石 巖，秦 巖，宋 磊，梁月勉，王小磊，韓貴良

(1.河北大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河北保定 071000 ；2.河北省放化療機(jī)制與規(guī)程研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室河北保定 071000；3.河北大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保，河北保定 071000；4.河北大學(xué)附屬醫(yī)院中西醫(yī)腫瘤科，河北保定 071000； 5.河北大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，河北保定 071000)

論著·臨床研究

miR-630對三陰性乳腺癌細(xì)胞侵襲的影響及其機(jī)制研究

石 巖1，2，秦 巖3△，宋 磊4，梁月勉5，王小磊1，韓貴良1

(1.河北大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河北保定 071000 ；2.河北省放化療機(jī)制與規(guī)程研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室河北保定 071000；3.河北大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保，河北保定 071000；4.河北大學(xué)附屬醫(yī)院中西醫(yī)腫瘤科，河北保定 071000； 5.河北大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，河北保定 071000)

目的 研究miR-630在人體三陰性乳腺癌組織中的表達(dá)情況，探討miR-630是否通過下調(diào)Sox4影響三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲。方法 收集157例行乳腺癌根治術(shù)患者癌組織標(biāo)本及癌旁正常乳腺組織，其中三陰性乳腺癌36例，通過實(shí)時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測各組(正常乳腺組、非三陰性乳腺癌組、三陰性乳腺癌組)組織中與乳腺癌相關(guān)的miR-630、miR-21、miR-195、miR-134、miR-200a、miR-381、miR-1228的表達(dá)情況；蛋白免疫印跡試驗(yàn)(Western blot)檢測3組標(biāo)本中細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白COL1A1、COL1A5、MMP-2、MMP-9的表達(dá)情況；進(jìn)一步在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，通過轉(zhuǎn)染miR-630 mimic或空質(zhì)粒后，再轉(zhuǎn)染過表達(dá)Sox4的質(zhì)?；蚩召|(zhì)粒至離體培養(yǎng)的細(xì)胞中，Western blot檢測細(xì)胞中 COL1A1、COL1A5、MMP-2、MMP-9、Sox4的表達(dá)情況，劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell法觀察細(xì)胞遷移侵襲情況，利用熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Sox4是miR-630的靶基因。結(jié)果 相比于正常乳腺組，miR-630、miR-21在三陰性乳腺癌組織中的表達(dá)降低(P<0.01)； miR-195、miR-134、miR-200a、miR-381、miR-1228的表達(dá)在3組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；相比于正常乳腺組及非三陰性乳腺癌組，三陰性乳腺癌組織中COL1A1、COL1A5、MMP-2、MMP-9、Sox4的表達(dá)增多(P<0.05)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，相比于空質(zhì)粒組，轉(zhuǎn)染miR-630 mimic后，MDA-MB-231細(xì)胞中COL1A1、COL1A5、MMP-2、MMP-9、Sox4的表達(dá)減少(P<0.05)，MDA-MB-231細(xì)胞的遷移侵襲能力減弱(P<0.01)；熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-630能夠顯著降低 Sox4-3′-UTR 質(zhì)粒的熒光素活性(P<0.05)；相比于過表達(dá)miR-630+空質(zhì)粒組，轉(zhuǎn)染過表達(dá)miR-630+過表達(dá)Sox4組，MDA-MB-231細(xì)胞中COL1A1、COL1A5、MMP-2和MMP-9表達(dá)增加(P<0.05)，細(xì)胞的遷移侵襲能力增強(qiáng)(P<0.01)。結(jié)論 在三陰性乳腺癌組織中，miR-630低表達(dá)；miR-630可以通過下調(diào)Sox4從而抑制MDA-MB-231的遷移和侵襲。

三陰性乳腺癌;微RNA630;Sox4;腫瘤浸潤

微小RNA(micro RNA,miRNA)在腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲中具有重要的調(diào)控作用[1]，其中乳腺癌領(lǐng)域熱門的包括miR-630、miR-21、miR-195、miR-134、miR-200a、miR-381、miR-1228。Zhang等[2]的研究發(fā)現(xiàn)miR-21在乳腺癌組織中表達(dá)增加，并可以通過下調(diào)STAT3從而參與乳腺癌的進(jìn)展。O′Brien等[3]通過檢測乳癌患者血清中miR-134的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR-134在乳腺癌患者血清中升高，并具有較好的敏感性和特異性，提示miR-134可作為乳腺癌診斷的一個指標(biāo)[3]。最近國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)miR-138和miR-200a都可以抑制乳腺癌細(xì)胞中Cx-43的表達(dá)。miR-630已被證實(shí)是一種抑癌miRNAs，可調(diào)節(jié)多種與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、侵襲有關(guān)的抑癌基因或蛋白，從而發(fā)揮抑制腫瘤進(jìn)展的作用[4]。但是目前為止這7種miRNAs在乳腺癌領(lǐng)域的研究都局限于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)或人體非三陰性乳腺癌組織，在人體三陰性乳腺癌組織中的表達(dá)情況及作用尚未闡明。

Sox4基因(SRY related high-mobile group box4)屬于Sox基因家族中的C亞族，其編碼的蛋白質(zhì)通過高遷移率組蛋白(HMG)盒(high-mobility group DNA binding domain)與DNA結(jié)合，從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄活化或抑制，與干細(xì)胞的分化密切相關(guān)[5]。Sox4已被證實(shí)參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，具有癌基因和抑癌基因雙向調(diào)節(jié)功能[6]。最近的研究顯示，抑制Sox4的表達(dá)可以抑制食管癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞等的增殖和侵襲[7]。本研究擬通過用miR-630干預(yù)三陰性乳腺癌細(xì)胞，探索miR-630是否是通過下調(diào)Sox4發(fā)揮對乳腺癌細(xì)胞遷移侵襲的抑制作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2010-2014年河北大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科157例行乳腺癌根治術(shù)患者癌組織標(biāo)本及癌旁正常乳腺組織，年齡35～71 歲，平均(53.0±8.6)歲，樣品采集后立即在液氮中保存。所有患者術(shù)前均未行任何放、化療。術(shù)后病理診斷三陰性乳腺癌36例，非三陰性乳腺癌患者121例。本研究中患者均簽署知情同意書，并由河北大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231(上海拜力生物公司)；DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶(Sigma公司)；胎牛血清(Gibco公司)；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶，RNA提取試劑(Invitrogen公司)；Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物公司)；SYBR Green熒光染料試劑盒(Roche公司)；無內(nèi)毒素質(zhì)粒小、大提取試劑盒，兔或鼠抗人COL1A1、COL1A5、MMP-2、MMP-9、Sox4、β-actin、GAPDH多克隆抗體(Abcam公司)；脂質(zhì)體2000(上海英駿公司)；4′6-二咪基-2-苯基口吸染色(DAPI，Rcohe 公司)；噻唑藍(lán)(MTT，Emresco公司)；辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔或者抗鼠二抗、FITC標(biāo)記的山羊抗兔IGg(Jackson公司)；Western bolt相關(guān)試劑(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 手術(shù)取下的組織根據(jù)病理結(jié)果分為正常乳腺組(n=70)、非三陰性乳腺癌組(n=121)、三陰性乳腺癌組(n=36)；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，在miR-630 mimic轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后，將細(xì)胞分為空白對照組、過表達(dá)miR-630組和空質(zhì)粒組3組；最后在用過表達(dá)Sox4的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后，將細(xì)胞分為過表達(dá)miR-630組、過表達(dá)miR-630+過表達(dá)Sox4組、過表達(dá)miR-630+空質(zhì)粒組。

1.3.2 熒光定量RT-PCR檢測基因表達(dá) 提取組織或細(xì)胞中總RNA，將提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為：16 ℃ 30 min，45 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。運(yùn)用SYBR Green法檢測miR-630、miR-21、miR-195、miR-134 、miR-200a、miR-381、miR-1228的表達(dá)情況，運(yùn)用的反應(yīng)條件為： 94 ℃ 15 min；94 ℃ 30 s；60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共循環(huán)40次；最后72 ℃延伸8 min。每組樣品重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計分析各標(biāo)本中miR-630、miR-21、miR-195、miR-134、miR-200a、miR-381、miR-1228的表達(dá)。

1.3.3 Western blot檢測蛋白表達(dá)量 提取組織或細(xì)胞中總蛋白，BCA法定量蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膠每孔加入30 μL的樣品，70 V 30 min進(jìn)行蛋白濃縮，100 V 2 h進(jìn)行蛋白電泳，并用孔徑0.45 μm的聚偏氧乙烯(PVDF)膜250 mA 90 min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后常溫下TBST洗膜3次、封閉1 h后，以1∶1 000濃度加入兔(鼠)抗人一抗(抗COL1A1、COL1A5、MMP-2、MMP-9、Sox4、β-actin、GAPDH一抗)，4 ℃孵育過夜，常溫下TBST洗膜3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔(鼠)二抗孵育后ECL化學(xué)發(fā)光法檢測?？逻_(dá)膠片暗室顯影，Quantity one軟件分析。

1.3.4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞株 過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：miR-630 mimic由上海吉瑪公司設(shè)計合成，miR-630-mimic序列為，上游引物：5′-AGU AUU CUG UAC CAG GGA AGG U-3′，下游引物：3′-AC CUU CCC UGG UAC AGA AUA CU-5′[8]。Sox4過表達(dá)質(zhì)粒由上海吉瑪公司設(shè)計合成，通過Pubmed查找Sox4基因的序列，引物根據(jù)Genebank中Sox4 mRNA序列設(shè)計引物。其 上 游 引 物： 5′-CTT GAC ATG ATT AGC TGG CAT GATT -3′；下游引物：5′-CCT GTG CAA TAT GCC GTG TAG A-3′。Sox4基因和質(zhì)粒DNA連接后，篩選重組質(zhì)粒，測序驗(yàn)證。轉(zhuǎn)染：將MDA-MB-231細(xì)胞系接種至6孔板，生長至50%～70%密度時，以脂質(zhì)體2000分別轉(zhuǎn)染miR-630 mimic或?qū)?yīng)的空質(zhì)粒(mimic-對照)；Sox4過表達(dá)質(zhì)?；蚩召|(zhì)粒，各100 pmol，24 h后，提取總RNA/蛋白后，PCR/Western blot鑒定轉(zhuǎn)染效率，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)測MDA-MB-231細(xì)胞遷移 MDA-MB-231細(xì)胞先用1.8 mmol/L羥基脲作用12 h以抑制細(xì)胞增殖，100 μL槍頭垂直孔板制造細(xì)胞劃痕，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS沖洗孔板3次。培養(yǎng)細(xì)胞，拍照記錄0、12、24、48、72 h圖片，用Image pro plus6.0軟件分析計算細(xì)胞遷移面積，以遷移面積和原劃痕面積比值表示各組MDA-MB-231相對遷移面積的多少。

1.3.6 Transwell法檢測細(xì)胞侵襲 MDA-MB-231細(xì)胞先用血清饑餓使細(xì)胞同步化，1.8 mmol /L 羥基脲作用 12 h用以抑制細(xì)胞增殖，用0.25%胰蛋白酶消化MDA-MB-231細(xì)胞后，用 DMEM培養(yǎng)基(1%血清)配成細(xì)胞懸液并計數(shù)(5×104個/mL)。各組24孔板配套Transwell小室(0.8 μm)上室加入200 μL的細(xì)胞懸液，下室加入含有10%FBS的培養(yǎng)液500 μL，分別培養(yǎng)4、8、12、24、48 h。以棉簽擦去上層未穿透膜的MDA-MB-231細(xì)胞，取下Transwell半透膜，PBS洗3次，用3.7%多聚甲醛室溫固定5 min，再PBS清洗3次，用2 μg/mL的6DAPI染核，PBS清洗3次，熒光顯微鏡每組取5個視野觀察計數(shù)并記錄穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.3.7 熒光素酶實(shí)驗(yàn) 設(shè)計合成Sox4-3′-UTR的序列及突變序列，以Sox4質(zhì)粒為載體，分別構(gòu)建能夠表達(dá)熒光素酶的包含Sox4-3′-UTR和Sox4-3′-UTR突變序列的質(zhì)粒，然后將MDA-MB-231細(xì)胞系按每孔1×105個接種至24孔板，24 h后以脂質(zhì)體2000共轉(zhuǎn)染200 ng 包含Sox4-3′-UTR或Sox4-3′-UTR突變序列的熒光素酶質(zhì)粒和80 ng 海腎熒光質(zhì)粒及60 pmol miR-630-mimic或?qū)φ眨?8 h后用熒光檢測儀檢測熒光強(qiáng)度，海腎熒光作為內(nèi)參照，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌相關(guān)的miRs和蛋白質(zhì)在三陰性乳腺癌組織、非三陰性乳腺癌組織和正常乳腺組織中的表達(dá) 實(shí)時熒光定量PCR檢測3組中miR-630、miR-21、miR-195、miR-134、miR-200a、miR-381、miR-1228的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比對正常乳腺組，三陰性乳腺癌組、非三陰性乳腺癌組織中 miR-630的表達(dá)降低(P<0.05)；相比于非三陰性乳腺癌組，三陰性乳腺癌組中miR-630、miR-21的表達(dá)減少(P<0.01)。miR-195、miR-134、miR-200a、miR-381、miR-1228的表達(dá)量在兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Western blot檢測結(jié)果顯示，相比于正常乳腺癌組織，非三陰性乳腺癌組中COL1A1、COL1A5、Sox4的表達(dá)增加(P<0.01)；三陰性乳腺癌組中COL1A1、COL1A5、MMP-2、MMP-9、Sox4表達(dá)增多(P<0.01)。相比于非三陰性乳腺癌組，三陰性乳腺癌組中COL1A1、COL1A5、MMP-2、MMP、9、Sox4表達(dá)增多(P<0.01)。見圖1。

A：7個基因RNA分析圖；B：Sox4 mRNA電泳圖；C：各蛋白Western blot圖；D：各蛋白表達(dá)分析圖；a：P<0.01,與正常乳腺組比較；b：P<0.01,與非三陰性乳腺癌組比較。

圖1 各組乳腺組織中乳腺癌相關(guān)的miRs

和細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

2.2 miR-630對MDA-MB-231細(xì)胞侵襲遷移的影響 miR-630 mimic轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后，實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-630組中miR-630的表達(dá)較對照組和空質(zhì)粒組明顯升高(P<0.01)，圖2A。miR-630 mimic轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后，相比于對照組和空質(zhì)粒組，過表達(dá)miR-630組中MDA-MB-231的遷移減弱(P<0.01)，圖2B；侵襲能力降低(P<0.01)，圖2C。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，相比于對照組和空質(zhì)粒組，過表達(dá)miR-630組MDA-MB-231細(xì)胞中COL1A1、COL1A5、MMP-2、MMP-9細(xì)胞侵襲遷移相關(guān)蛋白表達(dá)減少(P<0.01，圖2D、E)。

2.3 miR-630通過識別3′-UTR抑制Sox4的表達(dá) 分別構(gòu)建包含Sox4-3′-UTR和其突變序列的熒光素酶質(zhì)粒(圖3A)，與miR-630 mimic或者空質(zhì)粒對照共轉(zhuǎn)MDA-MB-231細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，檢測各組細(xì)胞熒光素酶活性。結(jié)果顯示，miR-630 mimic+WT-Sox4-3′-UTR組熒光素酶活性顯著低于空質(zhì)粒+WT-Sox4-3′-UTR組(P<0.01)，見圖3B。Western blot檢測結(jié)果顯示，相比于對照組和空質(zhì)粒組，miR-630組MDA-MB-231細(xì)胞中Sox4的表達(dá)明顯降低(P<0.01)，見圖3C。

A：各組細(xì)胞中miR-630的相對表達(dá)分析圖；B：干預(yù)48 h后各組細(xì)胞的遷移能力分析；C：干預(yù)24 h后各組細(xì)胞侵襲能力分析；D：各組細(xì)胞中腫瘤侵襲相關(guān)蛋白Western blot圖；E：Western blot分析圖。a：P<0.05,b：P<0.01,與空質(zhì)粒組，對照組比較。

圖2 miR-630抑制MDA-MB-231

細(xì)胞的侵襲和遷移

A：miR-630與Sox4序列作用圖；B：熒光酶素分析圖；C：各組Sox4 Western blot圖；D:Western blot分析圖。a：P<0.01,與空質(zhì)粒組比較。

圖3 miR-MDA-MB-231通過識別3′-UTR抑制Sox4的表達(dá)

2.4 過表達(dá)Sox4可以逆轉(zhuǎn)miR-630抑制MDA-MB-231細(xì)胞侵襲的作用 過表達(dá)Sox4的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后(Sox4組)，相比于空質(zhì)粒組，Sox4組MDA-MB-231細(xì)胞中Sox4的表達(dá)增加(P<0.01)，見圖4A；Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，相比于過表達(dá)miR-630組和過表達(dá)miR-630+空質(zhì)粒組，過表達(dá)miR-630+過表達(dá)Sox4組MDA-MB-231細(xì)胞中COL1A1、COL1A5、MMP-2、MMP-9細(xì)胞侵襲遷移相關(guān)蛋白表達(dá)增加(P<0.01，圖4C、D)。相比于過表達(dá)miR-630組和過表達(dá)miR-630+空質(zhì)粒組，過表達(dá)miR-630+過表達(dá)Sox4組中MDA-MB-231的遷移增加(P<0.01)，見圖5。

A：轉(zhuǎn)染Sox4過表達(dá)質(zhì)粒后，MDA-MB-231中Sox4表達(dá)增強(qiáng)；B：各組細(xì)胞中腫瘤侵襲相關(guān)蛋白Western blot圖；C：Western blot分析圖。a：P<0.05;b：P<0.01,與miR-630+空質(zhì)粒組，miR-630組比較。

圖4 過表達(dá)Sox4增加MDA-MB-231細(xì)胞

的侵襲和遷移

圖5 干預(yù)48 h后各組細(xì)胞的遷移能力分析

3 討 論

侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本生物學(xué)特征，不僅與腫瘤細(xì)胞的侵襲性增強(qiáng)、黏附能力下降有關(guān)，還與腫瘤的血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)的降解及間質(zhì)重構(gòu)等密切相關(guān)[8-9]。因此，抑制腫瘤細(xì)胞侵襲遷移對臨床治療腫瘤有重要意義。

miRNAs是一類進(jìn)化上高度保守的非編碼小分子單鏈RNA，越來越多的證據(jù)顯示miRNAs參與了對腫瘤細(xì)胞遷移侵襲和細(xì)胞表型的調(diào)控。miR-630是一種抑癌miRNAs，可調(diào)節(jié)多種與腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)有關(guān)的抑癌基因或蛋白，從而調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Shu等[10]通過檢測236例未行放化療的胃癌患者胃癌組織和癌旁正常胃組織中miR-630的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR-630在胃癌組織中表達(dá)降低，并進(jìn)一步通過對這些病例的隨訪發(fā)現(xiàn)miR-630的表達(dá)與胃癌患者的預(yù)后相關(guān)。最近的研究又發(fā)現(xiàn)miR-630在結(jié)腸癌和肝癌的發(fā)展中具有重要的作用。另外，Song等[11]的研究發(fā)現(xiàn)miR-630可以通過靶向抑制LMO3從而參與調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞的增殖與惡化；與上述研究結(jié)果相符，筆者通過檢測157例行乳腺癌根治術(shù)患者癌組織標(biāo)本及癌旁正常乳腺組織中7種與乳腺癌相關(guān)的miRNAs的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在三陰性乳腺癌組織中miR-630的表達(dá)明顯降低；在之后的離體實(shí)驗(yàn)中筆者進(jìn)一步證實(shí)miR-630可以抑制與腫瘤細(xì)胞侵襲相關(guān)的蛋白COL1A11、COL1A5、MMP-2、MMP-9的表達(dá)，抑制MDA-MB-231細(xì)胞的遷移侵襲。

Sox4基因?qū)儆赟ox C亞族，主要表達(dá)于胚胎發(fā)育過程中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟和胸腺，此外，Sox4還在干細(xì)胞中高表達(dá)，對干細(xì)胞的穩(wěn)定具有重要作用。因此，Sox4基因的突變、缺失或過表達(dá)不僅會引起先天性疾病的發(fā)生，而且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。過去的研究結(jié)果顯示，在多種腫瘤組織中Sox4基因表達(dá)增加。之后Wang等[12]的研究都發(fā)現(xiàn)Sox基因的表達(dá)與腫瘤患者預(yù)后相關(guān)，Sox4可以作為腫瘤治療的一個靶向位點(diǎn)。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)miR-211可以通過靶向抑制Sox4的表達(dá)從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移；與此同時，Jin等[13]的研究結(jié)果也顯示miR-388可以通過下調(diào)Sox4的表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲。與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，本研究發(fā)現(xiàn)相比于正常乳腺組織，Sox4在乳腺癌組織中的表達(dá)增加。而且，相比于非三陰性乳腺癌組織，三陰性乳腺癌組織中Sox4的表達(dá)進(jìn)一步升高。在用miR-630 mimic干預(yù)MDA-MB-231細(xì)胞后，細(xì)胞中Sox4的表達(dá)減少。之后本研究通過熒光素酶素實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-630可以與Sox4的3′-UTR靶向結(jié)合，從而減少Sox4的表達(dá)。鑒于Sox4在腫瘤細(xì)胞侵襲中的重要性，進(jìn)一步用Sox4過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Sox4過表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染可以逆轉(zhuǎn)miR-630抑制MDA-MB-231侵襲的作用，最終證實(shí)miR-630是通過下調(diào)Sox4的表達(dá)，從而發(fā)揮抑制MDA-MB-231細(xì)胞侵襲的作用。

本實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR檢測正常乳腺組織、非三陰性乳腺癌組織及三陰性乳腺癌組織中miR-630、miR-21、miR-195、miR-134 、miR-200a、miR-381、miR-1228的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR-630在三陰性乳腺癌中表達(dá)減少、Sox4在三陰性乳腺癌組織中表達(dá)增加。之后在離體實(shí)驗(yàn)中證實(shí)miR-630可以抑制MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲遷移，并進(jìn)一步通過螢光素酶和轉(zhuǎn)染過表達(dá)Sox質(zhì)粒的方法證明其機(jī)制是通過靶向抑制Sox4的表達(dá)，為三陰性乳腺癌的治療提供新的思路。

[1]Song JH,Meltzer SJ.MicroRNAs in pathogenesis,diagnosis,and treatment of gastroesophageal cancers[J].Gastroenterology,2012,143(1):35-47.

[2]Zhang C,Liu K,Li T,et al.miR-21:A gene of dual regulation in breast cancer[J].Int J Oncol,2016,48(1):161-172.

[3]O′Brien K,Lowry MC,Corcoran C,et al.miR-134 in extracellular vesicles reduces triple-negative breast cancer aggression and increases drug sensitivity[J].Oncotarget,2015,6(32):32774-32789.

[4]周佽想,王辰龍,于安路,等.miR-630通過靶向MTDH抑制乳腺癌進(jìn)程[J].中國病理生理雜志,2015,(10):1848.

[5]Foronda M,Morgado-Palacin L,Gomez-Lopez G,et al.Profiling of Sox4-dependent transcriptome in skin links tumour suppression and adult stem cell activation[J].Genom Data,2015，6:21-24.

[6]Yoon TM,Kim SA,Cho WS,et al.Sox4 expression is associated with treatment failure and chemoradioresistance in oral squamous cell carcinoma[J].BMC Cancer,2015,15(1):888-891.

[7]Li Y,Zu L,Wang Y,et al.miR-132 inhibits lung cancer cell migration and invasion by targeting Sox4[J].J Thorac Dis,2015,7(9):1563-1569.

[8]LiS,QinX,LiY,etal.MiR-133asuppressesthemigrationandinvasionofesophagealcancercells by targeting the EMT regulator Sox4[J].Am J Transl Res,2015,7(8):1390-1403.

[9]Hanieh H.Aryl hydrocarbon receptor-microRNA-212/132 axis in human breast cancer suppresses metastasis by targeting Sox4[J].Mol Cancer,2015,14:172-182.

[10]Sun R,Jiang B,Qi H,et al.Sox4 contributes to the progression of cervical cancer and the resistance to the chemotherapeutic drug through ABCG2[J].Cell Death Dis,2015,6(1):16-20，37-40.

[11]Song YF,Hong JF,Liu DL,et al.miR-630 targets LMO3 to regulate cell growth and metastasis in lung cancer[J].Am J Transl Res,2015,7(7):1271-1279.

[12]Wang CY,Hua L,Sun J,et al.MiR-211 inhibits cell proliferation and invasion of gastric cancer by down-regulating Sox4[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(11):14013-14020.

[13]Jin Y,Zhao M,Xie Q,et al.MicroRNA-338-3p functions as tumor suppressor in breast cancer by targeting Sox4[J].Int J Oncol,2015,47(4):1594-1602.

MiR-630 inhibits MDA-MB-231 cells migration and invasion by targeting Sox4 in triple-negative breast cancer

ShiYan1，2,QinYan3△,SongLei4,LiangYuemian5,WangXiaolei1,HanGuiliang1

(1.DepartmentofMedicalOncologyAffiliatedHospitalofHebeiUniversity,Baoding,Hebei071000,China;2.KeyLaboratoryforFractionationMechanismsandProceduresofHeibei,Baoding,Hebei071000,China；3.DepartmentofCentralLaboratoryAffiliatedHospitalofHebeiUniversity,Baoding,Hebei071000,China;4.DepartmentofOncologyAffiliatedHospitalofHebeiUniversity,Baoding,Hebei071000,China;5.DepartmentofPathologyAffiliatedHospitalofHebeiUniversity,Baoding,Hebei071000,China)

Objective To verify whether miR-630 could inhibit MDA-MB-231 cells migration and invasion by targeting Sox4 in triple-negative breast cancer(TNBC).Methods Collection normal breast tissue and breast cancer tissue from patients undergoing breast cancer resection.RT-PCR were used to test the expression of miR-630,miR-21,miR-195,miR-134,miR-200a,miR-381 and miR-1228.Western blot were used to test the expression of COL1A1,COL1A5,MMP-2,MMP-9 and Sox4.In vitro experiment,after miR-630 was transfected into MDA-MB-231 cells,wound healing were employed to test the migratory ability of MDA-MB-231 cells,and transwell were used to test the invasion ability of MDA-MB-231 cells.Western blot were used to investigate the expressions of COL1A1,COL1A5,MMP-2,MMP-9 and Sox4 in MDA-MB-231 cell.Luciferase assay was used to confirmed whether Sox4-3′-UTR the target gene of miR-630．Results Compared with normal breast tissue,the expression of miR-630 was decreased(P<0.01),meanwhile the expression of COL1A1,COL1A5,MMP-2,MMP-9 and Sox4 were significantly increased in the triple-negative breast cancer tissue(P<0.01).In the vitro experiment,compared with the control group,the expression of COL1A1,COL1A5,MMP-2,MMP-9 and Sox4 were decreased in the miR-630 group (P<0.05);The migration activity of MDA-MB-231 cells was decreased in the miR-630 group (P<0.01);The Luciferase activity of the Sox4-3′-UTR plasmid was significantly suppressed by miR-630 (P<0.05);Over expression of Sox4 could reverse the effect of miR-630 on MDA-MB-231(P<0.05,P<0.01).Conclusion In triple-negative breast cancer tissue,the expression of miR-630 decreased;miR-630 inhibits triple-negative breast cancer cells migration and invasion by targeting Sox4-3′-UTR.

triple-negative breast cancer;microRNAs-630;sex determining region Y-box 4; neoplasm invasiveness

石巖(1976-)，主任醫(yī)師，碩士，主要從事乳腺癌的臨床診斷和基礎(chǔ)研究?！?/p>

，E-mail:qinyanhbsjzx@sina.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.06.017

R737.9

A

1671-8348(2017)06-0773-04

2016-10-28

2016-11-26)