抗糖尿作用方面的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生水芹：采自貴州省貴陽周邊，將樣品用去離子水清洗干凈，瀝干表面水分，置恒溫干燥箱中60 ℃干燥至恒重，粉碎后過15 μm的篩，密封保存待用；

昆明小鼠：生產(chǎn)許可證為SCXK(黔)2014-0001，動(dòng)物質(zhì)量合格證為小鼠0201403，貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；

普通飼料：許可證號(hào)為SCXK(川)2015-01，四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所；

自制高糖高脂飼料：60%普通飼料、10%白糖、10%豬油、10%蛋黃粉、10%黃豆面；

鏈脲佐菌素：純度>98%，美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

制冷水恒溫振蕩器：SHA-2型，金壇市醫(yī)療儀器廠；

冷凍干燥機(jī)：DYYB-12型，上海德洋意邦儀器有限公司；

高速粉碎機(jī)：ZH-500型，中南制藥機(jī)械廠；

超純水機(jī)：YC-ROI-20Z型，四川怡創(chuàng)科技有效公司；

血糖儀：AW06477503A型，強(qiáng)生醫(yī)療器材有限公司；

電子天平：SL502N型，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 水芹灌胃液的制備 按照參考文獻(xiàn)[6]和[7]的方法，收集水芹水提取粉和醇提粉各3 g。用1%吐溫80的生理鹽水溶解上述不同溶劑提取水芹粉，配制成800 mg/kg水芹灌胃液。

1.3.2 動(dòng)物分組與飼養(yǎng)方法 將120只體質(zhì)量35 g左右雄性小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，期間抽查血糖是否正常。1周后進(jìn)行隨機(jī)分組，分為6組：A組和B組為普通飼料喂養(yǎng)組，C組和D組為高糖高脂飼料喂養(yǎng)組，E組為高糖高脂飼料和水芹水提物灌胃組，F(xiàn)組為高糖高脂飼料和水芹醇提物灌胃組。E組和F組分別給予800 mg/kg水芹灌胃液對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃，灌胃體積控制在6 mL，連續(xù)灌胃4 d后停止1 d再繼續(xù)灌胃，同時(shí)將不同的水芹提取粉配制成濃度為0.012 3 g/mL的溶液，加到小鼠日常飲用水中，從而增大水芹提取物濃度對(duì)小鼠成模的干擾。其他組灌胃液用1%吐溫80的生理鹽水代替，灌胃方式相同。期間小鼠自由進(jìn)食、飲水，且每日更換飲用水，添加足量飼料。

1.3.3 建立STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病小鼠模型 按上述飼養(yǎng)方法喂養(yǎng)5周后，B、D、E、F 4組按75 mg/kg STZ(用0.1 mol/L、pH 4.0的枸櫞酸鈉緩沖溶液配制1% STZ)的小劑量[8]對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔一次性注射，A組和C組按照相同劑量和注射方式注射0.1 mol/L、pH 4.0的枸櫞酸鈉緩沖溶液。注射完畢后，繼續(xù)按照原飼料喂養(yǎng)，并適時(shí)觀察狀態(tài)，記錄小鼠體質(zhì)量(BW)，同時(shí)進(jìn)行尾靜脈取血測(cè)定小鼠空腹血糖值(Fasting Blood-Glucose，F(xiàn)BG)，連續(xù)測(cè)定5周。3周后小鼠空腹血糖值≥11.1 mmol/L并出現(xiàn)多食、多飲、多尿癥狀的小鼠為2型糖尿病小鼠模型[9-12]。

1.3.4 檢測(cè)指標(biāo)

(1) 高糖高脂飼料對(duì)小鼠血脂四項(xiàng)指標(biāo)的影響：按照1.3.2 喂養(yǎng)方法喂養(yǎng)5周后，隨機(jī)從各組取10只小鼠，后腿切斷股動(dòng)脈取血，檢測(cè)血脂四項(xiàng)(甘油三酯TG、膽固醇CHOL、高密度脂蛋白膽固醇HDL-CH、低密度脂蛋白膽固醇LDL-CH)?？疾旄咛歉咧暳蠈?duì)小鼠血脂四項(xiàng)的影響。

(2) 水芹提取物對(duì)2型糖尿病小鼠成模的干預(yù)作用：嚴(yán)格按照1.3.2灌胃劑量對(duì)E組和F組小鼠進(jìn)行灌胃，按1.3.3建模，D組為對(duì)照，適時(shí)觀察小鼠狀態(tài)，測(cè)定小鼠空腹血糖值和體質(zhì)量，確定死亡率及成模率，考察水芹提取物對(duì)2型糖尿病小鼠成模的干預(yù)作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 一般情況觀察

小鼠注射STZ前(造模前)，各組小鼠生長良好(高糖高脂飼料喂養(yǎng)組體質(zhì)量增長較快)，活動(dòng)正常，被毛緊披有光澤，健康有力，墊料干燥。造模 3周后，B組小鼠體質(zhì)量和精神狀態(tài)基本無變化，而D組小鼠出現(xiàn)脫水狀態(tài)，較瘦，皮毛無光澤，飲食量、飲水量和尿量明顯增多，具有典型的“三多一少”癥狀。E組和F組小鼠較D組體質(zhì)量下降較慢，精神狀態(tài)較好，但均無小鼠死亡。

2.2 喂養(yǎng)方式對(duì)小鼠不同指標(biāo)的影響

表1為不同喂養(yǎng)方式小鼠監(jiān)測(cè)指標(biāo)的數(shù)據(jù)。由表1可知，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，各組小鼠體質(zhì)量相當(dāng)。按照各組喂養(yǎng)要求和灌胃標(biāo)準(zhǔn)對(duì)小鼠連續(xù)喂養(yǎng)5周后，A組和B組的平均體質(zhì)量每周增加2 g，血糖值基本穩(wěn)定，而高糖高脂飼料喂養(yǎng)的C～F組平均體重增加較快，達(dá)到每周增加3 g左右，血糖值稍高。其中高糖高脂飼料喂養(yǎng)的C組和D組血脂四項(xiàng)指標(biāo)較其他組明顯升高，空腹血糖值也有所增大，而E組和F組同樣是高糖高脂飼料喂養(yǎng)，但給予水芹灌胃液灌胃結(jié)合水芹水喂養(yǎng)后，小鼠血脂四項(xiàng)指標(biāo)明顯下降，與正常組小鼠相近。因此，高糖高脂飼料喂養(yǎng)小鼠較普通飼料喂養(yǎng)更容易肥胖，更容易出現(xiàn)胰島素敏感性下降，從而模擬了肥胖2型糖尿病患者發(fā)病初期的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。同時(shí)，通過水芹灌胃后小鼠血脂四項(xiàng)指標(biāo)明顯降低，表明水芹具有較好的降低血糖血脂的作用，可有效促進(jìn)胰島素的分泌，提高機(jī)體胰島素水平[13]。

2.3 注射STZ后對(duì)普通飼料B組和高糖高脂飼料D組小鼠血糖濃度的影響

分別給B組和D組小鼠一次性腹腔注射75 mg/kg STZ后，在1，2，3，4，5周內(nèi)監(jiān)測(cè)小鼠空腹血糖值，見表2。普通飼料喂養(yǎng)的B組空腹血糖值沒有明顯升高，3周后空腹血糖控制在6.48～6.62 mmol/L，血糖穩(wěn)定，飲食正常，毛色光滑。小劑量一次性注射STZ 普通飼料喂養(yǎng)的 B組并未成模。高糖高脂飼料喂養(yǎng)的D組注射1周后，小鼠血糖值開始增高，到第3周后空腹血糖均≥26.84 mmol/L，且表現(xiàn)出多飲、多尿等癥狀，表明高糖高脂結(jié)合一次性小劑量注射STZ后D組

表1 喂養(yǎng)方式對(duì)小鼠各指標(biāo)濃度的影響?

? 試驗(yàn)前指適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后；造模前指按照各組喂養(yǎng)要求喂養(yǎng)5周后；血脂四項(xiàng)為造模前數(shù)據(jù)。

表2 B組和D組注射STZ后血糖濃度的影響

成為2型糖尿病小鼠模型。采用高糖高脂飼料聯(lián)合小劑量STZ選擇性破壞胰島功能后，小鼠的血糖逐漸升高，提示小鼠胰島受到高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗和化學(xué)物質(zhì)STZ的雙重打擊以后，胰島功能受到損傷，但單純高糖高脂飲食并不能直接誘發(fā)高血糖和糖尿病[14-16]，只有聯(lián)合小劑量STZ才更容易誘發(fā)小鼠形成2型糖尿病。所以高糖高脂聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的小鼠較普通飼料喂養(yǎng)的小鼠更容易形成2型糖尿病。2型糖尿病小鼠模型建立，最好檢測(cè)高糖高脂對(duì)小鼠胰島素的影響，但正常小鼠胰島素生化檢測(cè)較困難。同時(shí)小鼠血量較少，取血困難，只能采用切斷后腿股動(dòng)脈取血?；谏鲜鲈颍枰M(jìn)行生化檢測(cè)的動(dòng)物試驗(yàn)，建議選用大鼠進(jìn)行建模。

2.4 注射STZ后水芹提取物對(duì)小鼠成模的干預(yù)作用

以D組為對(duì)照組，考察水芹水提物E組和水芹醇提物F組對(duì)2型糖尿病小鼠成模的干預(yù)作用(見表3)。D組、E組和F組按1.3.3方法建立模型。D組小鼠3周后穩(wěn)定成模，血糖值在26.84～28.14 mmol/L，成模率為80%，死亡率為0%。E組和F組進(jìn)行水芹提取物灌胃，2組小鼠體質(zhì)量下降趨勢(shì)平緩，成模率均低于D組，水芹水提物成模率為40%，水芹醇提物成模率為60%，死亡率均為0%，且水芹水提物喂養(yǎng)小鼠血糖值為19.17～18.25 mmol/L，水芹醇提物血糖值為20.56～19.45 mmol/L，2組血糖值均低于D組。第5周后，從第一只小鼠死亡到小鼠全部自然死亡，E組和F組死亡時(shí)間都比D組推遲1周。說明水芹提取物可能存在某類成分或代謝產(chǎn)物，在改善胰島素方面有一定的療效，對(duì)2型糖尿病小鼠成模具有一定的干預(yù)作用，同時(shí)對(duì)小鼠體質(zhì)改變起到積極作用，但其改善胰島素抵抗的機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

表3注射STZ后對(duì)小鼠空腹血糖(FBG)濃度

的影響(第5周)

Table 3 Effect of injection of STZ on fasting plasma glucose (FBG) concentration in mice (fire weeks)

組別BW/g空腹血糖/(mmol·L-1)死亡率/%成模率/%D29．39±1．0526．85±0．59080E45．27±1．0418．25±1．05040F43．35±1．6319．45±1．06060

3 結(jié)論

采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合一次性小劑量注射STZ建立2型糖尿病小鼠模型，水芹水提物和醇提物對(duì)2型糖尿成模具有一定的干擾作用，降低成模成功率；水芹提取物對(duì)小鼠體質(zhì)改善也起到積極作用，小鼠體質(zhì)量下降緩慢，死亡時(shí)間推遲。說明水芹在抗糖尿方面是有一定作用的。但水芹對(duì)成模的干擾作用尚不清楚，需進(jìn)一步深入研究。

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