劉洪波, 陳修報(bào), 蘇彥平, 姜濤, 楊健

中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江中下游漁業(yè)生態(tài)環(huán)境評(píng)價(jià)與資源養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214081

銅是生物體必需元素之一，大量存在于陸地和水生態(tài)系統(tǒng)中。銅在淡水中的背景水平一般低于5 μg·L-1，超過(guò)一定濃度后就會(huì)產(chǎn)生生物毒性。然而起源于人類活動(dòng)的銅卻仍在不斷地進(jìn)入自然生態(tài)系統(tǒng)，進(jìn)而導(dǎo)致污染甚至環(huán)境問(wèn)題。比如硫酸銅經(jīng)常在控制藻類、細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)方面被過(guò)度使用[1]。由于水環(huán)境的銅污染，加拿大某些區(qū)域飲用水的銅濃度高至750 μg·L-1[2]。我國(guó)亦常利用硫酸銅清塘滅藻，導(dǎo)致一些養(yǎng)殖池塘水的銅濃度可高達(dá)2 000 μg·L-1[3]。因此，對(duì)水生生物而言，銅目前已被列入需要高度關(guān)注的重金屬污染物[4]。

在水生生態(tài)系統(tǒng)中，銅的生物毒性取決于自由離子活度，自由金屬離子的活度和環(huán)境水化學(xué)性質(zhì)如DOC、pH、Ca2+、Mg2+、CO32-等的絡(luò)合和競(jìng)爭(zhēng)有關(guān)。傳統(tǒng)的金屬基準(zhǔn)值推導(dǎo)通常不考慮pH、DOC等的影響，僅用金屬總量來(lái)評(píng)估重金屬污染物的毒性。但歐洲[5]和美國(guó)[6]的研究表明，金屬總量中只有很小一部分是“生物可利用”并對(duì)有機(jī)體產(chǎn)生潛在毒性的，因此用金屬總量不能準(zhǔn)確評(píng)估重金屬污染物實(shí)際的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)水環(huán)境來(lái)說(shuō)有可能是過(guò)保護(hù)。鑒于此，歐美等國(guó)在制定本地的水、沉積物或土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(基準(zhǔn))時(shí)，都普遍采用模型或其他驗(yàn)證工具，如自由離子活度模型(free-ion activity models，F(xiàn)IAM)、生物配體模型(biotic ligand model，BLM)[7]或用梯度擴(kuò)散薄膜(DGT)法原位測(cè)量水體中重金屬并計(jì)算金屬解離動(dòng)力學(xué)及有效態(tài)組分[8]等，以便能夠更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)銅及其他重金屬的生物可利用性。

美國(guó)淡水銅BLM模型數(shù)據(jù)輸入最低需要pH、硬度(主要指Ca2+和Mg2+)、DOC等指標(biāo)，其中DOC是影響不同形態(tài)金屬尤其是自由金屬離子濃度的最重要因素[9-10]，已取代硬度被美國(guó)環(huán)保署作為制定關(guān)于重金屬元素國(guó)家水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)首要考慮的水化學(xué)因子[11-12]。對(duì)不同環(huán)境下DOC與自由金屬離子相互作用的研究是現(xiàn)代毒理學(xué)研究的一個(gè)新熱點(diǎn)，其意義在于能更加合理地預(yù)測(cè)環(huán)境中重金屬的生物毒性。美國(guó)學(xué)者利用對(duì)銅較為敏感的淡水溝貝(fatmucket, Lampsilis siliquoidea)的稚蚌開展實(shí)驗(yàn)，已證實(shí)DOC與水體銅形成有機(jī)絡(luò)合物可以消減銅的毒性[11]。然而，據(jù)筆者所知國(guó)內(nèi)針對(duì)淡水貝類尚缺乏相關(guān)研究。

淡水貝類作為獨(dú)特的指示生物，曾被廣泛用于重金屬污染的監(jiān)測(cè)和環(huán)境中重金屬的生物有效性的預(yù)測(cè)中，特別是其生長(zhǎng)的稚蚌階段，對(duì)環(huán)境中重金屬的變化尤其敏感[13]。然而，淡水貝類亦是世界上最瀕危的動(dòng)物類群之一。如在美國(guó)的813種淡水貝類中就有約400種被列入2002國(guó)際自然保護(hù)聯(lián)盟紅皮書[14]。分析原因發(fā)現(xiàn)流域的生態(tài)和水質(zhì)退化對(duì)于淡水貝類的影響最為關(guān)鍵。Cataldo等[15]研究了阿根廷三角洲地區(qū)河蜆(Corbicula fluminea)種群發(fā)現(xiàn)，在水體污染較重的地區(qū)水體污染導(dǎo)致的幼體高死亡率對(duì)于淡水貝類種群數(shù)目的影響最大。這充分證明了淡水貝類幼體階段在整個(gè)生活史階段是最脆弱的，為此進(jìn)行早期生活史蚌與水質(zhì)條件關(guān)系的研究，對(duì)于淡水貝類種群保護(hù)既具深刻的意義，又非常必要。

廣布于世界各地的背角無(wú)齒蚌屬典型的珠蚌類。其生長(zhǎng)具有非常復(fù)雜的生活史，需經(jīng)歷配子的發(fā)生、胚胎發(fā)育、寄生、稚蚌、幼蚌以及成蚌的生長(zhǎng)等多個(gè)發(fā)育階段[16]。2003年以來(lái)，背角無(wú)齒蚌被我們研究室做為“淡水貝類觀察”的特殊指示生物加以研究。目前在掌握其生活史狀況的基礎(chǔ)上，我們建立了“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無(wú)齒蚌從鉤介幼蟲、稚蚌以及成蚌等全生活史各階段的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種群，并可利用該種群的各階段個(gè)體，對(duì)其進(jìn)行相關(guān)重金屬毒性的敏感性和耐受情況等毒理學(xué)的深入研究[17]。

迄今，Cu已成為水生態(tài)系統(tǒng)最受關(guān)注的一種重金屬[4]。其也是我國(guó)漁業(yè)水域主要污染物之一[18]，并被列入了國(guó)家重點(diǎn)防控對(duì)象的名單中。由于貝類稚蚌階段個(gè)體自身的環(huán)境脆弱性，故基于其來(lái)研究生境中重金屬及其絡(luò)合情況對(duì)生物毒性的影響將更具研究?jī)r(jià)值。本研究擬利用自主繁育的背角無(wú)齒蚌稚蚌來(lái)評(píng)價(jià)Cu對(duì)其的急性毒性以及不同DOC濃度對(duì)相關(guān)毒性可能的影響，以期為進(jìn)一步深入探討環(huán)境水化學(xué)因子的作用以及保護(hù)淡水貝類幼體資源等方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

參照美國(guó)ASTM E2455-06 “Standard Guide for Conducting Laboratory Toxicity Tests with Freshwater Mussels”[19]和Wang等[20]的研究方法，本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)方法加以改進(jìn)和完善。

1.1 實(shí)驗(yàn)溶液

所有實(shí)驗(yàn)用水采用在去離子水里添加人工海水鹽的方式配制，水中鹽度的終濃度為0.1‰；分析純CuCl2·2H2O購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)，所配母液濃度是5 mg·L-1; 在計(jì)算重金屬和DOC反應(yīng)時(shí)通常假設(shè)DOC由一定比例的腐殖酸(FA)或僅由FA組成[9]，實(shí)驗(yàn)用腐殖酸鈉鹽購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，碳含量為39%，原液濃度16 mg·L-1，折算成DOC名義濃度為6 mg C·L-1。原液用攪拌器攪拌至少12 h后方能添加Cu。

圖1 背角無(wú)齒蚌稚蚌注：A，活體；B，非活體。Fig. 1 Newly-transformed juveniles of Anodonta woodianaNote: A, alive individual; B, nonviable individual.

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

將直接取自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心南泉實(shí)驗(yàn)基地人工繁養(yǎng)獲得的3只母蚌的成熟鉤介幼蟲放入盛有曝氣自來(lái)水的塑料盆中，并用玻璃棒攪拌均勻，然后將寄生魚黃顙魚放入盆中。20 min后，將黃顙魚取出，放入已準(zhǔn)備好的盛有曝氣自來(lái)水的塑料水槽中暫養(yǎng)。根據(jù)背角無(wú)齒蚌鉤介幼蟲寄生發(fā)育的生物學(xué)零度和有效積溫，取脫落高峰期當(dāng)天的稚蚌于實(shí)驗(yàn)條件下暫養(yǎng)>24 h，在此期間，用含有0.01%濃度鹽水的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)用水更換3次養(yǎng)殖水，每次的更換量為50%，之后選取活體稚蚌(日齡1～2 d)用于毒性實(shí)驗(yàn)。在5 min之內(nèi)，斧足伸出運(yùn)動(dòng)的稚蚌定義為活蚌 (圖1A)，反之，則認(rèn)為是死亡個(gè)體(圖1B)。

1.3 急性毒性實(shí)驗(yàn)

在采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27861—2011所述的半靜態(tài)試驗(yàn)方式并48 h換水條件下[21]，96 h銅和添加不同濃度DOC對(duì)銅急性毒性影響的實(shí)驗(yàn)在防酸材質(zhì)的塑料培養(yǎng)皿中進(jìn)行，每個(gè)培養(yǎng)皿有5個(gè)蚌，內(nèi)有100 mL暴露溶液，每個(gè)濃度組有3個(gè)平行，培養(yǎng)皿放在25 ℃、亮暗比為16 h:8 h、光強(qiáng)為200 lux冷光源的恒溫培養(yǎng)箱中，48 h換水時(shí)檢查對(duì)照組成活，96 h結(jié)束時(shí)檢查所有蚌的存活。Cu暴露的濃度梯度為0、10、23、45、90和180 μg·L-1，添加腐殖酸鈉鹽的濃度梯度為2、4、8、16 mg·L-1，折合成DOC濃度梯度為0.8、1.5、3.0和6.0 mg C·L-1。

1.4 水質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)開始前取配好的50 mL各濃度組實(shí)驗(yàn)用水，用于金屬陽(yáng)離子、DOC、pH等水化學(xué)指標(biāo)的測(cè)定。金屬陽(yáng)離子用電感耦合等離子質(zhì)譜儀(Agilent 7500ce ICP-MS, Agilent, USA)測(cè)定，利用元素標(biāo)準(zhǔn)添加回收法確認(rèn)了測(cè)定精度，得到各元素的回收率均在97%～102%范圍內(nèi)。DOC用總有機(jī)碳分析儀(TOC-VCPN,島津,日本)測(cè)定。pH用美國(guó)EUTECH的pH 510臺(tái)式酸度計(jì)測(cè)定。

實(shí)際測(cè)得的Cu濃度梯度為4.3、10.9、19.5、47.5、91.1和177.2 μg·L-1；DOC濃度梯度為0.3、1.5、1.9、3.1和5.3 mg C·L-1，0.8 和1.5 mg C·L-1組所測(cè)濃度比名義濃度明顯偏大(>20%)，可能是過(guò)濾不充分造成的。其余所測(cè)濃度與名義濃度的偏差均小于20%。我們僅對(duì)名義濃度的Cu和DOC值(除對(duì)照組用實(shí)測(cè)值0.3 mg C·L-1外)進(jìn)行分析和討論。pH值的范圍為6.7～7.2。各水化學(xué)指標(biāo)的測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表1。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用SPSS 16.0中的probit模型對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)算出96 h半數(shù)效應(yīng)濃度EC50(median effective concentration) 和95%置信區(qū)間值。用SPSS 16.0中的線性回歸分析來(lái)描述EC50值和DOC添加濃度之間的關(guān)系。

圖2 背角無(wú)齒蚌稚蚌在不同銅暴露濃度時(shí)添加0.3, 0.8, 1.5, 3和6 mg C·L-1濃度DOC后的存活率(96 h)Fig. 2 Survival percent of newly-transformed juveniles (96 h) of Anodonta woodiana in Cu treatments with varying DOC concentrations of 0, 0.8, 1.5, 3, and 6 mg C·L-1

圖3 背角無(wú)齒蚌稚蚌96 h Cu EC50值與不同DOC濃度間的線性相關(guān)性Fig. 3 A linear relationship between the Cu 96 h EC50s of juvenile Anodonta woodiana and DOC concentrations

濃度組Treatment溶解性有機(jī)碳/(mg·L-1)DOC/(mg·L-1)pH硬度/(mgCaCO3·L-1)Hardness/(mgCaCO3·L-1)96hEC50(95%CI)/(μgCu·L-1)0DOC0.36.78.319(13～27)0.8DOC1.56.86.923(17～31)1.5DOC1.96.836.417(12～23)3.0DOC36.978.513(8～19)6.0DOC5.37.2156.610(5～14)

2 結(jié)果(Results)

DOC對(duì)Cu急性毒性的影響反應(yīng)在稚蚌的存活率上見(jiàn)圖2，隨著Cu濃度的升高，未添加DOC及各DOC添加組的稚蚌均反應(yīng)出明顯的濃度-劑量效應(yīng)，即Cu濃度越高，死亡率越大，并在10 μg·L-1Cu濃度時(shí)即有死亡的蚌出現(xiàn)。

對(duì)應(yīng)0.3、0.8、1.5、3.0 和6.0 mg C·L-1DOC濃度組96 h Cu EC50值分別為19 (13～27)，23 (17～31)，17 (12～23)，13 (8～19) 和10 (5～14) μg·L-1(表1)，調(diào)整DOC濃度與稚蚌的96 h Cu EC50值呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(R = -0.968, P=0.007, 圖3)。

3 討論(Discussion)

稚蚌96 h Cu EC50值為19 μg·L-1，低于美國(guó)環(huán)境保護(hù)署報(bào)道的淡水貝類Actinonaias sp. 和Utterbackia imbecillis稚蚌的Cu LC50或EC50值(27～199 μg·L-1)[6]，亦低于Wang等[20]研究所報(bào)道的稚蚌Neosho mucket (23～43 μg·L-1)，Scaleshell (29 μg·L-1，瀕危種)和Wavy-rayed lampmussel (21～25 μg·L-1)的EC50值，并且十分接近于漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)GB11607—89中有關(guān)Cu的限量標(biāo)準(zhǔn)(10 μg·L-1)。一方面，說(shuō)明背角無(wú)齒蚌稚蚌對(duì)環(huán)境中Cu濃度的變化十分敏感，可以作為瀕危蚌種的替代指示物，用以較為有效地監(jiān)測(cè)水環(huán)境中銅污染的狀況；另一方面，在類似本研究中硬度和pH值低于前人報(bào)道的水環(huán)境里，稚蚌對(duì)重金屬離子濃度的變化可能更加敏感，更易引起活動(dòng)減少甚至死亡的應(yīng)激反應(yīng)。Wang等[20]的研究實(shí)驗(yàn)用水的硬度為177 mg·L-1，而本實(shí)驗(yàn)對(duì)照組Ca2+([Ca]) 和 Mg2+([Mg]) 的濃度分別為1 和 1.4 mg·L-1，其實(shí)驗(yàn)用水的硬度僅為8.3 mg·L-1(用CaCO3計(jì)算硬度，所用公式為2.47[Ca] + 4.11[Mg])[22]；此外，Wang等[20]實(shí)驗(yàn)用水的pH為8.5，亦高于本實(shí)驗(yàn)用水(pH=6.7～7.2)，二者水的硬度和pH的差異也許是導(dǎo)致背角無(wú)齒蚌稚蚌對(duì)銅較為敏感的重要原因。具體的機(jī)制尚待今后進(jìn)一步的研究來(lái)確定。

金屬自由陽(yáng)離子主要隨DOC濃度的變化而變化，對(duì)毒性金屬而言，通常認(rèn)為DOC是影響其生物利用度最重要的水化學(xué)因子，因?yàn)镈OC可與銅絡(luò)合成不具有毒性的溶解性銅Cu-DOC[11-12]，可以有效緩解Cu的毒性；因此，美國(guó)環(huán)保署將其作為制定關(guān)于重金屬元素新的國(guó)家水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)首要考慮的水化學(xué)因子。值得注意的是，從本研究的結(jié)果來(lái)看，僅調(diào)整DOC濃度，而不調(diào)整硬度和pH，對(duì)降低銅毒性、減少稚蚌的死亡以及提高96-h Cu EC50值等方面效果并不明顯，甚至有負(fù)相關(guān)關(guān)系(R= -0.968, P=0.007)。

在以往對(duì)鎘毒性的研究中也出現(xiàn)過(guò)類似情況，如有研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)配體(蘋果酸、檸檬酸)的存在對(duì)小麥根的Cd毒性影響不大[7]，推測(cè)植物對(duì)Cd的吸收是受溶液相中擴(kuò)散過(guò)程控制，有機(jī)配體的加入可以幫助Cd2+從溶液中運(yùn)輸?shù)缴锬け砻?，促進(jìn)植物根系吸收，造成毒性不變或增加。但背角無(wú)齒蚌稚蚌對(duì)Cu的吸收是否與植物類似，需要進(jìn)行更多的研究來(lái)加以證實(shí)。

我們?cè)?jīng)研究了調(diào)節(jié)暴露溶液硬度(CaCO3)即鈣(Ca)或鎂(Mg)離子的濃度后對(duì)降低銅毒性的影響，發(fā)現(xiàn)雖然Ca離子在某個(gè)特定的濃度下對(duì)降低銅毒性有作用，但與Ca濃度組之間不呈線性相關(guān)[23]，這與本研究的結(jié)果相似。在0.8 mg C·L-1DOC濃度調(diào)節(jié)下，盡管銅毒性有暫時(shí)性的降低，但在更高濃度的DOC溶液中，稚蚌的死亡并沒(méi)有隨之有效降低；顯示競(jìng)爭(zhēng)和絡(luò)合在降低重金屬毒性機(jī)理上的復(fù)雜性。

在與陰離子的絡(luò)合作用中，銅可與生物體內(nèi)調(diào)節(jié)鈉(Na)和氯(Cl)離子的特定酶相互作用, 與生物體(主要指腮)表面某些特定的活性位點(diǎn)(如氯細(xì)胞)結(jié)合，使鈉離子吸收受阻，破壞生物體的離子平衡，導(dǎo)致生物體死亡[9]；同時(shí)由于水溶性銅的形態(tài)還有CuCO3、Cu(OH)+等形式，pH值的高低有可能影響上述結(jié)合形態(tài)的存在狀況；同時(shí)，DOC作為金屬配體的形式也是多樣的，甚至一些有機(jī)絡(luò)合形態(tài)[24]也可以被生物直接吸收而產(chǎn)生毒性。此外，金屬硫蛋白也有可能對(duì)腮、消化腺中Cu等的儲(chǔ)存、運(yùn)輸和代謝產(chǎn)生影響[25]；因此僅靠調(diào)整DOC達(dá)到減弱金屬毒性的目的是很難實(shí)現(xiàn)的[11]。在下一步研究中要考慮取用富含DOC、硬度適中及pH偏堿的天然水作為實(shí)驗(yàn)用水，以驗(yàn)證最佳的水化學(xué)指標(biāo)組合對(duì)減輕重金屬毒性的有效性。

致謝：感謝中國(guó)科學(xué)院南京地理與湖泊研究所李寬意研究員和黃建明工程師在DOC分析中給予的幫助。

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