張耀磊 翟煥趁 張帥兵 蔡靜平

(河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001)

基于監(jiān)測過氧化氫酶活性對儲藏玉米AFB1污染的早期預(yù)警

張耀磊 翟煥趁 張帥兵 蔡靜平

(河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001)

早期預(yù)警是防控儲藏玉米污染黃曲霉毒素B1(AFB1)的重要手段。將不同含水量的玉米置于各種溫度環(huán)境下進行儲藏試驗，研究過氧化氫酶活性變化與玉米污染黃曲霉毒素B1(AFB1)的關(guān)系，結(jié)果表明，兩者數(shù)據(jù)變化的趨勢一致，AFB1是過氧化氫酶活性的二次曲線函數(shù)(相關(guān)性系數(shù)大于0.95)。儲藏溫度和玉米含水量等條件可改變所含霉菌產(chǎn)生AFB1和升高過氧化氫酶活性的速度，但不影響數(shù)值變化的趨勢。在各種儲藏條件下，過氧化氫酶活性變化可比玉米中AFB1含量顯著變化的起始點提前4～21 d。因此，借助檢測過氧化氫酶活性的方法可以早期預(yù)警儲藏玉米污染AFB1。

玉米；過氧化氫酶； AFB1；預(yù)警；儲藏

玉米是中國主要的糧食作物，同時也是主要的工業(yè)和飼料原料。中國玉米的種植面積和總產(chǎn)量僅次于美國，居世界第二位[1]。與小麥及稻谷相比，玉米的胚部占比大，吸濕性強，容易受到霉菌的侵染[2]。雖然玉米種植期間容易受鐮孢霉等病原菌的危害而污染脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)等真菌毒素[3]，但當玉米收獲轉(zhuǎn)入儲藏環(huán)節(jié)后，腐生型的黃曲霉菌很容易在玉米籽粒上生長。研究[4-5]表明，玉米是黃曲霉菌產(chǎn)生黃曲霉毒素B1(AFB1)最適合的基質(zhì)之一，一旦玉米儲藏條件符合黃曲霉菌產(chǎn)毒的要求，就會導(dǎo)致AFB1的污染。據(jù)中國部分地區(qū)真菌毒素污染狀況調(diào)查[3]，國內(nèi)近10個主要玉米生產(chǎn)地區(qū)黃曲霉毒素污染率達到92.3%，超標率達13.8%。玉米易污染毒素的特性對人和動物的食用安全形成嚴重的威脅，世界各地每年均有食用毒素污染玉米導(dǎo)致嚴重中毒的報導(dǎo)[6-7]。

根據(jù)食品安全的相關(guān)法規(guī)，AFB1超標的玉米不得直接作為食品和飼料的原料，必須經(jīng)過去除毒素處理才能被利用。近幾年，國內(nèi)外在黃曲霉毒素削減或降解處理方面投入了大量的人力和物力進行研究，取得了可喜的成就，如生物發(fā)酵法[8-9]、酶學(xué)降解法[10]、臭氧氧化法[11]、機械去除法[12]等均可有效地降低玉米中的毒素含量。但這些減毒的處理均要提高玉米的價格成本，且可能改變玉米的性狀或原用途，因此，防控黃曲霉毒素危害最經(jīng)濟和安全的方法是避免玉米被毒素污染。

對儲藏玉米進行霉菌活動監(jiān)測是防控黃曲霉菌產(chǎn)毒的有效方法。當發(fā)現(xiàn)玉米中有潛在產(chǎn)毒可能的真菌活動時，及時發(fā)出儲糧安全預(yù)警，利用通風(fēng)、干燥等技術(shù)對儲藏玉米進行降溫、去濕處理，即可有效遏制黃曲霉菌等產(chǎn)毒霉菌的生長、代謝，從而消除AFB1污染的威脅。這方面目前已經(jīng)有較多相關(guān)的基礎(chǔ)性研究，有些在實際應(yīng)用中展示出良好的效果[13-14]。例如，通過檢測糧堆中CO2含量變化對玉米可能產(chǎn)生黃曲霉毒素進行預(yù)警[15]，利用好氧性微生物體內(nèi)過氧化氫酶活性值的變化反映其生理活動狀態(tài)對微生物的生長進行預(yù)測等[16-17]。這些方法通過間接的檢測指標了解糧食中微生物活動狀態(tài)，在檢測的靈敏度和檢測數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性方面比傳統(tǒng)的微生物檢測方法及現(xiàn)有國家大型糧庫使用的糧情檢測方法有較好的改進。過氧化氫酶與好氧性微生物生長的相關(guān)性已經(jīng)有較多的研究[17]，但尚不明確玉米所含真菌過氧化氫酶活性變化與污染AFB1的聯(lián)系。本試驗主要研究儲藏玉米所含霉菌細胞中過氧化氫酶的特性，試圖構(gòu)建酶活性變化與黃曲霉菌產(chǎn)生AFB1的直接關(guān)系，通過監(jiān)測過氧化氫酶活性的變化，分析、判斷玉米儲藏期間污染AFB1的風(fēng)險程度，旨在為玉米安全儲藏的早期預(yù)警提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玉米樣品：河南當年產(chǎn)玉米，購于鄭州糧食市場；

黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫定量試劑盒：江蘇蘇微微生物研究有限公司；

過氧化氫等其他試劑，分析純，市售。

1.2 試驗儀器

過氧化氫酶活性檢測儀：SK.WJH-2型，成都華糧倉儲設(shè)備有限公司；

酶標儀：DNM-9606，北京普朗新技術(shù)有限公司；

恒溫恒濕培養(yǎng)箱：KMF720型，德國binder GmbH公司；

凈化工作臺：SW-CJ-2F型，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 玉米的水分調(diào)節(jié)和模擬儲藏 將玉米放置在潔凈的容器內(nèi)，根據(jù)試驗水分的要求，定量噴灑無菌水至玉米表面，然后放置4℃冰箱內(nèi)使水分逐漸吸收，并達到籽粒的水分平衡，該過程一般為36～48 h。然后將玉米分裝在容器內(nèi)，瓶口用浸泡有保濕劑的10層紗布封口，放置在調(diào)節(jié)到所需溫度和相對濕度的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進行模擬儲藏(玉米顆粒表面自然攜帶有黃曲霉菌)。

1.3.2 霉菌帶菌量檢測 稱取25 g玉米，置于含225 mL無菌水和玻璃珠的具塞三角瓶中，在振幅大于5 cm的振蕩器中高速震蕩30 min，制成10-1g/mL濃度菌懸液，將其分別稀釋到10-2～10-6稀釋度，取各稀釋梯度菌懸液1 mL加入到無菌平皿，同時加改良察氏培養(yǎng)基，每個稀釋度做3～5個重復(fù)，28℃培養(yǎng)，5 d菌落計數(shù)，7 d對菌落進行菌種鑒定。

1.3.3 過氧化氫酶活性檢測 稱取待測玉米樣品100 g，用無菌水分3次振蕩洗滌，定容制得500 mL菌懸液。將待測菌懸液加入到過氧化氫酶活性檢測儀的反應(yīng)室后加熱，當檢測液溫度升高到30℃時，加入10 mL 30%的H2O2，然后密閉反應(yīng)室上蓋開始檢測。10 min后儀器顯示器顯示測量的過氧化氫酶活性檢測值。過氧化氫酶活性檢測單位(U)：由傳感器檢測反應(yīng)容器中過氧化氫酶催化分解H2O2產(chǎn)生的氧氣，當傳感器產(chǎn)生1 μA的電流時定義為1過氧化氫酶活性單位。

1.3.4 黃曲霉毒素B1檢測 使用黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫定量測試盒進行檢測。依據(jù)固相酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)原理，通過抗黃曲霉毒素B1抗體與酶標抗原、待測抗原的競爭免疫反應(yīng)以及酶的催化顯色反應(yīng)相結(jié)合來檢測黃曲霉毒素B1。

1.3.5 水分測定方法 按GB/T 5497—1985執(zhí)行。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理方法 使用SPSS 17 軟件和EXCEL軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米儲藏過程中過氧化氫酶與AFB1變化的相關(guān)性

現(xiàn)有研究[16-17]表明，在糧食儲藏期間生長的霉菌均具有過氧化氫酶陽性的特征，通過檢測糧食洗滌液的過氧化氫酶活性，可以了解霉菌生長活動的狀況。Zhai等[15]對有霉菌生長的玉米進行黃曲霉菌和AFB1含量監(jiān)測，結(jié)果顯示無論儲藏玉米中黃曲霉菌是否為優(yōu)勢菌，只要玉米中有霉菌的顯著活動，AFB1含量就會以不同的速率增加。這些研究結(jié)果提示，即使過氧化氫酶與黃曲霉菌代謝產(chǎn)生AFB1沒有直接的聯(lián)系，但仍有可能對玉米儲藏期的AFB1污染進行間接的監(jiān)測。

對不同性狀的玉米進行AFB1產(chǎn)毒試驗，跟蹤監(jiān)測玉米洗滌液的過氧化氫酶活性和玉米中AFB1含量的變化，研究玉米污染AFB1與過氧化氫酶活性變化的相關(guān)性，結(jié)果表明(表1)，對于不同的玉米品種、儲藏條件，各試驗組黃曲霉菌產(chǎn)生AFB1的速率及最終玉米被毒素的污染量均有較大的差異。比較AFB1含量和酶活性值的變化數(shù)據(jù)，可發(fā)現(xiàn)AFB1含量變化幅度高的試驗組過氧化氫酶活性變化也更大，兩者具有相同的變化趨勢，但兩組數(shù)據(jù)顯然不是線性關(guān)系。通過對AFB1和酶活性變化數(shù)據(jù)進行曲線擬合，發(fā)現(xiàn)各試驗組數(shù)據(jù)均可擬合出相關(guān)性系數(shù)達到0.95或更高的二次曲線方程。這與前期研究[17]發(fā)現(xiàn)真菌過氧化氫酶活性伴隨著真菌的生長而升高，兩者呈現(xiàn)線性關(guān)系的現(xiàn)象不同；導(dǎo)致玉米污染AFB1和過氧化氫酶活性變化呈二次曲線函數(shù)關(guān)系的原因是多方面的，其中主要有兩個方面：① 真菌毒素屬次生代謝產(chǎn)物，在真菌生命過程的后期形成，時間上顯著遲后于真菌的菌絲體生長；② 玉米中所有可生長的霉菌均可產(chǎn)生過氧化氫酶，即使黃曲霉菌不生長，干生性的灰綠曲霉生長也會使酶活性緩慢升高。盡管如此，真菌菌絲的生長、AFB1的產(chǎn)生與其酶活性變化趨勢是一致的，因此利用過氧化氫酶活性變化間接衡量真菌毒素產(chǎn)生的設(shè)想是合理的，只要進行充分的試驗，建立一系列如表1所示的曲線方程，即有可能計算或預(yù)測某一條件下玉米中AFB1可能的污染量，評估玉米儲藏的風(fēng)險程度。

2.2 玉米儲藏條件對過氧化氫酶活性及AFB1含量變化的影響

2.2.1 玉米水分的影響 儲藏玉米的含水量是影響霉菌生長和產(chǎn)毒的主要因素。將不同含水量玉米置于25℃條件下儲藏，結(jié)果表明(圖1)，各試驗組玉米中的霉菌生長產(chǎn)毒及相應(yīng)的過氧化氫酶活性變化差異非常顯著(P<0.01)。玉米儲藏14 d時，15.5%含水量組過氧化氫酶活性和AFB1含量數(shù)據(jù)均無顯著變化，16.7%含水量玉米組可檢出過氧化氫酶活性顯著增高，17.6%水分組玉米則兩項指標均發(fā)生顯著變化，過氧化氫酶活性從零檢出增加到240 U，AFB1含量從檢測陰性增加到14.8 μg/kg。對兩種方法檢測的結(jié)果進行比較還可發(fā)現(xiàn)，在整個玉米儲藏試驗期間，3個含水量玉米試驗組過氧化氫酶活性的日均變化率分別為2.6，12.2，19.4 U，AFB1含量日均增加速率分別為0.0，0.2，1.7 μg/kg，顯然，在儲藏玉米含水量發(fā)生變化的狀態(tài)下，檢測洗滌液過氧化氫酶活性相比直接檢測AFB1可更加精確地細分儲藏過程中的量值變化，兩者的數(shù)值波幅相差近10倍，這一特性對評估玉米儲藏污染AFB1風(fēng)險有重要的意義。

表1 過氧化氫酶活性變化與AFB1 含量變化的關(guān)系?Table 1 Relationship between the change of catalase activity and AFB1 contamination in stored maize

儲藏溫度25℃

從圖1還可看出，玉米含水量為15.5%時，AFB1含量42 d一直維持不變，過氧化氫酶活性在儲藏至28 d后開始顯著升高，兩者似乎沒有完全對應(yīng)。檢測15.5%水分玉米所含的霉菌菌群特征，發(fā)現(xiàn)儲藏至28 d后玉米中主要優(yōu)勢菌為灰綠曲霉，這些霉菌屬于干生性的霉菌，它們的生長使過氧化氫酶活性緩慢升高。Zhai等[17]的研究認為，干生性霉菌本身不產(chǎn)毒，但這些霉菌可作為儲糧的先導(dǎo)性生長菌群，通過它們的生長改變儲藏糧食的生態(tài)，使玉米中所含的菌群發(fā)生演替，形成黃曲霉等霉菌可生長的環(huán)境，從而可能在更長的儲藏期后產(chǎn)生AFB1或其他毒素。鑒于過氧化氫酶活性檢測對于玉米污染AFB1先導(dǎo)性生長霉菌的高靈敏響應(yīng)，賦予該方法對玉米常規(guī)儲藏污染AFB1具有可靠、靈敏的預(yù)警特性?？蓾M足糧庫儲糧實踐中對具有安全水分玉米進行儲藏監(jiān)測的需要。

2.2.2 溫度的影響 對于含水量較高的玉米，各類霉菌均可在常規(guī)儲藏的溫度范圍內(nèi)生長。不同的溫度可顯著影響霉菌生長和代謝的速度，從而對霉菌的過氧化氫酶活性和產(chǎn)生AFB1有同步的影響。由圖2可知，在設(shè)定的玉米水分條件下(17.0%)，較高的溫度更適合霉菌產(chǎn)生AFB1，在30℃和35℃條件下儲藏7 d時玉米中的毒素含量分別增加到4.1 μg/kg和2.9 μg/kg，25℃條件下玉米儲藏35 d后AFB1含量才增加到3.3 μg/kg。盡管各種溫度條件對過氧化氫酶活性變化和AFB1含量增加速率影響的差異性較大，但其影響的方向是完全一致的。數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在42 d 監(jiān)測試驗中，25～35℃的溫度條件在不同的時間點產(chǎn)生AFB1，與各時間點過氧化氫酶活性變化數(shù)據(jù)的相關(guān)性系數(shù)大于0.95，說明在不同的溫度條件下，過氧化氫酶活性與AFB1含量變化具有相同的變化規(guī)律。

將玉米儲藏在20℃條件下，過氧化氫酶活性在儲藏至28 d時出現(xiàn)顯著升高(P<0.05)(圖2)，主要是玉米中一些適合低溫環(huán)境的青霉菌等菌群生長所致，但在較低溫度環(huán)境下黃曲霉菌也會緩慢的生長，一般黃曲霉菌產(chǎn)毒的起始溫度在12℃左右。在本試驗中，20℃試驗組玉米產(chǎn)生AFB1的時間延遲到第56天，表明只要在霉菌可生長的溫度范圍，儲藏玉米就存在污染毒素的概率。因此，與AFB1無關(guān)的青霉菌生長可顯示儲藏玉米具備霉菌可生長的環(huán)境，間接預(yù)警儲藏的安全風(fēng)險。在實際應(yīng)用中，可將過氧化氫酶活性變化與環(huán)境溫度等因素結(jié)合，量化評估玉米儲藏的安全性，對儲糧處理方案進行科學(xué)決策。

玉米水分含量為17.0%

2.3 利用過氧化氫酶活性變化預(yù)警玉米污染AFB1的特性和方法

在常規(guī)玉米儲藏的條件下，受環(huán)境濕度或糧堆微環(huán)境濕熱擴散等因素的影響，玉米可能因籽粒外層含水量的升高而導(dǎo)致霉菌的生長，這個過程通常比較緩慢，如果在霉菌產(chǎn)毒前發(fā)現(xiàn)預(yù)警信號，只需幾天的糧倉常規(guī)通風(fēng)或降溫等方法處理，就能有效遏制玉米污染AFB1[2]。

由表2可知，在不同的儲藏條件和玉米基質(zhì)中，AFB1的產(chǎn)生和過氧化氫酶活性變化速率均有較大的差異，但無論在哪一種儲藏條件下，過氧化氫酶活性的變化始終先于AFB1的產(chǎn)生。在6組試驗中，過氧化氫酶活性出現(xiàn)顯著升高(P<0.05)的時間比AFB1含量顯著增加(P<0.05)的時間分別提前4～21 d，比玉米中AFB1達到食品安全臨界點的20 μg/kg分別提前6～42 d。這一時間提前量可以滿足對具有染毒風(fēng)險玉米進行控制處理的需求。比較表2的各組數(shù)據(jù)還可發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)毒速率越慢的試驗組霉菌產(chǎn)毒與酶活性變化的數(shù)值差異越大，這一特性有其獨特的價值。實倉儲藏的糧食一般原始水分均會符合安全儲藏要求，但在儲藏期間受吸濕等多種因素影響而引發(fā)霉菌的緩慢生長，在這種情況下，儲糧中霉菌的呼吸、代謝作用較弱，沒有明顯的產(chǎn)熱和產(chǎn)生二氧化碳的現(xiàn)象，現(xiàn)有檢測糧溫和糧堆二氧化碳濃度等監(jiān)測方法對其活動難以有顯著的響應(yīng)，因此，檢測過氧化氫酶活性變化的方法可彌補現(xiàn)有各種儲糧監(jiān)測方法的缺陷。

由于霉菌合成AFB1與過氧化氫酶活性變化的關(guān)系是非線性的，增加了根據(jù)過氧化氫酶活性推導(dǎo)玉米毒素污染量的難度。雖然根據(jù)儲藏的溫度、玉米水分含量等參數(shù)可以找到過氧化氫酶活性變化預(yù)測AFB1的關(guān)系(見圖1、2)，但實際應(yīng)用時當糧堆溫度、相對濕度等參數(shù)發(fā)生復(fù)雜變化時將增大檢測的誤差。因此，需要構(gòu)建一個有效的預(yù)警程序。對不同儲藏條件玉米進行產(chǎn)毒試驗，檢測過氧化氫酶活性變化，并對數(shù)據(jù)進行回歸分析，結(jié)果表明(表3)，盡管各玉米儲藏試驗組之間的霉菌產(chǎn)毒速率差異高達1.5萬倍，但在玉米AFB1含量變化期間過氧化氫酶活性變化呈現(xiàn)線性關(guān)系，試驗數(shù)據(jù)與函數(shù)式的相關(guān)性系數(shù)大于0.95。進一步分析過氧化氫酶活性變化的特征，發(fā)現(xiàn)在一個時間段中過氧化氫酶活性的增速決定線性方程的參數(shù)，只要計算出某一定時間段的過氧化氫酶活性增加速率，即可在表3中找到適用的線性方程，可利用該函數(shù)式簡單地計算出未來任何時間點預(yù)測的酶活性值。有了這種方式，就可以正確地選擇過氧化氫酶活性與AFB1的二次曲線函數(shù)式，預(yù)測玉米污染AFB1的趨勢。

表2 過氧化氫酶對儲藏玉米AFB1變化的響應(yīng)特性Table 2 Respond characteristics of catalase activity on AFB1 contamination of stored maize

表3 玉米污染AFB1 期間過氧化氫酶活性的變化規(guī)律Table 3 Regularity of catalase activity changes in maize contaminated by AFB1

3 結(jié)論

過氧化氫酶活性值可反映玉米中霉菌的生理活動狀態(tài)，與玉米儲藏期間污染AFB1可以建立間接的聯(lián)系。在不同的儲藏條件和各種產(chǎn)毒特性下，可以擬合出一系列AFB1產(chǎn)生量與過氧化氫酶活性值變化的二次函數(shù)式，這是進行玉米污染AFB1預(yù)警的基礎(chǔ)。在儲藏溫度和玉米含水量不變的條件下，可以根據(jù)預(yù)先試驗獲得的酶活性與AFB1變化關(guān)系曲線評估玉米儲藏的風(fēng)險，其準確性、穩(wěn)定性和靈敏度均可滿足保障玉米安全儲藏的要求。

在常規(guī)儲藏條件下，玉米霉變的發(fā)生源于含水量和儲藏溫度的變化，為了對玉米污染AFB1進行預(yù)警，需要監(jiān)測過氧化氫酶活性的變化，先根據(jù)酶活性的變化速率確定適用的過氧化氫酶活性變化線性方程，然后計算出一定時間后的過氧化氫酶活性變化預(yù)測值，找到相匹配的酶活性值與AFB1產(chǎn)生量函數(shù)式，計算出玉米儲藏安全最高容許的過氧化氫酶變化峰值，通過控制玉米的儲藏溫度和含水量達到遏制污染AFB1超標的目標。

當然，玉米的儲藏條件有大量的組合，而且可能處于變化狀態(tài)；玉米品種、品質(zhì)等因素也可能影響黃曲霉菌產(chǎn)毒的速率。因此，要確保玉米儲藏的安全性，還需研究更多的影響參數(shù)，通過系統(tǒng)的試驗構(gòu)建完善的數(shù)據(jù)庫，實現(xiàn)對玉米污染AFB1的準確預(yù)警。

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Early warning of AFB1contamination in stored maize by monitoring catalase activity

ZHANG Yao-leiZHAIHuan-chenZHANGShuai-bingCAIJing-ping

(CollegeofBioengineering,HenanUniversityofTechnology,Zhengzhou,Henan450001,China)

The early warning is significant forpreventing stored maize from aflatoxin B1(AFB1) contamination. To reveal the relationship between the change of catalase activity and AFB1contamination in stored maize, the storage experiments of maize were carried out at different temperatures and moisture contents. The results showed the increasing trend of catalase activity and contaminated AFB1was accordant, which displayed a quadratic equation with the correlation coefficient of more than 0.95. The rates of catalase activity increase and AFB1production by mould in maize could be affected by storage temperature and maize moisture content, but their increasing trend was not changed. Moreover, it was found that catalase activity increase 4 to 21 days before the significant increase of AFB1content under each maize storage condition. Therefore, the early warning of AFB1contamination in stored maize could be achieved by the detection of catalase activity of mould in stored maize.

maize; catalase; aflatoxin B1; early warning; storage

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)(編號：2013CB127804)；河南省教育廳自然科學(xué)項目(編號：14A180004)；河南省高?？萍紕?chuàng)新團隊支持計劃(編號：15IRTSTHN019)

張耀磊，男，河南工業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生。

翟煥趁(1975—)，女，河南工業(yè)大學(xué)講師，博士。 E-mail: huanchenzhai@126.com 蔡靜平(1957—)，男，河南工業(yè)大學(xué)教授，碩士。 E-mail: caijp163@163.com

2016-10-25

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.01.026