劉小萍，林家坤，文躍輝，齊迅捷，劉 萍，田云霞，丁 軍

(1、萍鄉(xiāng)市中醫(yī)院檢驗科,江西萍鄉(xiāng)337000；2、博奧賽斯(天津)生物科技有限公司,天津300300;3、天津市醫(yī)療器械技術審評中心,天津300191)

Axceed 260測定人血清中糖類抗原50性能驗證

劉小萍1，林家坤1，文躍輝1，齊迅捷1，劉 萍2，田云霞2，丁 軍3

(1、萍鄉(xiāng)市中醫(yī)院檢驗科,江西萍鄉(xiāng)337000；2、博奧賽斯(天津)生物科技有限公司,天津300300;3、天津市醫(yī)療器械技術審評中心,天津300191)

目的驗證Axceed 260磁微粒全自動化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)(MCLIA)檢測人血清中糖類抗原50(CA50)的分析性能。方法依照美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）公布的EP15-A2、EP28-A3c、EP6-A、EP7-A2標準指南文件，對Axceed 260檢測CA50項目的精密度、正確度、參考區(qū)間、線性范圍、分析干擾進行驗證。結(jié)果Axceed 260檢測CA50項目的批內(nèi)精密度、實驗室內(nèi)精密度變異系數(shù)分別為3.45~4.95%和3.35~4.64%；定值參考物測值在驗證區(qū)間內(nèi)；測定線性范圍與廠商提供的范圍一致；參考區(qū)間適用于本地區(qū)人群；與CA199，CA125無交叉反應；常規(guī)干擾物（膽紅素(0.2mg/ml)、血紅蛋白(5mg/ml)、甘油三酯(10mg/ml)）對試劑盒無影響。結(jié)論Axceed 260磁微粒全自動化學發(fā)光免疫分析儀檢測糖類抗原CA50的主要分析性能與廠家聲明一致，適用于臨床檢測需求。

化學發(fā)光免疫分析；磁微粒；糖類抗原50(CA50)；性能評價

Axceed 260全自動磁微?；瘜W發(fā)光免疫分析儀是本院檢驗科新引進的用于傳染病、腫瘤標志物、肝纖維化等多種檢測項目的分析系統(tǒng)。磁微粒化學發(fā)光免疫分析技術(magnetic particles chemiluminescence immunoassay，MCLIA)原理是用磁微粒作為分離固相，孵育反應過程后，在施加磁場的作用力下，通過洗滌將沒有結(jié)合的游離蛋白與免疫夾心復合物分離，以酶催化化學發(fā)光體系作為檢測體系，實現(xiàn)對待測抗原的測定[1]。該檢測方法廣泛的應用血清學檢測以及食品中雞蛋卵清蛋白含量的檢測。

參照美國《臨床實驗室改進法規(guī)修正案》（CLIA'88）的要求，臨床實驗室應評估新引入的檢驗儀器和檢驗項目等檢測系統(tǒng)的基本性能，與實驗室的檢測標準進行比對或與制造商所聲明的性能對比，以驗證該檢測分析系統(tǒng)是否達到臨床檢測的要求。本文根據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）標準指南EP15-A2[2]、EP5-A2[3]、EP28-A3c[4]、EP6-A[5]、EP7-A2[6]從正確度、精密度、線性范圍、參考區(qū)間等方面對Axceed 260檢測CA50項目進行了性能評價?，F(xiàn)在將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑儀器Axceed 260磁微粒全自動化學發(fā)光免疫分析儀，來自博奧賽斯（天津）生物科技有限公司。

試劑儀器配套原裝試劑CA50試劑盒（批號130327001）、高值質(zhì)控品QcH(批號13032772-01)、低值質(zhì)控品QcL(批號13032772-02)。伯樂質(zhì)控購于伯樂公司（批號54600）。

樣本來源收集樣本來自2015年11-12月萍鄉(xiāng)市中醫(yī)院檢驗科體檢者，溶血、黃疸、脂血等標本剔除?？崭轨o脈血采集后，分離出血清立即用于分析，或于4℃冰箱中保存(24h以內(nèi))，長期(24h以上)存放應保存在-20℃以下，并避免反復凍融。

1.2 方法

1.2.1 儀器校準和室內(nèi)質(zhì)控每天對儀器進行維護保養(yǎng)和常規(guī)質(zhì)控，每次實驗時測定2個濃度水平的室內(nèi)質(zhì)控，質(zhì)控在控條件下，實驗數(shù)據(jù)方可接受。

1.2.2 精密度驗證取博奧賽斯原裝CA50項目的試劑，每天取低和高兩個濃度的樣本，在同一實驗批次內(nèi)進行3次重復測定，連續(xù)測定5d。每天靜置復融時間一致。按EP15-A2文件進行實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理，計算批內(nèi)不精密度（Sr）和實驗室不精密度（Sl），以判斷是否符合（不大于）說明書標注的不精密度水平，不符合時需進一步計算驗證值并與Sr，Sl之比較。

1.2.3 正確度驗證選擇兩個濃度水平的伯樂質(zhì)控，分裝5支，實驗室回溫30min，上下顛倒各一次混合均勻。與精密度評價試驗同一實驗批內(nèi)，重復測定2次，連續(xù)進行5d。記錄數(shù)據(jù)并按照EP15-A2文件中公式計算驗證區(qū)間，如果計算的驗證區(qū)間包含參考物定值，則通過正確度驗證。

1.2.4 線性測量范圍驗證參照EP6-A2標準指南，設定臨床實驗室對CA50項目可接受的允許誤差范圍為5.0%，重復性可接受范圍不得大于5.0%。選取接近廠商標明線性范圍的上限和下限的高值樣本（H）和低值樣本（L），而后按照L、0.8L+ 0.2H、0.6L+0.4H、0.4L+0.6H、0.2L+0.8H、H配制成6組梯度樣本，上述6組試驗樣品在檢測系統(tǒng)中按隨機順序進行測定，每組樣品測試兩次。計算重復性（SDr）并在其符合設定要求的條件下，利用統(tǒng)計學軟件進行多項式回歸分析。將數(shù)據(jù)分別擬合為一次（Y=b0+b1X），二次（Y=b0+b1X+b2X2）和三次多項式（Y=b0+b1X+b2X2+b3X3），根據(jù)t檢驗判斷非線性多項式（二次或三次）擬合數(shù)據(jù)是否比線性（一次）具有統(tǒng)計學意義，如果無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），則認為以上6組梯度濃度的檢測范圍成線性。否則該組數(shù)據(jù)存在非線性關系，需要計算線性偏差來進一步評價非線性度。

1.2.5 參考區(qū)間驗證依照CLSI EP28-A3c[5]標準指南，選取健康體檢者，年齡分布在18~70歲男性和女性血清標本各20例，按照檢測系統(tǒng)常規(guī)的操作程序進行檢測。判別標準：需要驗證的參考區(qū)間是否包含隨機選取的40例健康體檢者測定值，若40例健康體檢者測定值落在參考區(qū)間外的值不多于4個（R≥90%，R=落在參考區(qū)間例數(shù)/實驗總例數(shù)），則表明本實驗室可以直接利用制造商提供的參考區(qū)間。

1.2.6 攜帶污染率根據(jù)EP10-A2[7]推薦方法，選取高低值樣本（H、L），將高值樣本和低值樣本分別連續(xù)測定3次（H1、H2、H3、L1、L2、L3），攜帶污染率計算公式為[(L1－L3)/(H3－L3)]×100%，其計算值小于0.5%為通過攜帶污染率的驗證。

1.2.7 干擾實驗

1.2.7.1 配對差異實驗基礎樣本：依據(jù)EP7-A2，CA50選擇20U/ml和100U/ml兩個濃度的新鮮血清（無溶血、黃疸、和脂血）作為基礎樣本，重復測試10次，得到均值和批內(nèi)標準差(s)。選用3種常用的干擾物質(zhì)：膽紅素、血紅蛋白、甘油三酯。配制20倍濃儲液（膽紅素：4mg/ml；血紅蛋白：100mg/ml；甘油三酯：200mg/ml），膽紅素用二甲亞砜溶解，血紅蛋白用工藝用水溶解，甘油三酯用乙醇溶解作為貯存液和相對應的溶劑作為空白液。用基礎樣本稀釋空白液作為對照樣本（T），分別稀釋3種干擾物的貯存液作為測試樣本（C），稀釋后測試樣本中膽紅素、血紅蛋白、甘油三酯的濃度分別是0.2mg/ ml；5mg/ml；10mg/ml。干擾物的添加量為樣本中可能出現(xiàn)的最高濃度。

1.2.7.2 重測次數(shù)n的確定（95%置信區(qū)間）首先計算最大允許干擾值與批內(nèi)標準差比值（dmax/s），查表1得出CA50兩個濃度水平進行干擾物評價試驗需要的重測次數(shù)(n)。本實驗室設定CA50的臨床可接受最大允許干擾值dmax為12.5%。

1.2.7.3 檢測要求按照此順序（C1T1C2T2C3T3C4T4C5T5…）交替檢測測試樣本（T）和對照樣本（C）。如果檢測系統(tǒng)受攜帶污染影響，可以按照在兩次連續(xù)重復測定之間增加額外的樣本（C1T1CXTXC2T2CXTXC3T3CXTXC4T4CXTXC5T5…）使檢測系統(tǒng)免受來自測試樣本攜帶污染的影響，試驗結(jié)束后應舍棄增加的額外對照樣本結(jié)果。

1.2.7.4 點估計將所獲得數(shù)據(jù)進行干擾效應的“點估計”，即dobs（dobs=X檢測-X對照）（測試樣本均值和對照樣本均值之間的差值），與臨界值dc比較。如果點估計dobs≥dc，說明存在干擾。則需要進行干擾計量效應實驗。如果dobs＜dc，說明沒有干擾，則不需要進行干擾計量效應實驗。

1.2.8 交叉反應臨床上對CA50有干擾作用的交叉反應物為糖類抗原15-3（CA15-3）和糖類抗原125（CA125）[8]。用CA50項目的試劑盒檢測200U/ mL的糖類抗原15-3（CA15-3），500U/ml的糖類抗原125（CA125）樣品，其測得結(jié)果是否超出CA50檢測項目的檢測限低值，如果未超過檢測限低值，則表明沒有交叉反應。

表1 dmax/s與重測次數(shù)對應表

2 結(jié)果

2.1 精密度試驗驗證CA50測定的不精密度見表2，兩個水平濃度的不精密度均小于廠商聲明的不精密度（廠商聲明CA50濃度在5.0~200U/ml范圍內(nèi)批內(nèi)不精密度（CV%）應不高于8.0%；總不精密度（CV%）應不高于15.0%）。

表2 CA50測定的不精密度

2.2 正確度驗證結(jié)果兩水平濃度的有值參考物在5d測定的均值以及按EP15-A2公式計算各均值的驗證區(qū)間，兩水平濃度的有值參考物其定值均包含在驗證區(qū)間內(nèi)。見表3。

2.3 線性驗證結(jié)果CA50線性范圍和6組梯度標本測定結(jié)果均值經(jīng)計算重復檢測方差（SDr）為1.7%，小于實驗室設定允許范圍5%。SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行多項式回歸分析，CA50項目指標b2、 b3與0比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），驗證的檢測范圍成線性，CA50線性方程為Y=1.0189X－1.0316，R2=0.9998（P＜0.05）。該項目的試驗線性范圍與廠家聲明的線性范圍一致，通過線性驗證。見表4、圖1。

表3 正確度驗證結(jié)果(U/ml)

表4 CA50線性統(tǒng)計結(jié)果(U/ml)

圖1 CA50的線性分析圖

2.4 參考區(qū)間驗證在本實驗室中共檢測40例健康體檢者標本，40例標本測值結(jié)果均在廠家提供的參考區(qū)間之內(nèi)，R=100%＞90%。

2.5 攜帶污染試驗結(jié)果攜帶污染率試驗結(jié)果得到的污染率是0.42%，攜帶污染率小于0.5%為合格。見表5。

表5 攜帶污染試驗結(jié)果(U/ml)

2.6 干擾篩選實驗結(jié)果

2.6.1 重測次數(shù)的確定20U/ml基礎樣本重復10次測定CA50的均值為19.96U/ml、dmax為2.5、s為0.77；100U/ ml基礎樣本重復測定10次的均值為101.07U/ml、dmax為12.63、s為3.13。CA50兩個濃度水平的dmax/s均＞3。查表1可知，CA50兩個濃度水平重測次數(shù)為3次。

2.6.2 干擾效應結(jié)果膽紅素水平為0.2mg/ml時，利用全自動化學發(fā)光分析儀檢測CA50，低濃度CA50的dobs和dc分別為－0.59和0.87（－dobs＜dc），高濃度CA50的dobs和dc分別為－1.76和3.54（－dobs＜dc），表明0.2mg/ml的膽紅素水平對檢測無干擾。5mg/ml血紅蛋白水平時，低濃度CA50的dobs和dc分別為－0.75和0.87（－dobs＜dc），高濃度CA50的dobs和dc分別為－2.34和3.54（－dobs＜dc），表明5mg/ml血紅蛋白水平對檢測無干擾。10mg/ml甘油三酯水平時，低濃度CA50的dobs和dc分別為0.12和0.87（dobs＜dc），高濃度CA50的dobs和dc分別為－2.69和3.54（－dobs＜dc），表明10mg/ml甘油三酯水平對檢測無干擾。

2.6.2 交叉反應檢測200U/ml的糖類抗原15-3（CA15-3），500U/ml的糖類抗原125（CA125），其實測濃度值分別為0.29、0.32U/ml，均未高于檢測低限0.32U/ml，表明對CA50檢測結(jié)果無明顯交叉反應。

3 討論

惡性腫瘤嚴重威脅著人類健康，CA50是一種以唾液酸酯和唾液酸糖蛋白為主的廣譜腫瘤相關抗原[9]，臨床廣泛應用于惡性腫瘤的篩查、診斷及預后評估[10]。因此，血清中CA50檢測對惡性腫瘤的診斷鑒別診斷具有重要意義[11]。為滿足臨床需要，本科室引進博奧賽斯（天津）生物科技有限公司Axceed 260全自動磁微粒化學發(fā)光法分析儀，此儀器說明書中提供的性能指標都是廠商在最佳條件下得到的參數(shù)，是通過其封閉檢測系統(tǒng)來完成對CA50項目的檢測，這與本實驗室的的水質(zhì)、實驗操作條件、人員操作習慣等實際外部條件存在差異。因此，本實驗室通過對腫瘤標志物CA50測定的性能分析，對該儀器的檢測性能進行評價。

磁微?；瘜W發(fā)光技術的自動化程度高[12，13]，減少了手工操作帶來的人為誤差。Axceed 260擁有30個冷藏試劑倉位、60個樣本位、90個恒溫反應位，檢測速度可以達到每小時150管，無論是單個樣本還是大量樣本都可以進行快速檢測，適用門診和急診，該方法在免疫分析中具有較好的應用前景，部分檢測項目在逐步開展中[14，15]。

精密度反映分析過程中隨機誤差的大小。既是臨床檢驗的方法評價，也是儀器性能評價的重要指標之一。美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）關于精密度評價有EP5-A2及EP15-A2兩個指南文件。EP5-A2文件適用于制造商建立新開發(fā)方法的精密度性能，EP15-A2則適用于臨床實驗室用最簡單的方法對廠商提供的精密度性能的有效性進行確認。實驗結(jié)果表明，本研究中Axceed 260檢測CA50項目20U/ml和100U/ml低高兩水平濃度的批內(nèi)精密度CV分別為4.95%和3.45%，實驗室內(nèi)精密度的CV分別為4.64%和3.35%，均遠小于說明書聲明的批內(nèi)精密度和實驗室內(nèi)精密度的要求8%和15%，顯示Axceed 260檢測CA50的精密度良好。按照CLSI的標準指南文件EP15-A2對CA50項目進行驗證得到的批內(nèi)精密度和實驗室內(nèi)精密度都與廠家聲明的一致。

本實驗室利用伯樂公司的標準質(zhì)控品進行正確度的驗證，符合EP15-A2標準指南對正確度評估的要求。本實驗室的檢測結(jié)果以及計算的驗證區(qū)間包含有值參考物的定值，兩個濃度水平的定值參考物均包含在驗證區(qū)間內(nèi)，順利通過正確度驗證，表明Axceed 260正確度性能符合臨床檢驗要求。

線性范圍驗證實驗所得到的結(jié)果呈良好的線性趨勢。根據(jù)廠家提供的說明書，Axceed 260檢測CA50項目的測量線性范圍為5~200U/ml。本實驗室檢測CA50項目的在5.12~197.37U/ml濃度范圍內(nèi)的平均6組濃度水平呈良好的線性關系。研究驗證的CA50檢測項目的線性范圍與廠家聲明的基本一致。

本研究按照CLSI EP28-A3c標準指南，對CA50項目的生物參考區(qū)間進行驗證。結(jié)果推薦的參考區(qū)間包括所有檢測CA50項目的40例健康人群檢測數(shù)據(jù)，符合標準指南的要求。故可以直接引用廠商提供的參考區(qū)間作為CA50檢測項目的參考區(qū)間。檢測系統(tǒng)的參考區(qū)間是制造商收集所在地區(qū)的人群進行統(tǒng)計得到的結(jié)果，其生活方式和飲食習慣等各類原因都存在著一定的地域的差別，可能會導致參考區(qū)間的不同。國產(chǎn)儀器制造商篩選適用人群統(tǒng)計的參考區(qū)間相對于進口儀器可能更加適合于本國內(nèi)人群的使用。

攜帶污染是指檢測結(jié)果可能受到其他標本的污染。Axceed 260在加入標本和試劑前會自動沖洗加樣針，且標本檢測時，一個項目一個獨立的反應管，這將會極大限度降低樣本間的攜帶污染率。本次驗證的CA50項目污染攜帶率與廠家聲明的一致，見表5，檢測結(jié)果準確可靠。

干擾驗證實驗按照EP7-A2干擾篩選的方法評估臨床實驗室的主要干擾物（膽紅素、血紅蛋白、甘油三酯）。結(jié)果表明，Axceed 260的CA50試劑聲明的膽紅素（0.2mg/ml）、血紅蛋白（5mg/ml）、甘油三酯（10mg/ml）對CA50檢測結(jié)果無影響。與200U/ml CA153、500U/ml CA125沒有交叉反應。

綜上，Axceed 260磁微粒全自動化學發(fā)光分析儀檢測CA50項目的方法學性能良好，能夠為臨床患者樣本的檢測提供準確可靠的檢驗結(jié)果，滿足臨床檢測的性能要求。

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Performance of verification of Axceed 260(MCLIA)in detecting Carbohydrate antigen 50 in human serum

LIU Xiaop-ing1，LIN Jiakun1，WEN Yuehui1，QI Xunjie1，LIU Ping2，TIAN Yunxia2，DING Jun3△.1.Clinical Laboratory，Hospital of Traditional Chinese Medicine of Pingxiang，Pingxiang Jiangxi 337000，China；2.Bioscience(Tianjin)DiagnosticTechnology，Tianjin 300300，China；3.Center for Medical Device Evaluation.Tianjin 300191，China

Objective To verfiy the analytical performance of the full-automatic magnetic particles chemiluminescence immunoassay(MCLIA)system in the Axceed 260 analyzer for detecting Carbohydrate antigen 50(CA50).Methods The precision，accuracy，linear range，reference intervals and interference of MCLIA system in the detection of CA50 were evaluated according to the Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)evaluation protocols including EP15-A2，EP28-A3c，EP6-A and EP7-A2 documents.Results The within-run precision and between-run precision experiment CV of CA50 were both less than 5%.The linear range was consistent with manufacturer’s claim.Verification interval including the assigned value of reference materials and reference intervals were suitable for the local crowd.There was no cross reactivity with a high concentration of Cancer Antigen15-3(CA15-3)and Cancer Antigen 125(CA125).No interferences were detected from bilirubin(0.2mg/ml)，hemoglobin(5mg/ml)and triglycerides(10mg/ml).Conclusion The main analytical performance of the Axceed 260 analyzer in the detection of CA50 is consistent with manufacturer’s claim，which could be used for clinical laboratory routine testing.

Chemiluminescence immunoassay；Magnetic particle；Carbohydrate antigen 50；Performance evaluation

R446.62

A

1674-1129(2017)01-0009-05

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.01.003

2016-08-26；

2016-11-30)

國家國際科技合作專項(2015DFA30420)。

劉小萍，1967年生，女，副主任技師，學士，主要從事臨床檢驗工作。

丁軍，主任。