王穎　薛楠　劉小艷　王銳　陳建鳴　趙欣　張宇　張策　李建國

【摘要】 目的：通過慢性口服糖皮質激素制備大鼠抑郁模型，為抑郁癥的研究提供有效的動物模型。方法：選取成年SD大鼠，隨機分為對照組、高劑量組和低劑量組，自由進食飲水。對照組口服2.4%乙醇溶液，高劑量組（H組）和低劑量組（L組）分別口服皮質酮溶液。前14 d皮質酮濃度分別為100、25 μg/mL，第15天將其濃度降為起始濃度的50%，口服3 d，第18天將其濃度再次降為起始濃度的25%，口服4 d，共21 d。ELISA測定大鼠每周血清中糖皮質激素水平。觀察大鼠在強迫游泳，高架十字迷宮和糖水偏愛實驗中的各項指標，并評價抑郁模型的效果。結果：ELISA結果顯示，口服皮質酮可以增加大鼠血清中激素濃度。給藥后，實驗組在強迫游泳中的漂浮時間均較給藥前增加，在高架十字迷宮閉臂所待時間延長，在開臂的時間縮短，糖水偏愛度降低。結論：口服給予糖皮質激素可以制備理想的大鼠抑郁模型，操作簡便，適合抑郁癥的實驗研究。

【關鍵詞】 抑郁癥； 糖皮質激素； 動物模型； 行為學觀察； 大鼠

抑郁癥（major depressive disorder，MDD）是一種高發(fā)病率、高復發(fā)率和高自殺率的情感障礙性精神疾病[1]。該病患者主要表現為情緒低落、快感缺失、睡眠紊亂、注意力無法集中等癥狀。抑郁癥嚴重困擾患者的生活和工作，給患者家庭和社會帶來極大負擔[2]。研究表明，約15%的抑郁癥患者死于自殺。世界衛(wèi)生組織、世界銀行和哈佛大學的一項聯合研究表明，抑郁癥已經成為中國疾病負擔的第二大病[2]，抑郁癥的治療非常重要。目前抑郁癥的治療主要是藥物治療、心理治療及物理治療等[3-4]，但抑郁癥患者的預后并不樂觀，復發(fā)率較高[5]。因此，需要加大對抑郁癥病因及機制的研究力度。研究抑郁癥的動物模型有很多，包括嗅球切除模型、強迫游泳、懸尾、習得性無助、行為絕望和慢性溫和不可預知性應激[6-7]，但是很多模型不能很好地模擬臨床抑郁癥患者的表現。因此，能制備出較為穩(wěn)定的抑郁模型有助于對抑郁癥進行神經生物學研究。

糖皮質激素（glucocorticoids，GCs）是一種機體在應激情況下分泌的激素，主要受下丘腦-垂體-腎上腺皮質（hypothalamus-adrenohypophysis-adrenalcortex，HPA）軸調節(jié)[8-9]。它通過結合細胞內糖皮質激素受體發(fā)揮作用，GCs在外周及中樞神經系統(tǒng)都發(fā)揮著重要的作用，正常情況下，GCs具有抗焦慮、抗驚厥及神經保護作用[10]，但在過度應激時，體內GCs過度增高，導致中樞神經系統(tǒng)，特別是海馬腦區(qū)神經元死亡，引起抑郁的發(fā)生[11]。近年來，大量的研究證實GCs在抑郁癥中有重要作用。

本文所采用的方法是通過長期口服GCs制備抑郁模型，同時從多角度檢測動物抑郁癥狀，證實動物抑郁模型有效可靠，為抑郁癥的研究提供理想的動物模型[1]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SD雄性大鼠30只，體重為200～250 g，由山西醫(yī)科大學動物中心提供，FST-100睡眠剝奪與強迫游泳實驗系統(tǒng)、PMT-100高架十字迷宮及視頻分析系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司），皮質酮（Corticosterone，CORT）（Aladdin Industrial Corporation）。

1.2 實驗方法 30只SD大鼠隨機分為對照組、高劑量組、低劑量組，每組10只，每籠2只，所有大鼠均置于12 h晝夜循環(huán)的條件，自由攝食飲水，飼養(yǎng)5 d，各組大鼠給藥前進行各項行為學實驗，包括強迫游泳實驗、高架十字迷宮和糖水偏愛實驗。高劑量組和低劑量組分別給予濃度為100、25 μg/mL的CORT溶液。造模結束后，各組大鼠再次進行強迫游泳實驗、高架十字迷宮、曠場實驗和糖水偏好實驗[12]。并于造模第1、7、14、21天晚上10點收集尾靜脈血并稱取大鼠體重。

1.3 配藥方法 以一只大鼠每天消耗30～60 mL水為標準，每天上午九點新鮮配制CORT溶液。前14 d高劑量組和低劑量組分別給予皮質酮濃度為100、

25 μg/mL，高劑量組：稱取60 mg CORT溶于14.4 mL的酒精中，加飲用水至600 mL，充分混勻，分裝在5個水瓶中；低劑量組稱取15 mg CORT，溶于600 mL水中并分裝在5個水瓶中；對照組：14.4 mL酒精溶于600 mL水中，混勻、分裝。第15天，高低劑量組皮質酮濃度降為原來濃度的50%，即分別為50 μg/mL、12.5 mg/mL，高劑量組稱取30 mg CORT，低劑量組稱取7.5 mg CORT，溶于600 mL水中，充分混勻，分裝，連續(xù)3 d。第18天，濃度降為起始濃度的25%，即高低劑量組分別為25 μg/mL、12.5 mg/mL，高劑量組稱取15 mg CORT，低劑量組稱取3.75 mg CORT，加飲用水至600 mL，充分混勻，分裝，連續(xù)4 d，共21 d。

1.4 觀察指標與方法

1.4.1 強迫游泳實驗（forced swim test） 強迫游泳裝置置于安靜的房間，由長348 mm，寬348 mm，高445 mm的有機玻璃水箱組成，裝置內有直徑200 mm，高400 mm的圓筒隔板，用于限制大鼠的活動范圍，裝置內水深度為35 cm，水溫25 ℃左右。將大鼠單獨放入圓筒，觀察記錄5 min內的不動時間，全過程使用攝像頭記錄。實驗期間，主要觀察大鼠在水中的掙扎、游泳和漂浮行為。掙扎：大鼠的四肢激烈運動，并同時伴隨前肢伸出水面；漂?。捍笫笏闹珱]有運動或僅有后肢輕微的運動而漂浮在水面上。實驗開始時，大鼠不斷地掙扎來脫離受限的環(huán)境，一段時間后，會變成漂浮不動狀態(tài)，僅露出鼻孔保持呼吸，四肢偶爾劃動以保持身體平衡不至于沉下去，記錄大鼠的不動時間作為評價抑郁嚴重程度的指標。

1.4.2 高架十字迷宮（high plus maze） 實驗在安靜環(huán)境下進行，實驗開始時將大鼠從中央面向開放臂放入迷宮，記錄5 min內的活動情況。記錄大鼠在開放臂、閉停留的時間。實驗完成后將大鼠取出，將兩臂清理干凈，噴灑酒精除去氣味。

1.4.3 糖水偏愛實驗（sucrose preference test） 第一個24 h，每個籠子放兩瓶5%糖水；第2個24 h，每個籠子放兩瓶純凈水，進行適應；第3個24 h，禁食禁水；第4天，開始檢測，每個籠子放一瓶糖水，放一瓶純凈水，計算每只大鼠一小時水的消耗（糖水+純凈水消耗），從而計算糖水偏愛度（糖水偏愛度=糖水消耗/總液體消耗×100%），每小時檢測10只。

1.4.4 Elisa試劑盒檢測血清中CORT濃度 造模第1、7、14、21天晚10點采取大鼠尾靜脈血，采血前對剪刀，鑷子進行消毒，將大鼠置于固定裝置，待大鼠安靜后，用熱水浸泡尾部數分鐘，使尾靜脈擴張后，消毒尾巴末梢，用剪刀快速減去2～3 cm，使血液自然流出，棄去第一滴血，從第二滴開始收集于EP管內，收集完畢后，對大鼠尾部進行止血數分鐘，隨后放入清潔籠內。收集好放置4 ℃過夜后，低溫離心20 min，取上清，放于一次性無熱原，無內毒素EP管，存于-80 ℃冰箱，整個操作過程盡量做到無菌，且減小對大鼠的損傷。用Elisa試劑盒檢測血清中皮質酮的濃度。

1.5 統(tǒng)計學處理 用統(tǒng)計工具軟件SPSS 13.0對上述實驗所得實驗數據進行統(tǒng)計檢驗。多組數據比較采用One-Way ANOVA分析，組間比較采用SNK法：自身給藥前后數據比較采用配對t檢驗。檢驗水準α=0.05。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠血清中皮質酮濃度 為了檢測口服CORT的效果，在造模過程中檢測大鼠血漿中檢測CORT濃度的變化。ELISA實驗結果顯示，在給藥期間前兩周的血藥濃度逐漸升高，當給藥降低時，血藥濃度也隨之降低，但模型組的血藥濃度仍然高于正常組，而正常組在21 d中，血藥濃度并沒有明顯的變化趨勢，見圖1。

注：Model（H）為高劑量組，Model（L）為低劑量組；CORT組在前15 d濃度均高于正常組，且呈上升趨勢，后7 d逐漸下降，但血藥濃度始終高于對照組。

2.2 強迫游泳實驗 高劑量組給藥前后漂浮時間分別為（170.67±7.32）、（238.76±7.98）s（P<0.05），低劑量組給藥前后漂浮時間分別為（176.89±7.67）、（235.78±6.98）s（P<0.05），對照組給藥前后漂浮時間分別為（178，98±8.13）、（178.45±5.56）s（P>0.05）。強迫游泳實驗顯示，高劑量組和低劑量組給藥后漂浮時間均較給藥前增加，對照組給藥前后漂浮時間變化不明顯，見圖2。

注：Model（H）為高劑量組，Model（L）為低劑量組，Normal為給藥前，CORT為給藥后

2.3 高架十字迷宮 高架十字迷宮實驗中，高劑量組給藥前后在閉臂所待時間分別為（139.34±6.45）、

（270.67±7.89）s（P<0.05），在開臂所待時間分別為（99.55±4.01）、（2.43±0.89）s（P<0.05）；低劑量組給藥前后在閉臂所待時間分別為（137.65±9.89）、（270.89±4.89）s（P<0.05），在開臂所待時間分別為（103.20±11.89）、（5.67±3.24）s（P<0.05）；對照組給藥前后在閉臂

所待時間分別為（（143.67±2.98）、（151.87±3.78）s

（P>0.05），在開臂所待時間分別為（94.78±2.66）、

（89.78±2.78）s（P>0.05）。與對照組和給藥前相比，給藥后大鼠在閉臂所待時間延長，而在開臂的時間縮短，而正常對照組給藥前后差異不明顯，見圖3。

圖3 造模前后各組大鼠高架十字迷宮實驗比較

注：Model（H）為高劑量組，Model（L）為低劑量組，Normal為給藥前，CORT為給藥后

2.4 糖水偏愛度 在糖水偏愛實驗中，高劑量組給藥前后糖水偏愛度分別為（0.817±0.014）、（0.671±0.031）（P<0.05），低劑量組給藥前后糖水偏愛度分別為（0.850±0.018）、（0.760±0.056）（P<0.05），對照組給藥前后糖水偏愛度分別為（0.820±0.065）、（0.840±0.032）（P>0.05）。與對照組和給藥前相比，高劑量模型組和低劑量模型組大鼠的糖水偏好度降低，正常對照組在給藥前后沒有顯著改變，見圖4。

圖4 造模前后各組大鼠糖水偏好實驗比較

注：Model（H）為高劑量組，Model（L）為低劑量組，Normal為給藥前，CORT為給藥后

3 討論

本實驗采用持續(xù)3周口服給予皮質酮（Corticosterone，CORT），在成年大鼠制備抑郁癥模型，并且從抑郁癥的多方面表現對模型大鼠進行測試。

應激是機體對于外界刺激所產生的一種自身生理反應，當應激源作用于機體時，機體在行為和生理上產生對應的反應[13]。首先，在應激源的作用下，促腎上腺皮質激素釋放激素由下丘腦分泌，通過垂體門靜脈系統(tǒng)作用于腺垂體，使腺垂體釋放促腎上腺皮質激素（ACTH）進入血液循環(huán)，激活腎上腺內分泌細胞分泌糖皮質激素[14-15]，亦稱為應激激素。糖皮質激素會通過血腦屏障進入中樞神經系統(tǒng)，發(fā)揮抗焦慮、抗驚厥及神經保護作用，也可促進大腦與認知，信息傳遞及記憶形成等方面的信息處理有關的邊緣系統(tǒng)的神經網絡的形成[16]。血液中糖皮質激素可以負反饋調節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸（HPA軸），從而保持機體的穩(wěn)態(tài)[16-17]。

然而，當慢性應激刺激作用于機體時，HPA軸會過度興奮，長時間高濃度糖皮質激素會損傷機體神經元，導致認知、記憶等功能減退，這也是抑郁癥發(fā)病的主要原因之一[18-20]。因此，慢性持續(xù)給予動物糖皮質激素，可以模擬慢性環(huán)境應激刺激，誘導大鼠產生抑郁癥的病理生理變化。

考慮到是慢性長期給藥，而腹腔注射時的動物抓取和血藥濃度的變化特點會影響實驗大鼠的結果。因此，筆者采用了持續(xù)3周口服給藥，選用嚙齒類動物糖皮質激素的主要成CORT。造模4周后，采用動物行為檢測方法，從抑郁癥的多方面表現對模型大鼠進行測試，證實成年大鼠抑郁癥模型制備成功。另外，雖然在實驗選用低劑量乙醇溶解CORT，但是有實驗研究發(fā)現，2.4%乙醇本身既不激活下丘腦-垂體-腎上腺軸，也不影響其他指標，包括器官（腎上腺，脾和胸腺）以及神經元[21-22]，因此可以排除乙醇的作用。

海馬是參與應激的一個重要腦區(qū)，且BDNF在海馬中的分布最多[23]。研究表明，海馬中糖皮質激素受體含量較高，長期應激情況下，HPA軸過度亢進，導致糖皮質激素長期處于較高的水平，使海馬神經元萎縮[24]。另有研究表明，長期給予糖皮質激素，海馬BDNF含量下降[18]?？梢娞瞧べ|激素與海馬及BDNF有密切關系，這可能是導致抑郁癥發(fā)生的重要原因之一。本實驗采用糖皮質激素慢性長期制備抑郁模型，通過行為學研究來驗證模型制備是否成功。

在研究中，兩個CORT濃度的模型組大鼠均出現抑郁表現。高架十字迷宮實驗中大鼠在開臂時間縮短，閉臂時間延長，這反應模型組大鼠探究與回避的沖突行為，顯示焦慮程度增高；強迫游泳實驗中，大鼠的漂浮不動時間增加，表現出絕望和無助；糖水偏愛實驗中，大鼠糖水偏愛度降低，表示快感缺失。這些表現均與抑郁癥狀相同，表明本實驗中采取口服CORT制備抑郁模型是成功的，可以用于抑郁癥的發(fā)病機制及藥物治療等方面的研究。

大鼠長期慢性口服CORT后，通過強迫游泳、高架十字迷宮和糖水偏愛實驗等行為學實驗方法檢測，均出現了抑郁樣癥狀，表明口服CORT可以制備抑郁模型，且是一種簡單有效的模型方法。

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（收稿日期：2016-12-13） （本文編輯：程旭然）