王 振 劉仲華,2,3 -，2，3 蔡淑賢 ,2,3 -，2，3 劉 安 文 祎

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2. 國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心， 湖南 長沙 410128；3. 湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128)

茶是最普及的一種天然飲料，中國已有長達4 700年的飲茶史[1]。綠茶(Green Tea)是中國主要的未發(fā)酵茶類之一，茶鮮葉經(jīng)殺青、揉捻、干燥等工藝加工而成。近年來消費者越來越能接受喝茶預(yù)防衰老的觀點。綠茶中含有22%～30%多酚類物質(zhì)和其它活性成分[2]，大量研究結(jié)果證明綠茶能夠保護機體氧化還原體系[3-4]，保護線粒體的功能與結(jié)構(gòu)，避免線粒體及細胞功能的衰退，對抗衰老有一定作用[5-6]。

紫外線照射引起人表皮細胞衰老，其表現(xiàn)包括造成機體免疫力減弱，組織及器官功能減退，創(chuàng)傷后修復(fù)變慢等[7][8]36-37。目前茶提取物在抗氧化活性[9]、抗輻射[10]、抗衰老[11]、抗腫瘤[12]、降脂減肥[13]等功效方面已有大量研究報道。在研究綠茶抗衰老效果模型方面，主要以小鼠模型[14-15]、大鼠模型[16]為主，在衰老誘導(dǎo)方式上主要采用自然誘導(dǎo)[17]、D-半乳糖誘導(dǎo)[18]和熱應(yīng)激誘導(dǎo)[19]，而線蟲模型[20]、人皮膚組織模型[21]，紫外線誘導(dǎo)人表皮細胞衰老模型[22]的相關(guān)研究報導(dǎo)較少。諸芳等[16]研究表明，綠茶能提高自然衰老下SD大鼠紅細胞中SOD活力，減少血清中MDA含量。李瓊等[17]的研究表明綠茶多酚能夠提高小鼠血清中SOD和GSH-Px的活性，增加海馬腦區(qū)突觸后致密物-95(PSD95)和鈣離子/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的蛋白表達。但是現(xiàn)階段對于綠茶抗衰老作用的研究往往僅使用抗氧化指標(biāo)或補充部分蛋白指標(biāo)來衡量衰老程度，不夠系統(tǒng)。

本研究擬建立UVB致HaCaT細胞衰老模型，并以綠茶水提物對細胞進行預(yù)處理，檢測不同組細胞相關(guān)指標(biāo)的變化，根據(jù)不同組間差距比較，對綠茶水提物抗衰老作用進行評價。為綠茶抗衰老保健品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

古丈毛尖綠茶：湖南古樓雪峰云霧茶有限公司；

人正常皮膚永生化角質(zhì)形成細胞(HaCaT)：中國典型培養(yǎng)物保藏中心(細胞庫)；

胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基：以色列Biological Industries公司；

磷酸緩沖鹽溶液、二甲基亞砜、噻唑藍(MTT)：生工生物工程(上海)股份有限公司；

RIPA細胞裂解液：江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；

線粒體膜電位檢測試劑盒、ATP酶試劑盒：南京建成生物工程研究所；

Annexin V-FITC試劑盒及DCFH-DA試劑盒：碧云天生物技術(shù)研究所；

BCA蛋白濃度試劑盒：北京康為世紀生物科技有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

超凈工作臺：SW-CJ-1D型，蘇州凈化設(shè)備有限公司；

紫外交聯(lián)儀：CL-1000型，美國UVP公司；

多功能酶標(biāo)儀：Varioskan LUX型，美國Thermo公司；

離心機：EBA 270型，德國Rotina公司；

CO2細胞培養(yǎng)箱：NU-4750E型，美國Nuaire公司；

熒光顯微鏡：IX71型，日本Olympus公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：R-210型，瑞士Buchi公司；

冷凍干燥機：Alpha 1-4型，德國Christ公司；

微孔板恒溫振蕩器：ST60-4型，杭州米歐儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 綠茶水粗提物制備 稱取50 g茶葉，加入500 mL沸水，100 ℃水浴提取30 min，每隔10 min攪拌一次，紗布粗過濾，濾液至回收瓶。過濾后的茶渣重復(fù)提取一次，紗布粗過濾后合并濾液，然后進行抽濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至原體積的1/10，冷凍干燥得到綠茶水粗提物凍干粉，密封包裝，-20 ℃保存。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 將HaCaT細胞接種于10 cm細胞培養(yǎng)皿中，加入含有10%胎牛血清及1%雙抗(青霉素-鏈霉素混合液)的高糖DMEM培養(yǎng)基中。將細胞皿置于CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為溫度37 ℃、5% CO2濃度。當(dāng)細胞生長至90%融合時傳代，使用含有0.25% EDTA的胰酶消化，消化完成后立即使用培養(yǎng)基終止消化，吹打重懸后移至10 mL離心管中離心。棄上清液，使用高糖DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度后接種至所需細胞培養(yǎng)皿中。

1.2.3 細胞分組及處理 待細胞生長融合至70%后，消化細胞，使用高糖DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度(96孔、24孔細胞培養(yǎng)板為5×104mL-1，6孔細胞培養(yǎng)板為2.5×106mL-1)后將細胞分為空白組、UVB模型組、綠茶水粗提物實驗組(GT-1組、GT-5組、GT-10組、GT-20組)接種至所需培養(yǎng)板(皿)中，吸出培養(yǎng)基，再添加不同綠茶水粗提物濃度的DMEM培養(yǎng)基，各組采用細胞培養(yǎng)板(皿)培養(yǎng)6 h后，吸出培養(yǎng)基，加入少量磷酸緩沖鹽溶液(PBS)覆蓋細胞，用紫外交聯(lián)儀對細胞進行紫外線處理，輻照劑量為60 mJ/cm2，空白組使用鋁箔覆蓋。各組處理后立即吸出PBS溶液，向培養(yǎng)板(皿)中加入不含綠茶水粗提物的DMEM培養(yǎng)基，在培養(yǎng)溫度37 ℃、CO2濃度5%條件下培養(yǎng)24 h后，對各指標(biāo)進行監(jiān)測分析。細胞分組及處理情況對照見表1。

表1 細胞分組及樣品處理對照表

1.2.4 細胞形態(tài)觀察 使用熒光顯微鏡進行觀察，儀器進行自動白平衡后收集圖像。

1.2.5 細胞存活率檢測 吸出培養(yǎng)基，向每孔中重新加入100 μL含有0.5 mg/mL噻唑藍(MTT)的DMEM培養(yǎng)基，在培養(yǎng)溫度37 ℃、5% CO2濃度條件下培養(yǎng)4 h，吸出培養(yǎng)基，向每孔中加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，恒溫振蕩器振蕩10 min(溫度25 ℃，振蕩速度100 r/min)，用多功能酶標(biāo)儀測定各孔吸光值，檢測波長為570 nm。根據(jù)吸光值計算不同組細胞存活率，計算公式為：

(1)

式中：

V——細胞存活率，%；

OD1——各孔在570 nm處吸光度；

OD0——空白組各孔在570 nm處平均吸光度。

1.2.6 細胞線粒體膜電位檢測 使用JC-1試劑對細胞進行染色。使用熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果并收集圖像，計算不同組紅綠熒光平均光密度比(AOD紅∶綠)，計算公式為：

(2)

式中：

AOD紅∶綠——各組紅綠熒光平均光密度比；

IOD紅——各組紅色熒光光密度；

IOD綠——各組綠色熒光光密度；

S紅——各組紅色熒光發(fā)光面積，Px；

S綠——各組綠色熒光發(fā)光面積，Px。

1.2.7 細胞內(nèi)抗氧化酶、Na+,K+-ATP酶活力及MDA含量檢測 吸出培養(yǎng)基，使用PBS溶液清洗殘留的培養(yǎng)基，每孔中加入1 mL RIPA細胞裂解液收集細胞。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書要求及步驟測定Na+,K+-ATP酶活力、GSH-Px、SOD、CAT、LDH活性及MDA含量。

1.2.8 細胞內(nèi)ROS測定 吸出培養(yǎng)基，每孔加入200 μL含有10 μmol/mL二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)的無血清DMEM培養(yǎng)基，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)20 min后，使用無血清的DMEM培養(yǎng)基清洗3次，徹底去除殘留的DCFH-DA。在熒光顯微鏡下使用白光及綠光進行觀察，白光進行白平衡后收集圖像，通過不同組平均光密度差異，計算ROS含量，計算公式為：

(3)

式中：

A——ROS含量，%；

AOD1——各組熒光光密度；

IOD0——空白組熒光光密度；

S1——各組熒光發(fā)光面積，PPI；

S0——空白組熒光發(fā)光面積，PPI。

1.2.9 細胞凋亡情況測定 吸出培養(yǎng)基，使用PBS溶液洗滌后依次加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液，5 μL Annexin V-FITC工作液，10 μL碘化丙啶染色液(PI)，置于室溫(20～25 ℃)下避光孵育20 min。孵育結(jié)束后立即在熒光顯微鏡下使用白光、綠光及紅光進行觀察，白光進行白平衡后收集圖像，分析不同組熒光染色情況。

1.3 數(shù)據(jù)分析

以GraphPad Prism 6.02軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用ANOVA進行單因素方差分析；以Image pro plus 6軟件進行光度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠茶水粗提物對紫外誘導(dǎo)衰老細胞形態(tài)的影響

細胞形態(tài)變化是細胞衰老過程中各結(jié)構(gòu)退行性變化的直觀體現(xiàn)，主要包括細胞體積及細胞核體積變大，核膜內(nèi)折，染色質(zhì)固縮，細胞顏色加深等。由圖1可見：空白組細胞生長緊密，細胞呈現(xiàn)梭形。模型組細胞數(shù)量明顯減少，細胞生長松散，細胞體積變小，細胞核體積變大，細胞變圓。各試驗組(GT-1、GT-5、GT-10)細胞減少、細胞變圓、細胞核變大情況較模型組有明顯改善。模型組細胞符合衰老細胞特征，而GT-1、GT-5、GT-10試驗組細胞衰老特征不明顯，說明綠茶水粗提物能保護紫外線誘導(dǎo)后的細胞形態(tài)，降低中波紫外線照射后細胞的衰老水平。

圖1 不同處理組顯微鏡下的細胞形態(tài)圖Figure 1 Cell morphologic map of different treatment groups under microscope

2.2 綠茶水粗提物對紫外誘導(dǎo)衰老細胞存活率的影響

細胞衰老往往伴隨著細胞凋亡水平上升，從而導(dǎo)致細胞存活率下降。由表2可見，與空白組相比，模型組細胞存活率下降至(71.59±2.91)%，兩者在P<0.01水平差異顯著；隨著培養(yǎng)基中綠茶水粗提物濃度的提高，GT-1、GT-5、GT-10、GT-20組的細胞存活率均有明顯提高，其中GT-10組提高到(93.44±6.22)%。GT-5組、GT-10組、GT-20組與模型組相比在P<0.01水平差異顯著，GT-1組與模型組相比在P<0.05水平差異顯著。說明綠茶水粗提物能提高紫外線誘導(dǎo)后的細胞存活率。

2.3 綠茶水粗提物對紫外誘導(dǎo)衰老細胞膜電位的影響

細胞衰老過程中，細胞呼吸功能減退，線粒體活動減弱，線粒體膜兩側(cè)電位降低，表現(xiàn)出線粒體膜去極化的趨勢。線粒體膜電位較高使JC-1能聚集在線粒體基質(zhì)中形成能產(chǎn)生紅色熒光的聚合物；線粒體膜電位下降時，JC-1不會大量在線粒體基質(zhì)中聚集，而是多以單體形式存在，產(chǎn)生綠色熒光。因此，衰老細胞在經(jīng)過JC-1染色后，紅綠熒光平均光密度比會明顯下降。由圖2可見，圖片疊加后空白組圖片色調(diào)偏向橙黃色，而模型組整體偏綠。使用軟件統(tǒng)計空白組、模型組、GT-10組紅綠熒平均光密度，計算得到空白組、模型組、GT-10組紅綠熒光平均光密度比(AOD紅：綠)分別為2.742，2.203，2.506，GT-10組AOD紅：綠相對模型組提高了13.75%。結(jié)果表明，綠茶水粗提物能降低紫外線誘導(dǎo)后的細胞線粒體膜的去極化趨勢。與空白組相比，模型組綠色熒光較強、紅色熒光較弱。在染色過程中，模型組JC-1單體比例較高，即模型組細胞線粒體膜電位較低，表現(xiàn)出較強的線粒體膜去極化的趨勢，而GT-10組去極化趨勢比模型組要小，說明細胞衰老較輕。

表2 不同濃度綠茶水粗提物紫外線誘導(dǎo)處理的細胞存活率?

? *表示試驗組與模型組在P<0.05水平差異顯著，**表示試驗組與模型組在P<0.01水平差異顯著； ##表示模型組與空白組比較在P<0.01水平差異顯著；※各孔差異為(試驗組每個孔存活率/模型組平均存活率)-1，并對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析得到各組存活率差異。

圖2 不同處理組熒光顯微鏡下細胞JC-1染色圖Figure 2 JC-1 staining of cells in different treatment groups under fluorescence microscope

2.4 綠茶水粗提物對紫外誘導(dǎo)衰老細胞Na+，K+-ATP酶活力的影響

Na+，K+-ATP酶在維持細胞膜通透性和細胞正?？缒み\輸中具有重要作用。隨著細胞衰老，細胞內(nèi)Na+，K+-ATP酶活力隨之降低，從而影響到細胞膜正常的生理功能。同時Na+，K+-ATP酶還與細胞膜電位差的形成即細胞興奮相關(guān)，細胞興奮狀態(tài)下新陳代謝得以加強，有助于抵抗衰老。由表3可見，綠茶水粗提物能提高紫外線誘導(dǎo)后的細胞Na+，K+-ATP酶活力。UVB處理后，模型組Na+，K+-ATP

酶活力[(14.25±0.3) U/mg·Prot]明顯低于空白組[(29.86±0.93) U/mg·Prot]，而GT-10組經(jīng)過綠茶水粗提物預(yù)處理后Na+，K+-ATP酶活力能保持在(29.06±0.52) U/mg·Prot，表明綠茶水粗提物能預(yù)防中波紫外線照射引起的細胞衰老。

2.5 綠茶水粗提物對紫外誘導(dǎo)衰老細胞內(nèi)抗氧化酶活力及氧化產(chǎn)物的影響

氧化還原失衡是機體衰老的重要誘因之一[23]，經(jīng)典的小鼠衰老模型是用D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠衰老，以GSH-Px、SOD活力及MDA含量作為衰老指標(biāo)。而CAT作為SOD的下游，能將SOD反應(yīng)產(chǎn)物過氧化氫進一步分解，補充SOD在抗氧化方面的作用。

由表4可見，模型組與空白組相比，細胞內(nèi)GSH-Px、CAT、SOD活力分別下降(77.52±6.33)%，(54.51±4.17)%，(44.46±3.79)%，MDA含量提高(136.64±12.78)%，細胞內(nèi)抗氧化酶活力明顯降低，氧化產(chǎn)物堆積。而GT-1、GT-5、GT-10、GT-20組抗氧化酶活力及MDA含量均有改善，其中GT-10組GSH-Px、CAT、SOD活力分別提高(257.74±110.26)%，(82.52±5.60)%，(72.22±5.79)%、MDA含量下降(50.69±6.81)%，氧化酶活力明顯提高，氧化產(chǎn)物減少。說明綠茶水粗提物能提高紫外線誘導(dǎo)后細胞中GSH-Px、SOD、CAT活力，降低MDA含量，維持細胞內(nèi)氧化還原平衡，預(yù)防中波紫外線照射引起的細胞衰老。

表3 不同濃度綠茶水粗提物紫外線誘導(dǎo)處理的細胞ATP酶活力?

? *表示試驗組與模型組在P<0.05水平差異顯著，**表示試驗組與模型組在P<0.01水平差異顯著；##表示模型組與空白組比較在P<0.01水平差異顯著；※各孔差異為(試驗組每個孔酶活力/模型組平均酶活力)-1，并對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析得到各組酶活力差異。

表4 不同濃度綠茶水粗提物紫外線誘導(dǎo)處理的細胞抗氧化酶活力及MDA含量?

? *表示試驗組與模型組在P<0.05水平差異顯著，**表示試驗組與模型組在P<0.01水平差異顯著；##表示模型組與空白組比較在P<0.01水平差異顯著。

2.6 綠茶水粗提物對紫外誘導(dǎo)衰老細胞內(nèi)ROS含量的影響

生物體衰老是過量自由基積累引起的，ROS在體內(nèi)大量產(chǎn)生，超過機體自身對ROS的清除能力時，ROS會在體內(nèi)大量積累，ROS能與蛋白質(zhì)等大分子交聯(lián)，影響其正常生理功能；同時ROS還會造成mtDNA的損傷，加速細胞衰老[24]。由圖3可見，與空白組細胞相比，模型組綠色熒光較強，細胞內(nèi)ROS含量較高；而GT-10組熒光值較模型組要弱，說明其ROS含量較少。使用軟件對圖片進行分析后發(fā)現(xiàn)，空白組、模型組、GT-10組相對平均光密度分別為49.598，76.222，65.054，以空白組ROS含量為100%，模型組相較空白組ROS含量增加53.67%，GT-10組相較模型組減少17.16%。說明綠茶水粗提物能通過抑制ROS的積累，預(yù)防中波紫外線照射引起的細胞衰老。

圖3 不同處理組熒光顯微鏡下細胞DCFH-DA染色圖

Figure 3 DCFH-DA staining of cells in different treatment groups under fluorescence microscope

2.7 綠茶水粗提物對紫外誘導(dǎo)衰老細胞凋亡水平的影響

細胞衰老過程往往伴隨著細胞凋亡，細胞衰老時ROS積累，氧化水平上升引起線粒體膜通透性改變，線粒體釋放細胞色素C(Cyt-C)，激活Caspase-9進入激活Caspase-3，形成凋亡小體引起細胞凋亡。因此細胞凋亡水平能在一定程度上表現(xiàn)細胞衰老水平。在細胞凋亡早期，細胞膜上的磷脂酰絲氨酸外翻，Annexin-FITC與之結(jié)合產(chǎn)生綠色熒光；凋亡晚期細胞膜通透性改變，碘化丙啶(PI)能進入細胞與細胞核結(jié)合，產(chǎn)生紅色熒光，根據(jù)兩種熒光能夠判斷細胞的凋亡水平。由圖4可見，模型組Annexin-FITC染色與PI染色熒光均顯著高于空白組，而GT-10組熒光與模型組相比較低，說明UVB處理后細胞凋亡水平明顯升高，而綠茶水粗提物對此有抑制作用。說明綠茶水粗提物能預(yù)防中波紫外線照射引起的細胞衰老。

圖4 不同處理組熒光顯微鏡下細胞Annexin-FITC染色圖

Figure 4 Annexin-TITCstaining of cells in different treat-ment groups under fluorescence microscope

3 結(jié)論

通過對中波紫外線誘導(dǎo)人表皮角質(zhì)形成細胞衰老特征變化的比較分析，發(fā)現(xiàn)綠茶水粗提物能預(yù)防UVB誘導(dǎo)后模型細胞表現(xiàn)出的衰老特征，有效改善細胞體積、形狀、核體積等細胞形態(tài)，抑制細胞凋亡趨勢；提高細胞存活率和細胞內(nèi)抗氧化酶活力，降低細胞內(nèi)氧化產(chǎn)物(MDA)含量，抑制細胞內(nèi)ROS的積累，抑制細胞線粒體膜電位去極化的趨勢，提高細胞內(nèi)Na+，K+-ATP酶活力。表明綠茶水粗提物抗中波紫外線誘導(dǎo)人表皮角質(zhì)形成細胞衰老具有較好的效果，為綠茶抗衰老產(chǎn)品研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

現(xiàn)階段的研究中對于衰老機理的學(xué)說主要有自由基氧化應(yīng)激學(xué)說、細胞凋亡學(xué)說、線粒體DNA損傷學(xué)說、端粒學(xué)說、TOR分子理論5種[25]，中波紫外線可能通過增加細胞內(nèi)ROS含量與凋亡水平的方式誘導(dǎo)細胞衰老，而綠茶水粗提物能夠顯著抑制中波紫外線引起細胞內(nèi)ROS含量增加與凋亡水平上升，因此可能通過這些途徑抑制中波紫外線誘導(dǎo)人表皮角質(zhì)形成細胞衰老。本研究結(jié)果符合自由基氧化應(yīng)激學(xué)說與細胞凋亡學(xué)說的觀點，與韓小苗[26]、馬蕊[8]35、趙海梅[27]等使用D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠模型、UVB誘導(dǎo)表皮細胞模型和人內(nèi)皮細胞自然衰老模型得到的變化趨勢一致。綠茶水粗提物各成分組成、含量、抗衰老功能作用與機制還有待進一步研究。

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