許霞，薛銀剛,,*，劉菲，金珊，姜逸，蔣少杰，施昕瀾，謝顯傳

1. 常州大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，常州 213164 2. 常州市環(huán)境監(jiān)測中心，江蘇省環(huán)境保護水環(huán)境生物監(jiān)測重點實驗室，常州 213001 3. 南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，污染控制與資源化研究國家重點實驗室, 南京210046

近年來，由于經(jīng)濟的快速發(fā)展、產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整升級，以及城市化和工業(yè)化進程的加快，大量工業(yè)企業(yè)進行了搬遷、停產(chǎn)或關(guān)閉，廢棄的工業(yè)污染場地數(shù)量逐步增加[1]。各類廢棄的工業(yè)企業(yè)污染場地會對人類健康和生態(tài)環(huán)境造成威脅，對于存在嚴(yán)重污染隱患的場地，急需管理與修復(fù)[2-3]。而廢棄的污染場地大多需要進行再一次開發(fā)利用，為防范工業(yè)企業(yè)關(guān)停搬遷過程中的偷排、偷倒和不規(guī)范拆遷等行為，以防污染加重，我國環(huán)保部于2014年頒布“關(guān)于加強工業(yè)企業(yè)關(guān)停、搬遷及原址場地再開發(fā)利用過程中污染防治工作的通知”，旨在保障工業(yè)企業(yè)場地再開發(fā)利用環(huán)境的安全[4]。

加強廢棄污染場地土壤環(huán)境對人體健康和生態(tài)環(huán)境的風(fēng)險評估，可為其開展風(fēng)險管理和實施修復(fù)措施提供科學(xué)依據(jù)[2]。目前，許多研究依靠土壤樣品的化學(xué)分析來進行環(huán)境風(fēng)險評價[5-6]，但由于廢棄污染場地生產(chǎn)歷史的復(fù)雜性，僅根據(jù)化學(xué)污染物指標(biāo)對其進行生態(tài)風(fēng)險評估是不全面的。生物毒性檢測作為化學(xué)污染物檢測的補充，是環(huán)境監(jiān)測與風(fēng)險管理的一種有效手段，可以用于反映污染物間的聯(lián)合毒性，并通過生物指標(biāo)直觀地反映污染物對人類健康和生態(tài)環(huán)境的影響[7]。Antczak等[8]基于大型溞的毒性機制研究人造化學(xué)品對生態(tài)系統(tǒng)和人體健康的危害；Ding等[9]運用發(fā)光細菌試驗對厭氧氨氧化底物和制藥廢水中4種抗生素的急性毒性進行探究，并依據(jù)50%抑制濃度(IC50)對其單獨和聯(lián)合急性毒性進行評價。

土壤污染因其隱蔽性、滯后性、累積性、難治理性等特點，導(dǎo)致國家及公眾對土壤污染的重視程度遠遠不夠，污染土壤的綜合評價對于準(zhǔn)確反映污染場地對人體健康和生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生的危害尤為重要，而目前我國尚未建立污染土壤的綜合評價方法[10]。與單一生物毒性測試相比，成組生物毒性測試能更全面反映供試樣品的綜合生物毒性[11-12]。本研究結(jié)合成組生物測試和化學(xué)分析方法對廢棄的農(nóng)藥廠污染土壤進行評價，以期為建立中國污染土壤綜合評價方法做基礎(chǔ)性儲備。所選取的毒性測試方法包括發(fā)光細菌(Luminescent bacteria)急性毒性試驗、大型溞(Daphnia magna)急性毒性試驗和蠶豆根尖(Vicia faba)微核試驗。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

1.1.1 供試土壤

采樣區(qū)位于常州市某廢棄農(nóng)藥廠，根據(jù)土壤環(huán)境監(jiān)測技術(shù)規(guī)范(HJT 166—2004)，用螺旋取土鉆采集該場區(qū)內(nèi)6處不同區(qū)域20 cm坡面深度的土壤樣品，每個采樣點采集3份土壤樣品，去除雜物并碾碎后混勻，采樣點具體分布見表1。供試土樣經(jīng)風(fēng)干、磨碎后過20目篩，用于后續(xù)土壤浸出液的制備。本次研究的土壤質(zhì)地為粉砂壤土，土壤有機質(zhì)、總氮、總磷和總鉀含量分別為13.87 g·kg-1、1.33 g·kg-1、1.61 g·kg-1和16.23 g·kg-1。

1.2 土壤浸出液提取

主要參照《固體廢物浸出毒性浸出方法-水平振蕩法》(HJ 557—2009)[13]制備土壤浸出液，制作過程進行少許修改。浸出液采用純水，GB/T 6682，二級，每份浸出液做3個平行。制備過程：取20 g干試樣于500 mL的錐形瓶，按液固比10:1 (L·kg-1) 加入浸取劑，蓋緊瓶蓋，將其垂直固定于水平往復(fù)式恒溫振蕩器，振蕩頻率為每分鐘(110±10)次，振幅為40 mm，于室溫下振蕩8 h后取下錐形瓶靜置16 h。用0.45 μm微孔濾膜對浸出液進行抽濾后，存放于用HNO3浸泡24 h的聚乙烯瓶中，測定浸出液pH值后將其置于4 ℃冰箱冷藏(各土壤樣品浸出液pH分別為S1：7.38，S2：7.31，S3：7.21，S4：7.35，S5：7.53，S6：7.41)，供毒性試驗使用。

1.3 生物毒性測試方法

1.3.1 發(fā)光細菌急性毒性試驗

(1)供試生物

選用ISO發(fā)光細菌急性毒性試驗標(biāo)準(zhǔn)方法所采用的菌種——費氏弧菌(Vibrio fischeri)，購自美國SDI公司。

(2)實驗方法和步驟

①水樣相對發(fā)光度測定

發(fā)光菌凍干粉的菌體復(fù)蘇：用4 ℃保存的1 mL MicroTox稀釋液復(fù)蘇發(fā)光菌凍干粉(置于-22 ℃保存的Microtox SOLO Reagent)15 min，用DeltaTox毒性檢測儀(SDI，USA)讀取復(fù)蘇菌液的發(fā)光強度(ATP模式下)，當(dāng)發(fā)光強度大于100萬光子數(shù)時即可用于毒性實驗。取水樣1 mL，加入0.1 mL滲透壓調(diào)節(jié)溶液，混勻后用DeltaTox毒性檢測儀進行實驗(B-Tox模式下)，先讀取0.1 mL復(fù)蘇菌液的發(fā)光強度，再取調(diào)節(jié)滲透壓后的水樣0.9 mL加入到0.1 mL復(fù)蘇菌液中，混勻后恒溫5 min后測其相對發(fā)光度，每組試驗做3個平行，對照組為MicroTox稀釋液。

②質(zhì)量保證和質(zhì)量控制

按照①的測試步驟，2.2 mg·L-1Zn2+的相對發(fā)光度在20～80之間；步驟②中發(fā)光菌的CF值在0.6～1.8之間。

1.3.2 大型溞急性毒性實驗

(1)供試生物

供試溞(Daphnia magna)取自中國科學(xué)院水生生物研究所，經(jīng)分類鑒定后，用孤雌生殖法獲取水溞單克隆純品系，以斜生柵藻為餌進行培養(yǎng)，獲得純品系生物株。

(2)實驗方法和步驟

①預(yù)試驗

在正式實驗之前，先進行較大范圍濃度系列(如0.1～100 mg·L-1)的預(yù)實驗，從而為正式試驗設(shè)置受試物的濃度。預(yù)實驗每個濃度放置5個幼溞，設(shè)置4組平行組，持續(xù)時間48 h后觀察結(jié)果，找出被測水樣使大型溞全部產(chǎn)生活動抑制的最低濃度和最大耐受濃度的范圍。

②正式試驗

根據(jù)預(yù)試驗的結(jié)果，按幾何級數(shù)的濃度系列設(shè)計6個濃度的試驗液，每個濃度4組平行，同時設(shè)置空白對照(各4組)，各土壤浸出液正式試驗稀釋濃度梯度分別設(shè)置為：S1和S4為0.39%、0.78%、1.56%、3.13%、6.25%、12.5%；S2和S6為3.125%、6.25%、12.5%、25%、50%、100%；S3和S5為0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%。將每個濃度和每個對照組各放5個幼溞，試驗期間不再喂食，試驗溫度控制在18～22 ℃，持續(xù)48 h后記錄每個濃度大型溞活動受抑制數(shù)，計算48 h-EC50值。

③質(zhì)量保證和質(zhì)量控制

用分析純重鉻酸鉀測定試驗用大型溞24 h-EC50在0.5～1.2 mg·L-1之間；實驗中空白對照未出現(xiàn)不活動大型溞。

1.3.3 蠶豆根尖微核試驗

(1)試驗材料

試驗所用的蠶豆(Vicia faba)品種為松滋青皮豆，是篩選出的較為敏感的品種，購于江蘇省常州市竹林菜市場。

(2)實驗方法和步驟

將松滋青皮豆放入盛有自來水的燒杯中，于25 ℃的恒溫箱中浸泡26～30 h，待種子吸脹后，取出種子，用紗布包裹放入恒溫箱內(nèi)催芽12～30 h。選取初生根生長良好、根長一致種子，放于盛有被測水樣的培養(yǎng)皿中，用蒸餾水處理做對照；處理6 h后將種子洗凈，放于恒溫箱中恢復(fù)培養(yǎng)24 h；將恢復(fù)后的種子用卡諾固定液固定24 h；固定好的幼根用蒸餾水浸洗2次后加入5 mol·L-1HCl淹沒幼根，于28 ℃水浴鍋中水解至幼根被軟化；蒸餾水浸洗2次，堿性品紅染色10 min，加蓋玻片壓片。在數(shù)碼顯微鏡BSmart zoom 5(Carl Zeiss Jena，Germany)下鏡檢觀察并拍照。

表1 廢棄農(nóng)藥廠土壤樣品分布情況Table 1 Distribution of soil samples in the waste pesticide factory

(3)質(zhì)量保證與質(zhì)量控制

對于嚴(yán)重污染的土壤，其浸出液可能造成根尖死亡，應(yīng)稀釋后再做檢測。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)用Excel軟件(2010版本)計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。(1)發(fā)光細菌相對發(fā)光度由Deltatox系統(tǒng)計算得出；(2)大型溞48 h-EC50值和95%置信區(qū)間用SPSS軟件(22.0版本)計算得出；(3)蠶豆根尖微核試驗中各測試樣品的微核千分率(MCN‰)計算方法見公式(1)，污染指數(shù)(PI)判別方法見公式(2)。

(1)

(2)

2 結(jié)果(Results)

2.1 發(fā)光菌急性毒性實驗

實驗結(jié)果根據(jù)中國科學(xué)院南京土壤所發(fā)光菌毒性分級標(biāo)準(zhǔn)(表2)進行判定[11]，結(jié)果如圖1所示。該廢棄農(nóng)藥廠6個點位土壤樣品浸出液的發(fā)光細菌急性毒性測試結(jié)果表明，6個點位的土壤樣品毒性檢出率為100%。其中S3和S5的土壤浸出液對發(fā)光細菌的抑制作用最強，其發(fā)光細菌急性毒性檢測結(jié)果為重毒；S1、S2和S4的土壤浸出液毒性比S3和S5弱，屬于中毒；S6的土壤浸出液毒性最小，為低毒。

表2 發(fā)光細菌急性毒性級別Table 2 Acute toxicity level of luminescent bacteria

圖1 土壤浸出液發(fā)光細菌急性毒性結(jié)果Fig. 1 Results of luminescent bacteria acute toxicity of soil leachates

圖2 土壤浸出液大型溞運動抑制劑量-效應(yīng)關(guān)系Fig. 2 Dosage-response relationship of soil leachates on Daphnia magna immobilization

2.2 大型溞急性毒性結(jié)果

土壤浸出液大型溞運動抑制劑量-效應(yīng)關(guān)系(圖2)表明，空白對照組大型溞均未出現(xiàn)死亡和運動受抑制等異常癥狀。S1和S3的土壤浸出液原液對大型溞均具有很高的毒性效應(yīng)，48 h后對大型溞運動抑制率為100%。S1和S4在土壤浸出液稀釋體積分?jǐn)?shù)為12.5%時，所有實驗組大型溞均出現(xiàn)死亡或運動受抑制現(xiàn)象；而S3和S5在土壤浸出液稀釋體積分?jǐn)?shù)為1.6%時，大型溞運動抑制率分別為90%和96.67%。

農(nóng)藥廠土壤浸出液大型溞急性毒性結(jié)果如表3所示，急性毒性評價標(biāo)準(zhǔn)參照《水和廢水監(jiān)測分析方法》(第四版)-溞類急性活動抑制毒性分級標(biāo)準(zhǔn)(48 h-EC50≤1：極高毒，1<48 h-EC50≤10：高毒，10<48 h-EC50<100：中毒，48 h-EC50>100：低毒)[14]。6個點位的土壤浸出液樣品大型溞急性毒性檢測結(jié)果表明：S3和S5的土壤浸出液對大型溞的抑制作用最為明顯，其浸出液檢測結(jié)果為極高毒，S1、S2和S4為高毒，S6為中毒，檢測結(jié)果與發(fā)光細菌急性毒性結(jié)果基本相同。

2.3 蠶豆根尖微核實驗

農(nóng)藥廠土壤浸出液蠶豆根尖微核實驗結(jié)果見表4，根據(jù)《水和廢水監(jiān)測分析方法》(第四版)中污染指數(shù)(PI)判別法(污染指數(shù)在0～1.5區(qū)間為基本無污染；1.5～2區(qū)間為輕污染；2～3.5區(qū)間為中污染；3.5以上為重污染)進行污染情況的鑒定[14]。S3和S5的遺傳毒性檢測結(jié)果為重污染，S1、S4和S6為中污染，S2為輕污染。與急性毒性檢測結(jié)果進行對比發(fā)現(xiàn)，除S2和S6點位的土壤浸出液遺傳毒性與急性毒性的檢測結(jié)果略有不同，其余點位樣品的急性毒性和遺傳毒性效應(yīng)基本一致。

3 討論(Discussion)

3.1 廢棄農(nóng)藥廠污染場地土壤浸出液的急性毒性和遺傳毒性篩查結(jié)果

生物毒性檢測是基于生態(tài)毒理學(xué)而發(fā)展的檢測方法，主要用于研究有毒有害物質(zhì)對生態(tài)系統(tǒng)中的生物所造成的分子、細胞、器官、個體和群落等不同生命層次的損傷，是能直觀反映環(huán)境介質(zhì)中所有共存污染物整體效應(yīng)的生物學(xué)方法[15]。發(fā)光細菌和大型溞是目前國際廣泛認可的測試生物，由于其快速、有效和費用低等特點，被廣泛用于化學(xué)品、農(nóng)藥以及工業(yè)廢水的風(fēng)險評估和監(jiān)測[16-17]。蠶豆根尖微核遺傳毒性試驗是適用于分析化學(xué)物質(zhì)對生物產(chǎn)生毒害的遺傳毒理學(xué)方法，在環(huán)境監(jiān)測中得到了廣泛應(yīng)用[18]。宋曉威等[3]利用發(fā)光細菌、大型溞和斜生柵藻3種受試生物檢測廢棄農(nóng)藥廠淺層地下水的急性毒性，結(jié)果表明：3種受試生物的敏感性雖有所不同，但毒性效應(yīng)均隨著時間的增加有所增大。本次研究運用成組生物毒性試驗對農(nóng)藥廠污染場地土壤進行研究，首先通過發(fā)光細菌急性毒性試驗進行土壤浸出液毒性級別篩選，同時結(jié)合大型溞急性毒性實驗做進一步毒性監(jiān)測與評價，并補充蠶豆根尖微核試驗對污染土壤浸出液進行遺傳毒性檢測，從而建立適用于污染土壤生物毒性綜合評價的方法。

表3 土壤浸出液大型溞急性毒性結(jié)果Table 3 Results of Daphnia magna acute toxicity of soil leachates

表4 土壤浸出液蠶豆根尖微核結(jié)果Table 4 Results of micronucleus genetic toxicity test on Vicia faba root tips of soil leachates

由表5可以看出，2種急性毒性試驗結(jié)果基本一致，3種毒性測試方法的結(jié)果具有較好的一致性，適用于農(nóng)藥廠污染場地的毒性分析。比較3種毒性試驗對土壤樣品的測試結(jié)果，發(fā)光細菌和大型溞相對來說較為敏感，其中發(fā)光細菌毒性試驗周期最短，可用于土壤浸出液毒性級別的初步篩選，但發(fā)光菌抑制實驗容易受到各種因素干擾，準(zhǔn)確性較差；大型溞培養(yǎng)方便且對許多毒物敏感，被廣泛用于水生生態(tài)毒理學(xué)研究；從本次研究結(jié)果來看，綜合2種毒性試驗更能全面地反映土壤樣品的急性毒性；蠶豆根尖是微核技術(shù)檢測常用的材料，可以用于反映污染土壤中存在的潛在遺傳危害[18]，通過蠶豆根尖微核試驗可以看出農(nóng)藥廠的土壤污染對遺傳毒性也造成了一定影響(表5)；可見，運用成組生物毒性更利于準(zhǔn)確地生物毒性評價[19]。

3.2 生物毒性試驗結(jié)果與理化分析結(jié)果的相關(guān)性

該廢棄農(nóng)藥廠由于長期的農(nóng)藥生產(chǎn)、加工和運輸過程中摻雜多種污染物質(zhì)，已對土壤環(huán)境造成了較大程度的影響，通過對農(nóng)藥廠不同點位的土壤進行毒性測試，發(fā)現(xiàn)該污染場地多處場所的土壤具有生物毒性，且部分點位的土壤毒性非常大，對生態(tài)環(huán)境和人體健康具有一定的危害。章霖之等[20-21]和何歡等[22]對該農(nóng)藥廠土壤所含有的揮發(fā)性有機污染物(volatile organic compounds，VOCs)和多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)進行調(diào)查(表6)，發(fā)現(xiàn)該農(nóng)藥污染場地土壤中揮發(fā)性有機污染物以苯系物為主，同時還檢出14種多環(huán)芳烴，其中苯是人類致癌物，甲苯、乙苯、二甲苯以及其他多環(huán)芳烴也都具有不同程度的“致突變、致癌和致畸”作用[23-25]，此類持久性有機污染物不僅對人體有潛在危害[26]，同時會對土壤中的生物具有毒性效應(yīng)。目前，有16種多環(huán)芳烴已被美國環(huán)境保護署列為優(yōu)先污染物[27]，由于其不易溶于水，具有高度的親脂性[28]，致使在生物體內(nèi)逐級富集[29]。此次研究區(qū)域土壤中多環(huán)芳烴類污染物以萘、菲、苯并[k]熒蒽和芘為主，這些物質(zhì)可能對土壤中存在的生物產(chǎn)生不利影響[30]。由表7可以看出，該農(nóng)藥廠污染土壤中含有甲萘酚、乙草胺、丁草胺和撲虱靈等農(nóng)藥成分，以撲虱靈的濃度最高，其中危險品庫和輔助設(shè)施區(qū)土壤中所含農(nóng)藥成分最高。農(nóng)藥在土壤中的長期存留不僅對生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生負面影響，同時危害土壤中的生物[31]。

由表6可以看出，生產(chǎn)車間內(nèi)(S5)的土壤所含多環(huán)芳烴和揮發(fā)性有機物濃度最高，其次是輔助設(shè)施區(qū)域(S3)，同時S3和S5點位土壤中農(nóng)藥的檢出濃度較高。綜合該研究區(qū)域土壤理化指標(biāo)分析結(jié)果與生物毒性試驗結(jié)果可知，含污染物濃度較高的研究場所(S3和S5)，發(fā)光菌和大型溞急性毒性試驗結(jié)果分別為重毒和極高毒，蠶豆根尖微核試驗結(jié)果為重污染；含污染物濃度最低的研究場所(廠區(qū)外：S6)，發(fā)光菌和大型溞急性毒性試驗結(jié)果分別為低毒和中毒，蠶豆根尖微核試驗結(jié)果為中污染；不難看出，土壤中所含污染物濃度已經(jīng)對土壤毒性效應(yīng)產(chǎn)生影響，污染物濃度較高的場所，其毒性作用也較高，生物毒性檢測結(jié)果與理化分析結(jié)果呈現(xiàn)出較好的相關(guān)性。

表5 農(nóng)藥廠污染土壤生態(tài)毒性診斷結(jié)果Table 5 Ecotoxicity diagnosis of contaminated site in the waste pesticide factory

表7 農(nóng)藥廠污染土壤中農(nóng)藥檢出濃度Table 7 Detection concentration of pesticides in pesticide contaminated soil

注： ND表示污染物未檢出，/表示未研究該區(qū)域樣品。

Note: ND indicates the contaminant was not detected, / indicates the sample was not studied.

綜上所述，綜合發(fā)光細菌急性毒性試驗、大型溞急性毒性實驗和蠶豆根尖微核試驗進行土壤浸出液毒性級別篩選、監(jiān)測與評價，建立污染土壤生物毒性綜合評價方法對于準(zhǔn)確和全面地反映農(nóng)藥廠污染場地對人體健康和生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生的危害具有重要意義。同時研究結(jié)果表明土壤的生物毒性跟其中所含的污染物質(zhì)密切相關(guān)，毒性試驗結(jié)果與土壤理化指標(biāo)具有較好的相關(guān)性，可見，結(jié)合化學(xué)分析與生物毒性檢測是進行污染土壤綜合評價和危害識別的重要手段。

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