李彩霞 - 鄭 雪 高海寧 - 張 勇

(1. 河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅 張掖 734000； 2. 甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 張掖 734000)

槐角又稱槐實(shí)，為豆科植物國(guó)槐(SophorajaponicaL.)的果實(shí)，是一味常用中藥[1]。陳明珠等[2]對(duì)槐角化學(xué)成分進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其含有黃酮、異黃酮、三萜皂苷、氨基酸、生物堿、磷脂和多糖等多種藥理活性成分。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)槐角多糖研究已有報(bào)道，劉景東等[3]研究發(fā)現(xiàn)，槐角含有豐富的多糖；Ertan A等[4]對(duì)槐豆膠與卡拉膠的熱相變協(xié)同作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)槐豆膠與其他親水膠體相互作用產(chǎn)生凝膠；卞云霞等[5]研究了槐豆多糖及其配合物的抑菌活性，結(jié)果顯示不同的配合物對(duì)供試菌抑菌效果有差異，以上研究側(cè)重于多糖與凝膠復(fù)配方面的報(bào)道，而未見(jiàn)多糖的抗氧化及保濕方面的研究。國(guó)槐資源豐富，其多糖含量高，因此有一定的研究?jī)r(jià)值。

天然多糖廣泛存在于自然界中，是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一，具有抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、降血糖、抗輻射，調(diào)節(jié)人體免疫力等作用[6-8]，同時(shí)又具有強(qiáng)吸水性、乳化性、高黏度性和成膜性[9]，因此可以作為功能性添加劑，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域中有廣泛應(yīng)用前景。

本試驗(yàn)以槐角果皮和種子為材料，采用雙酶法從槐角果皮和種子中提取多糖，通過(guò)紅外光譜對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，并考察多糖對(duì)ABTS自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基的清除作用及對(duì)亞鐵離子的螯合能力，綜合評(píng)價(jià)多糖的體外自由基清除活性，同時(shí)探討多糖的吸濕和保濕性能，以期為槐角多糖在天然抗氧化劑和化妝品等領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

槐角：采自河西學(xué)院，剝離果皮和種子，分別洗凈、陰干、粉碎、過(guò)篩(60目)，保存?zhèn)溆茫?/p>

2,2-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻吡咯林-6-磺酸(ABTS)、菲洛嗪(Ferrozine)、二苯代苦味肼基 (DPPH)：純度≥99%，美國(guó)Sigma公司；

L-甲硫氨酸：分析純，北京拜爾迪生物公司；

氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)：分析純，南京奧多福尼生物科技有限公司；

葡聚糖：純度≥99%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

果膠酶：3.2 U/g，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制造廠；

纖維素酶：≥1 000 U/mg，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；

正丁醇、氯仿等試劑：分析純，上海中秦化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平：AE200型，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司；

可見(jiàn)分光光度計(jì)：S-24型，上海棱光技術(shù)有限公司；

循環(huán)水式真空泵：SHZ-2000型，河南省鞏義市英峪予華儀器廠；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-4型，國(guó)華電器有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：CR21GII型，日本日立公司；

冷凍干燥機(jī)：MiLLROCK型，美國(guó)米爾洛克公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-2000A型，鞏義市京華儀器有限責(zé)任公司；

酸度計(jì)：pH510型，安萊立斯儀器科技(上海)有限公司；

紅外光譜儀：Nicolet iS50型，美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 槐角果皮和種子多糖的提取及含量測(cè)定

(1) 提取工藝流程：

原料→粉碎→石油醚脫脂→干燥→雙酶法提取[以檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液為溶劑，料液比1∶20 (g/mL)，混合酶(纖維素酶∶果膠酶質(zhì)量比1∶1)添加量0.5%，底物濃度5%，初始pH 4.8，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間1 h]→高溫滅酶(80～90 ℃，10 min)→冷卻至室溫→離心(5 000 r/min，10 min)→上清液→減壓濃縮(至原液體積的 1/10)→醇沉(濃縮液中加入3倍體積95%乙醇，靜置過(guò)夜)→離心(5 000 r/min，5 min)→沉淀按1∶5 (g/mL)加入蒸餾水→加入 1/4 體積的Sevage試劑脫蛋白(3次)→醇沉(加入3倍體積95%乙醇，靜置過(guò)夜)→離心(5 000 r/min，10 min)→沉淀冷凍干燥(-40～-47 ℃，壓力17.42 Pa)→槐角果皮/種子多糖

(2) 多糖含量測(cè)定：根據(jù)文獻(xiàn)[10]修改如下，準(zhǔn)確稱取105 ℃干燥至恒重的葡聚糖100 mg，溶解后定容于100 mL容量瓶中，并稀釋成100 μg/mL葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mL用蒸餾水補(bǔ)充至2.00 mL，加入1 mL 6%苯酚，搖勻，然后加入5 mL 濃H2SO4，置于室溫下反應(yīng)20 min，冷卻后于490 nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求得Y=0.005 8X+0.000 1(R2=0.999 2)的線性回歸方程。

根據(jù)1.3.1方法提取多糖，稀釋一定倍數(shù)后，精密吸取1 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法操作，在490 nm處測(cè)定吸光度，按式(1)計(jì)算多糖的得率：

(1)

式中：

Y——多糖得率，%；

C——標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的多糖含量，μg；

V——多糖提取液總體積，mL；

N——樣品的稀釋倍數(shù)；

M——樣品的重量，g；

VS——測(cè)定時(shí)所取溶液的毫升數(shù)，mL。

根據(jù)上述方法測(cè)定果皮和種子多糖粗提物中多糖含量，并計(jì)算其純度。

1.3.2 紅外光譜(IR)表征 取2 mg 左右干燥多糖，加入適量KBr 粉末研磨混勻后，壓片，在波數(shù)4 000～400 cm-1內(nèi)掃描果皮和種子多糖的紅外光譜圖。

1.3.3 多糖的抗氧化性測(cè)定

(1) 對(duì)ABTS自由基的清除作用測(cè)定：根據(jù)文獻(xiàn)[11]修改如下，將2.00 mL稀釋成一定質(zhì)量濃度(種子：92.80～464.02 μg/mL；果皮：197.63～988.16 μg/mL)的多糖溶液和2.00 mL的ABTS混合為反應(yīng)體系，2.00 mL蒸餾水和2.00 mL 的ABTS混合液為對(duì)照組，2.00 mL蒸餾水和2.00 mL 多糖溶液的混合液為空白組，將各組在暗處?kù)o置6 min，在734 nm處測(cè)定吸光度。以不同質(zhì)量濃度的VC作陽(yáng)性對(duì)照。按式(2)計(jì)算ABTS自由基的清除率。

(2)

式中：

R——清除率，%；

A0——對(duì)照組吸光值；

Ai——多糖溶液吸光值；

Aj——空白組吸光值。

(2) 對(duì)DPPH自由基的清除能力：根據(jù)文獻(xiàn)[12]修改如下：將2.00 mL稀釋一定質(zhì)量濃度的槐角果皮(或種子)多糖溶液和2.00 mL的DPPH溶液(0.15 mmol/L的95%乙醇溶液)為測(cè)定組，2.00 mL蒸餾水和2.00 mL DPPH溶液為對(duì)照組，2.00 mL多糖溶液和2.00 mL 95%乙醇為樣品空白組，搖勻，在室溫下避光靜置30 min，在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以VC作陽(yáng)性對(duì)照，DPPH自由基清除率按式(3)計(jì)算：

(3)

式中：

R——清除率，%；

A0——未加多糖溶液對(duì)照組吸光值；

Ai——加多糖溶液吸光值；

Aj——以95%乙醇代替DPPH溶液時(shí)的吸光值。

(3) 對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力測(cè)定：參照文獻(xiàn)[13]，根據(jù)式(4)計(jì)算超氧陰離子自由基的清除率。

(4)

式中：

R——清除率，%；

A0——蒸餾水代替多糖的吸光值；

Ai——加入多糖溶液吸光值；

Aj——多糖溶液的本底吸光值。

(4) 對(duì)亞鐵離子的螯合能力測(cè)定：根據(jù)文獻(xiàn)[6]，金屬螯合率按式(5)計(jì)算：

(5)

式中：

R——螯合率，%；

A0——蒸餾水代替多糖溶液吸光值；

Ai——加多糖溶液的吸光值；

Aj——多糖溶液的本底吸光值。

1.3.4 吸濕保濕性能測(cè)定

(1) 槐角果皮和種子多糖的吸濕性：根據(jù)文獻(xiàn)[6]修改如下，將200 mL的硫酸銨飽和溶液置于干燥器底部，使干燥器內(nèi)的相對(duì)濕度為81%。準(zhǔn)確稱取充分干燥后的果皮多糖、種子多糖、甘油、殼聚糖各0.5 g于稱量瓶，置于濕度和溫度相對(duì)恒定的干燥器中并密封。放置3，15，19，28，39，45，50，67，76，90 h后，分別稱量樣品放置前后的質(zhì)量，根據(jù)式(6)計(jì)算多糖的吸濕率。

(6)

式中：

A——吸濕率，%；

Wo——樣品放置前質(zhì)量，g；

Wn——樣品吸水后質(zhì)量，g。

(2) 槐角果皮和種子多糖的保濕性：根據(jù)文獻(xiàn)[14]修改如下：在干燥器底部放入200 g 烘干的變色硅膠，準(zhǔn)確稱取充分干燥后的果皮多糖、種子多糖、甘油、殼聚糖各1 g置于內(nèi)徑30 mm恒重的稱量瓶中，分別加入1 mL蒸餾水，充分搖勻，放入干燥器中并密封。放置6，15，21，27，39，50，70 h，分別稱量樣品放置不同時(shí)間的水分質(zhì)量(Hn)和添加水分質(zhì)量(Ho)，根據(jù)式(7)計(jì)算多糖的保濕率。

(7)

式中：

R——保濕率，%；

Ho——添加的水分質(zhì)量，g；

Hn——放置不同時(shí)間的水分質(zhì)量，g。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

所有的試驗(yàn)均3次重復(fù)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、Origin 9軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 槐角果皮和種子中多糖含量的比較

通過(guò)雙酶法提取槐角果皮和種子多糖，采用苯酚硫酸法測(cè)定槐角果皮和種子中多糖的得率分別為24.7%，11.6%，該數(shù)據(jù)表明槐角種子和果皮中含有豐富的多糖，且果皮中多糖含量高于種子。并測(cè)定了果皮和種子多糖粗提物中多糖的含量，分別為72.39%，76.95%，從結(jié)果來(lái)看，種子多糖的純度高于果皮多糖的。

2.2 紅外光譜(IR)分析

由圖1可知，槐角兩部位多糖均有多糖的特征吸收峰，3 420 cm-1和3 300 cm-1處是多糖中O—H的伸縮振動(dòng)引起的吸收峰，2 970 cm-1是甲基或亞甲基的C—H伸縮振動(dòng)所形成的吸收峰[15]，1 610 cm-1是—OH 的彎曲振動(dòng)的吸收峰，1 410 cm-1和1 300 cm-1處是C—O 的變形振動(dòng)的吸收峰[16]，1 140 cm-1左右和1 080 cm-1左右為吡喃型甘露糖和半乳糖上伯、仲羥基的C—O的振動(dòng)吸收峰[17]，893 cm-1是吡喃糖C—H變角振動(dòng)的吸收峰，果皮多糖在893 cm-1和839 cm-1均有吸收，說(shuō)明該糖是β-型和α-型2種糖苷鍵吡喃糖對(duì)稱振動(dòng)所產(chǎn)生的吸收峰[18]。

圖1 槐角果皮和種子多糖紅外光譜圖Figure 1 Infrared spectrogram of polysaccharides of pericarp and seed from Sophora japonica L.

2.3 多糖的抗氧化活性

2.3.1 槐角果皮和種子多糖對(duì)ABTS自由基的清除能力

ABTS是一種水溶性的自由基，經(jīng)氧化后生成藍(lán)綠色的陽(yáng)離子ABTS自由基，向其中加入樣品，如果該樣品含有抗氧化物質(zhì)，能夠提供供氫體，則會(huì)褪色。在734 nm下吸光度降低，其降低程度與抗氧化物質(zhì)的抗氧化活性有關(guān)，通過(guò)光吸收的下降程度可反映該物質(zhì)抗氧化活性的強(qiáng)弱[11,19]。由圖2、3可知，槐角果皮、種子多糖和VC溶液均對(duì)ABTS自由基有一定的清除能力，其清除率均隨濃度增大而增大。果皮多糖、種子多糖和VC在質(zhì)量濃度分別為247.04，232.01，12.50 μg/mL 時(shí)對(duì)ABTS自由基的清除率分別為40.05%，71.83%，86.92%，表明多糖對(duì)ABTS自由基有很好的清除能力但弱于VC。

2.3.2 槐角果皮和種子多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用

DPPH自由基在517 nm處有最大吸收，當(dāng)反應(yīng)體系中含有抗氧化物時(shí)，抗氧化物提供一個(gè)電子與其配對(duì)結(jié)合，使DPPH自由基的特征紫色消失，其吸收值降低，樣品的抗氧化活性根據(jù)DPPH自由基的清除量來(lái)評(píng)價(jià)[20]。由圖4、5可知，不同部位的多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力不同，槐角果皮和種子多糖的質(zhì)量濃度分別為494.08，464.02 μg/mL時(shí)，清除率分別為15.69%，54.71%，說(shuō)明種子多糖對(duì)DPPH自由基的清除效果優(yōu)于果皮多糖的。VC在25 μg/mL時(shí)清除率為86.24%，表明2種多糖的清除效果不及VC。

圖2 槐角果皮、種子多糖對(duì)ABTS自由基的清除作用

Figure 2 Scavenging activity of polysaccharides of sophora fructus peel, seeds on ABTS radical

圖3 VC對(duì)ABTS自由基的清除作用Figure 3 Scavenging activity of VC on ABTS radical

圖4 槐角果皮、種子多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用

Figure 4 Scavenging activity of polysaccharides of sophora fructus peel, seeds on DPPH radical

圖5 VC對(duì)DPPH自由基的清除作用Figure 5 Scavenging activity of VC on DPPH radical

2.3.3 槐角果皮和種子多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用 由圖6、7可知，隨著多糖和VC質(zhì)量濃度的增加，對(duì)超氧陰離子自由基的清除率均在增高，在測(cè)定范圍內(nèi)呈量效關(guān)系。在清除率為35%時(shí)，槐角果皮和種子多糖的質(zhì)量濃度分別為494.08，154.67 μg/mL，而VC溶液在200 μg/mL時(shí)清除率為29.76%，說(shuō)明對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力種子多糖最優(yōu)，VC次之，果皮多糖相對(duì)最弱。

2.3.4 槐角果皮和種子多糖對(duì)亞鐵離子的螯合能力 螯合某些金屬離子是抗氧化活性的一個(gè)重要機(jī)制，后者催化氫過(guò)氧化物的降解以及Fenton類反應(yīng)，從而抑制了氧化損傷，在天然產(chǎn)物抗氧化活性評(píng)價(jià)中亞鐵離子螯合能力的測(cè)定有著非常重要的意義[21]。由圖8、9可知，隨著果皮和種子多糖及EDTA質(zhì)量濃度的增大，對(duì)亞鐵離子的螯合率逐漸增大。當(dāng)螯合率為31%時(shí)，槐角果皮、種子多糖的質(zhì)量濃度分別為329.39，154.67 μg/mL，而當(dāng)濃度為200 μg/mL時(shí)，EDTA螯合率達(dá)98.73%，對(duì)亞鐵離子的螯合能力的大小順序?yàn)镋DTA>種子多糖>果皮多糖。

圖6 槐角果皮、種子多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

Figure 6 Scavenging activity of polysaccharides of sophora fructus peel, seeds on superoxide anion radical

圖7 VC對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用Figure 7 Scavenging activity of VC on superoxide anion radical

圖8 槐角果皮、種子多糖對(duì)亞鐵離子的螯合能力

Figure 8 Chelating ability of polysaccharides of sophora fructus peel, seeds on ferrous ion

圖9 EDTA對(duì)亞鐵離子的螯合能力Figure 9 Chelating ability of EDTA on ferrous ion chelating ability

2.4 吸濕保濕能力

2.4.1 槐角果皮和種子多糖的吸濕性 由圖10可知，在相對(duì)濕度為81%的環(huán)境中，隨著吸濕時(shí)間的延長(zhǎng)，2種多糖、殼聚糖、甘油的吸濕率逐漸增大。在最初20 h內(nèi)，多糖的吸濕率增加幅度較大，隨后槐角果皮、種子多糖及殼聚糖逐漸達(dá)到飽和狀態(tài)，三者吸濕性能基本一致。在90 h時(shí)槐角果皮多糖、種子多糖，殼聚糖、甘油的吸濕率分別為12.31%，12.99%，12.38%，56.09%，說(shuō)明多糖有一定的吸濕性，但弱于甘油。

圖10 吸濕率隨時(shí)間變化的曲線Figure 10 Changes of moisture absorption rate for each sample with time changing

2.4.2 槐角果皮和種子多糖的保濕性 置于干燥器底部的變色硅膠吸附環(huán)境中的水分，使其自身顏色由藍(lán)變紅，根據(jù)多糖水分降低的程度，確定其保濕性。由圖11可知，在硅膠環(huán)境中，各試樣的保濕率呈下降趨勢(shì)，在27 h時(shí)降幅均稍有減小，在70 h的監(jiān)測(cè)范圍內(nèi)，槐角果皮多糖、種子多糖、殼聚糖、甘油的保濕性分別為31.73%，31.27%，14.83%，58.44%。說(shuō)明槐角果皮和種子多糖保濕性能差異不大，二者保濕率低于甘油，而高于保濕劑殼聚糖，均表現(xiàn)出良好的保濕性能。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以槐角果皮和種子作為研究對(duì)象，采用雙酶法提取多糖，測(cè)得槐角果皮中多糖(24.7%)的得率高于種子的(11.6%)，通過(guò)酶法提取的槐角多糖高于文獻(xiàn)[22]報(bào)道的水浴加熱回流所提取的，說(shuō)明酶法有利于多糖的提取。本研究結(jié)果表明，果皮和種子粗提取物中，多糖含量分別為72.39%和76.95%，說(shuō)明粗多糖中含有一定的雜質(zhì)，需要更進(jìn)一步分離純化。對(duì)多糖進(jìn)行紅外掃描，均具有多糖的特征吸收峰，種子多糖具有β-吡喃糖苷鍵，果皮多糖具有β-型和α-型2種糖苷鍵。

圖11 保濕率隨時(shí)間變化的曲線Figure 11 Changes of moisture retention rate for each sample with time changing

植物不同部位不同種類的多糖功能各不相同，生物活性也不同[23-24]。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，種子多糖對(duì)ABTS自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基、亞鐵離子螯合力均高于果皮多糖，可能與糖的種類和結(jié)構(gòu)有關(guān)，需要更進(jìn)一步研究。多糖對(duì)自由基清除作用表明，種子多糖的清除活性優(yōu)于果皮多糖，對(duì)DPPH自由基和超氧陰離子自由基的半數(shù)清除濃度分別為417.76，397.71 μg/mL，與文獻(xiàn)[25]數(shù)據(jù)對(duì)比說(shuō)明種子多糖具有很好的自由基清除活性。

槐角果皮和種子多糖的吸濕保濕性能結(jié)果顯示，在相同的監(jiān)測(cè)時(shí)效內(nèi)，槐角果皮多糖、種子多糖和殼聚糖三者的吸濕率基本一致，且均低于甘油；保濕性能方面，在39 h時(shí)槐角果皮多糖和種子多糖及甘油的保濕率均高于50%，均低于甘油而高于殼聚糖，可見(jiàn)，槐角果皮多糖和種子多糖具有良好的保濕作用。綜上所述，槐角果皮和種子多糖在食品中可以作為增稠劑、保水劑，在化妝品領(lǐng)域可以作為抗氧化劑和保濕劑。本研究?jī)H對(duì)粗多糖清除幾種自由基的能力和吸濕保濕性能進(jìn)行了研究，后續(xù)將對(duì)其有效成分進(jìn)行分離、純化，為國(guó)槐產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

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