王 姝 遼寧省綏中縣動(dòng)物檢疫站 125200

綿羊痘的血清學(xué)檢疫

王 姝 遼寧省綏中縣動(dòng)物檢疫站 125200

應(yīng)用瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)和中和試驗(yàn)等均有助于綿羊的檢疫。但是痘病毒的感染性在中和試驗(yàn)中常不完全消失。對(duì)病羊取發(fā)痘初期和治愈時(shí)的血清進(jìn)行中和試驗(yàn)，也有較高的現(xiàn)癥診斷價(jià)值。

1 血凝抑制試驗(yàn)

（1）材料準(zhǔn)備與配制。（1）稀釋液按常規(guī)配制0.85%生理鹽水和0.4%枸櫞酸鈉生理鹽水，經(jīng)718Pa（15磅）高壓滅菌。選擇其紅細(xì)胞能為痘病毒凝集的健康公雞，從翅靜脈采血，與上述抗凝劑混合后，按常規(guī)方法用生理鹽水洗滌并制成1%雞紅細(xì)胞懸液。取11～12日齡的SPF雞胚，經(jīng)絨毛尿囊膜接種痘病毒，劑量為0.2mL/胚。用石蠟封口，置于35～36℃溫箱中培養(yǎng)72～96小時(shí)，取有痘斑的雞胚絨毛尿囊膜，剪碎并加玻璃砂和少量生理鹽水充分研磨，再加生理鹽水制成1:5的懸液，凍融1次，以3000裝/分鐘離心20分鐘，取上清液作為血凝素。挑選體重1kg左右的家兔若干只按如下程序進(jìn)行免疫，每周免疫1次，共計(jì)3次，而后放血分離血清。第一次用畫線法進(jìn)行接種，接種部位為家兔背側(cè)壁中上部皮膚。先去毛（拔毛或剃毛），再用75%酒精消毒，然后用針作棋盤狀劃痕，盡量避免出血，劃痕處涂上0.1mL的痘病毒。以不同的痘病毒（如牛痘病毒、綿羊痘病毒、雞痘病毒、豬痘病毒等）各接種2～3只家兔，待病毒液自然陰干后將家兔放回籠中。第二次用皮下注射法接種，每只家兔接種與第一次免疫相同的病毒液，劑量為0.2mL／只。第三次用靜脈注射法接種，每只家兔接種與第一次、第二次免疫相同的病毒液，劑量為0.2mL／只。10天后采血分離血清，測定抗體的效價(jià)。

（2）血凝素效價(jià)測定。血清的處理置56℃水浴箱中滅活30分鐘。采用微量血凝板滴定血凝素方法，除第一孔加0.4mL生理鹽水外，其余各孔均加生理鹽水0.1mL。第一孔加0.1mL血凝素成為1:5稀釋的血凝素，自第1孔取0.1mL加入第2孔中混勻后再取0.1mL，向后做等量倍比稀釋，最后一孔混合后棄去0.1mL。每孔加生理鹽水0.1mL，放入37℃恒溫箱中1小時(shí)。各孔加1%雞紅細(xì)胞懸液0.1mL，最后每孔總量均為0.3mL。再放入37℃恒溫箱中30分鐘，判定結(jié)果。

以能引起紅細(xì)胞完全凝集的病毒最高稀釋度作為一個(gè)紅細(xì)胞凝集單位，按血凝素滴定結(jié)果將血凝素稀釋成4單位／0.1mL，即為工作濃度血凝素。

（3）試驗(yàn)方法。從第2孔起，每孔加生理鹽水0.1mL至第10孔，共計(jì)9孔。第1、2、10孔各加1:5滅活的被檢血清0.1mL（第10孔作血清對(duì)照用）。從第2孔開始，將被檢血清作倍比稀釋，至第9孔，混合后棄去0.1mL。從第1孔開始至第9孔為止，每孔加工作濃度的血凝素0.1mL。振搖均勻，將微量血凝板放入37℃恒溫箱中30分鐘。每孔加1%雞紅細(xì)胞懸液0.1mL。振搖均勻，將微量血凝板放入37℃恒溫箱中30分鐘。判定結(jié)果，以血清中最大稀釋度無凝集現(xiàn)象的作為血凝抑制試驗(yàn)的效價(jià)，血清對(duì)照應(yīng)無凝集現(xiàn)象。工作濃度血凝素對(duì)照孔應(yīng)呈完全凝集。

（4）結(jié)果判定。按血清稀釋度計(jì)算，以完全抑制血凝的終點(diǎn)稀釋度為其效價(jià)。1:10以上判為陽性反應(yīng)。

2 瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)

（1）材料準(zhǔn)備。抗原和標(biāo)準(zhǔn)陽性血清均由指定單位供應(yīng)，按說明書使用。被檢血清無細(xì)菌污染，保存于4℃。器材為直徑90納米的平皿、微量移液器及微量滴頭、三角燒瓶、打孔器和水浴箱等。瓊脂糖板制備稱取瓊脂糖1g于三角瓶中，加100mL生理鹽水，按1∶10000比例加入疊氮鈉或硫柳汞，熱溶化后倒入平皿，每平皿約16mL（厚度約為2.5mL）凝固后置冰箱4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）操作方法。用打孔器在瓊脂糖板上打孔，孔徑5mm、孔距3mm。中心孔滴加抗原，第 1、3、5 孔加被檢血清，第 2、4、6 孔加標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，每孔均加50微升。加樣完畢靜止10分鐘，放入濕盒置37℃，待24～48小時(shí)后判定結(jié)果。

（3）結(jié)果判定。將瓊脂糖板置于暗背景下觀察，標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和抗原孔之間應(yīng)出現(xiàn)一條清晰、致密的沉淀線，則試驗(yàn)可以成立。被檢血清孔和中心抗原孔中間出現(xiàn)清晰、致密的沉淀線，并且與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的沉淀線環(huán)聯(lián)，判為陽性（＋）；反之判為陰性（－）。